一種高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，包括：溶膠形成步驟：在常溫下以稀酸為催化劑將正硅酸乙酯(TEOS)水解至形成透明溶膠，并將溶膠中乙醇抽離至質(zhì)量含量≤5％；凝膠形成步驟：在攪拌下向溶膠中依次加入模板溶液和纖維二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，放置生成凝膠。根據(jù)本發(fā)明另一方面公開(kāi)了根據(jù)上述方法制備得到的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料。根據(jù)本發(fā)明方法制備得到的納米介孔材料孔徑約2～7nm，因此具有很高的比表面積；所述納米介孔材料的生物活性高且能重復(fù)利用。
【專利說(shuō)明】一種高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種納米介孔材料及其制備方法，尤其涉及一種高活性固定化纖維二 糖酶納米介孔材料及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 受世界石油供應(yīng)、價(jià)格、環(huán)保和全球氣候變化等因素的影響，可再生潔凈能源一生 物燃料的發(fā)展受到了許多國(guó)家的重視，尤其是美國(guó)、巴西和中國(guó)。生物燃料以燃料乙醇為 主，生物技術(shù)酶法是利用地球上數(shù)量最大的可再生性碳源物質(zhì)纖維素獲得燃料乙醇的重要 步驟之一。然而纖維素的高聚合度使得其難降解，與淀粉相比纖維素的酶解速率要差2個(gè) 數(shù)量級(jí)以上，使纖維素酶的成本過(guò)高，從而嚴(yán)重制約該技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用，為此國(guó)內(nèi)外研宄者 采取許多措施解決此問(wèn)題，如對(duì)纖維素酶進(jìn)行固定，提高其穩(wěn)定性，使其能重復(fù)使用。
[0003] 越來(lái)越多的研宄表明，可操作性與可重復(fù)性固定化纖維素酶能夠極大降低纖維素 酶解工藝成本，這使其成為國(guó)內(nèi)外研宄熱點(diǎn)。載體被認(rèn)為是決定固定化酶效果的關(guān)鍵因素 之一。根據(jù)載體水溶性，可將其分為可溶性載體和不溶性載體兩大類。天然纖維素都是不溶 性載體，許多研宄者最初認(rèn)為只能設(shè)計(jì)可溶性載體固定化纖維素酶才具有活性。但隨著近 年來(lái)不溶性載體的快速發(fā)展，可溶性載體固定纖維素酶的優(yōu)異性不再明顯。將纖維素酶固 定在可溶性載體上，其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)沒(méi)有變化，操作穩(wěn)定性提高也不顯著，反而由于存在不易 回收的致命缺陷，在20世紀(jì)90年代后很快脫離研宄者的視野。不溶性載體主要包括廉價(jià)淀 粉接枝丙烯腈、丙烯酰胺兩親性高分子化合物形成多孔顆粒狀載體和改性的殼聚糖等。不 溶性載體固定化纖維素酶回收極其方便，酶穩(wěn)定性提高也十分明顯，但與底物，尤其是不溶 性底物之間的傳質(zhì)阻力大，因此需要對(duì)不溶性載體進(jìn)行改造使其具有大的比表面積。
[0004] 其中，燃料乙醇主要包括糧食乙醇和纖維素乙醇。在世界糧食短缺的大背景下， "不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地"，以秸桿、鋸末、蔗渣、生活垃圾等物質(zhì)生產(chǎn)可再生能源（如：纖 維素乙醇）是世界各國(guó)未來(lái)能源發(fā)展的重要戰(zhàn)略，因此纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)得到了大力發(fā)展。 我國(guó)每年纖維素乙醇產(chǎn)量400萬(wàn)噸，我國(guó)"十二五"國(guó)家戰(zhàn)略性規(guī)劃實(shí)現(xiàn)低成本纖維素酶突 破。按照目前纖維素乙醇的生產(chǎn)規(guī)模，僅美國(guó)纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)所需要的纖維素酶即可 達(dá)到30萬(wàn)噸以上，我國(guó)纖維素酶的需求量也將近在10萬(wàn)噸左右。但在纖維素乙醇生產(chǎn)過(guò) 程中存在纖維素酶不能回收并重復(fù)使用，生產(chǎn)成本高且無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)等問(wèn)題。固定化纖 維素酶主要用于生產(chǎn)纖維素乙醇。用固定化纖維素酶代替自由纖維素酶，可以重復(fù)使用從 而降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，可以大大促進(jìn)可再生生物能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
[0005] 目前，固定化纖維素酶技術(shù)大多采用聚合物凝膠材料為載體，或者采用表面活性 劑的凝膠化方法。采用聚合物凝膠材料為載體的固定化酶使用周期短、成本高、抗毒性差、 活性低且重復(fù)使用次數(shù)少；采用表面活性劑凝膠化方法制備固定化酶的溶膠凝膠過(guò)程以及 模板移除過(guò)程往往需要嚴(yán)苛的條件（如高溫高壓、強(qiáng)酸堿環(huán)境以及使用大量有機(jī)溶劑），這 些嚴(yán)苛的條件對(duì)生物活性物質(zhì)（如：蛋白質(zhì)和核酸）具有極大的破壞作用，從而極大的限 制了傳統(tǒng)表面活性劑法在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，且該方法制備得到的固定化酶的回收也存在問(wèn) 題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為此，本發(fā)明提出了一種可以解決上述問(wèn)題的或至少能部分解決上述問(wèn)題的一種 高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料及其制備方法。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備 方法，該方法包括：溶膠形成步驟：在常溫下以稀酸為催化劑將TEOS水解至形成透明溶膠， 并將溶膠中乙醇抽離至質(zhì)量含量< 5%;凝膠形成步驟：在攪拌下向所述溶膠中依次加入模 板溶液和纖維二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，放置生成凝膠。
[0008] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述稀酸為0. 1?0. 3M的HC1溶液，所述 HC1溶液與所述TEOS的質(zhì)量比為5:32?13:32。
[0009] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述模板為葡萄糖、麥芽糖、果糖、二苯甲酰 基-L-酒石酸、環(huán)糊精、尿素、甘油、可溶性淀粉、檸檬酸、抗壞血酸或寡肽。
[0010] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述模板溶液與所述TEOS的質(zhì)量比為 2:32 ?6:32〇
[0011] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述纖維二糖酶緩沖液濃度為10?100mg/ ml〇
[0012] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述纖維二糖酶緩沖液與所述TEOS的質(zhì)量 比為 1:32 ?10:32。
[0013] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述稀堿液為NaOH溶液、K0H溶液或NH3. h2o〇
[0014] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述NaOH溶液的濃度為0. 4?0. 8M。
[0015] 可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，進(jìn)一步包括：
[0016] 去除模板干燥步驟：將所述凝膠研碎、加水洗滌除去模板抽濾得到凝膠，將抽濾 得到的凝膠埋入硅膠中干燥3-7天。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種根據(jù)上述制備方法得到的高活性固定化纖維 二糖酶納米介孔材料。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明方法制備得到的介孔材料固定化纖維二糖酶的產(chǎn)品活性可達(dá)自由纖 維二糖酶活性的90%以上，可重復(fù)使用九次以上而保持活性不降低；利用介孔材料固定纖 維二糖酶可以提高纖維二糖酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和使用溫度，延長(zhǎng)其在惡劣環(huán)境下的存儲(chǔ)周 期。本發(fā)明方法采用非表面活性劑法，在室溫、常壓、接近中性且?guī)缀跏羌兯嗟沫h(huán)境中制 造出介孔結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)溶膠凝膠造孔與原位包埋生物活性物質(zhì)的同步化，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、條件 溫和、環(huán)境友好，適宜于工業(yè)化。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 通過(guò)閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對(duì)于本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明 的限制。在附圖中：
[0020] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法流 程圖；
[0021] 圖2示出了高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的形態(tài)；
[0022] 圖3示出了高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的重復(fù)使用次數(shù)與活性變化 圖；
[0023] 圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法原 理圖；
[0024] 圖5示出了根據(jù)本發(fā)明的溶膠形成機(jī)理圖；
[0025] 圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的溶膠形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)凝膠化原理圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明提供了許多可應(yīng)用的創(chuàng)造性概念，該創(chuàng)造性概念可大量的體現(xiàn)于具體的上 下文中。在下述本發(fā)明的實(shí)施方式中描述的具體的實(shí)施例僅作為本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)方式的 示例性說(shuō)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，原理如圖4所 不〇
[0028] 根據(jù)圖4和圖1示出的流程圖可以看出，該方法首先進(jìn)入溶膠形成步驟S1100 :常 溫下以稀酸為催化劑在攪拌狀態(tài)下將正硅酸乙酯（TEOS)水解至透明溶膠，并將溶膠中乙 醇抽離至質(zhì)量含量< 5%。
[0029] 其中TEOS為正硅酸乙醋，在常溫下以稀酸為催化劑，一般采用0. 1?0. 3M的HC1 溶液，HC1溶液與TEOS的質(zhì)量比為5:32?13:32。常溫下在TEOS中邊攪拌邊加入稀鹽酸， 劇烈攪拌10?20min，得到透明的溶膠，將水解后得到的透明溶膠在0-KTC冷卻（如放置 在冰箱中進(jìn)行）2?4h，用高真空系統(tǒng)抽離除去體系水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙醇，溫度冷 卻至0-10°C為防止抽真空時(shí)由于體系中乙醇含量過(guò)高出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象防止溶膠濺出，抽離一 段時(shí)間后，為將體系中乙醇去除更徹底，將溶膠體系用水浴加熱至37-50°C恒溫后進(jìn)一步抽 取，至體系中乙醇質(zhì)量含量< 5 %，抽取一段時(shí)間后加熱進(jìn)行進(jìn)一步抽離，使乙醇抽離更加 徹底。將體系中的乙醇含量降低至<5%，是由于在溶膠中存在大量乙醇會(huì)影響后續(xù)生成的 高活性固定化纖維二糖酶的活性，而采用本方法后將體系中乙醇的含量控制在<5%時(shí)即 可不對(duì)高活性固定化纖維二糖酶的活性造成影響，因此本制備方法的制備條件相對(duì)更加寬 松，容易實(shí)現(xiàn)。其中，溶膠形成機(jī)理如圖5所示。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的方法及上述原理圖，該方法然后進(jìn)行凝膠形成步驟：在攪拌下向形 成的溶膠中依次加入模板溶液和纖維二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，在4-KTC 放置48?72h生成凝膠。
[0031] 在凝膠形成步驟的模板為葡萄糖、麥芽糖、果糖、二苯甲?；?L-酒石酸、環(huán)糊精、 尿素、甘油、可溶性淀粉、檸檬酸、抗壞血酸或寡肽。模板與TEOS的質(zhì)量比為2:32?6:32， 將模板制備成溶液加入體系中。纖維二糖酶緩沖液濃度為10?l〇〇mg/ml，纖維二糖酶緩沖 液與TEOS的質(zhì)量比為1:32?10:32。稀堿液為NaOH溶液、K0H溶液或NH 3. H20。其中NaOH 溶液的濃度為〇. 4?0. 8M。溶膠進(jìn)一步發(fā)生縮聚和醇解并形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)凝膠化原理如圖6 所示。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的制備方法及圖6,該方法進(jìn)一步進(jìn)入去除模板干燥步驟S1300 :將所 述凝膠研碎、加水洗滌除去模板抽濾得到凝膠，將抽濾得到的凝膠埋入硅膠中干燥3-7天， 將干燥好的凝膠研磨過(guò)40目篩子裝袋備用。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明制備得到的介孔材料固定化纖維二糖酶產(chǎn)品活性可達(dá)自由纖維二糖 酶活性的90%以上，可重復(fù)使用九次以上而保持活性不降低；利用介孔材料固定纖維二糖 酶可以提高纖維二糖酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和使用溫度，延長(zhǎng)其在惡劣環(huán)境下的存儲(chǔ)周期。本發(fā) 明方法采用非表面活性劑法，在室溫、常壓、接近中性且?guī)缀跏羌兯嗟沫h(huán)境中制造出介孔 結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)溶膠凝膠造孔與原位包埋生物活性物質(zhì)的同步化，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、條件溫和、環(huán) 境友好，適宜于工業(yè)化。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，可以根據(jù)溶膠 凝膠形成的條件、加入模板的量和種類、纖維二糖酶緩沖液的濃度和加入量等因素進(jìn)行具 體設(shè)計(jì)出不同的實(shí)施例，下面將以高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法為實(shí) 施例對(duì)本發(fā)明的制備方法進(jìn)行示例性說(shuō)明。
[0035] 實(shí)施例1-6中使用原料如下：
[0036]正硅酸乙酯（TEOS)，國(guó)藥試劑集團(tuán)，純度> 99%
[0037] 纖維二糖酶（Cellobiase)，阿拉丁試劑，250U/g
[0038] 鹽酸（0? lmol/L)，國(guó)藥試劑集團(tuán)
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 根據(jù)圖1示出的本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，首 先進(jìn)入溶膠形成步驟S1100 :稱取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在攪拌下加入5克0. 1M的稀HC1 溶液，鹽酸溶液與TE0S的質(zhì)量比為5:32,劇烈攪拌lOmin后，在常溫下以稀酸為催化劑將 TE0S水解至形成透明溶膠，將水解后的透明溶膠在0°C冷卻降溫2h后用高真空系統(tǒng)抽離體 系水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙醇，抽離一段時(shí)間后將溶膠水浴恒溫至37 °C進(jìn)行抽離，直至 溶膠中乙醇質(zhì)量含量< 5%。
[0041] 然后進(jìn)入凝膠形成步驟S1200 :在攪拌下向所述溶膠中依次加入模板溶液和纖維 二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，在4°C下放置48h生成凝膠。模板溶液為2克葡萄 糖溶于10克水中制成的溶液（葡萄糖與TE0S的質(zhì)量比2:32)。加入10mg/ml纖維二糖酶 緩沖液1克（纖維二糖酶緩沖液與TE0S的質(zhì)量比為1:32)。稀堿液為濃度為0. 4M的NaOH 溶液。
[0042] 最后進(jìn)入去除模板干燥步驟S1300 :將形成的凝膠研碎、加150ml水洗滌2次除去 葡萄糖抽濾得到白色凝膠，將抽濾得到的凝膠用濾紙埋在干燥的硅膠中干燥3天，研磨過(guò) 40目篩，裝袋備用。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 根據(jù)圖1示出的本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，首 先進(jìn)入溶膠形成步驟S1100 :稱取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在攪拌下加入13克0. 3M的稀 HC1溶液，鹽酸溶液與TE0S的質(zhì)量比為13:32,劇烈攪拌20min后，在常溫下以稀酸為催化 劑將TE0S水解至形成透明溶膠，將水解后的透明溶膠在10°C冷卻降溫4h后用高真空系統(tǒng) 抽離體系水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙醇，抽離一段時(shí)間后將溶膠水浴恒溫至50 °C進(jìn)行抽 離，直至溶膠中乙醇質(zhì)量含量< 5%。
[0045] 然后進(jìn)入凝膠形成步驟S1200 :在攪拌下向所述溶膠中依次加入模板溶液和纖維 二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，在10°c下放置72h生成凝膠。模板溶液為6克果 糖溶于10克水中制成的溶液（果糖與TEOS的質(zhì)量比6:32)。加入100mg/ml纖維二糖酶緩 沖液10克（纖維二糖酶緩沖液與TEOS的質(zhì)量比為10:32)。稀堿液為濃度為0. 8M的NaOH 溶液。
[0046] 最后進(jìn)入去除模板干燥步驟S1300 :將形成的凝膠研碎、加150ml水洗滌2次除去 葡萄糖抽濾得到白色凝膠，將抽濾得到的凝膠用濾紙埋在干燥的硅膠中干燥7天，研磨后 過(guò)40目篩，裝袋備用。
[0047] 實(shí)施例3
[0048] 根據(jù)圖1示出的本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，首 先進(jìn)入溶膠形成步驟S1100 :稱取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在攪拌下加入9克0. 2M的稀HC1 溶液，鹽酸溶液與TEOS的質(zhì)量比為9:32,劇烈攪拌15min后，在常溫下以稀酸為催化劑將 TEOS水解至形成透明溶膠，將水解后的透明溶膠在5°C冷卻降溫3h后用高真空系統(tǒng)抽離體 系水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙醇，抽離一段時(shí)間后將溶膠水浴恒溫至45°C進(jìn)行抽離，直至 溶膠中乙醇質(zhì)量含量< 5%。
[0049] 然后進(jìn)入凝膠形成步驟S1200 :在攪拌下向所述溶膠中依次加入模板溶液和纖維 二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，在8°C下放置60h生成凝膠。模板溶液為4克麥芽 糖溶于10克水中制成的溶液（麥芽糖與TEOS的質(zhì)量比4:32)。加入60mg/ml纖維二糖酶 緩沖液5克（纖維二糖酶緩沖液與TEOS的質(zhì)量比為5:32)。稀堿液為濃度為0. 6M的NaOH 溶液。
[0050] 最后進(jìn)入去除模板干燥步驟S1300 :將形成的凝膠研碎、加150ml水洗滌2次除去 葡萄糖抽濾得到白色凝膠，將抽濾得到的凝膠用濾紙埋在干燥的硅膠中干燥4天，研磨過(guò) 40目篩，裝袋備用。
[0051] 實(shí)施例4
[0052] 根據(jù)圖1示出的本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，首 先進(jìn)入溶膠形成步驟S1100 :稱取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在攪拌下加入7克0. 3M的稀HC1 溶液，鹽酸溶液與TEOS的質(zhì)量比為7:32,劇烈攪拌16min后，在常溫下以稀酸為催化劑將 TEOS水解至形成透明溶膠，將水解后的透明溶膠在7°C冷卻降溫3. 5h后用高真空系統(tǒng)抽離 體系水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙醇，抽離一段時(shí)間后將溶膠水浴恒溫至48°C進(jìn)行抽離，直 至溶膠中乙醇質(zhì)量含量< 5%。
[0053] 然后進(jìn)入凝膠形成步驟S1200 :在攪拌下向所述溶膠中依次加入模板溶液和纖維 二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，在8°C下放置68h生成凝膠。模板溶液為3克二 苯甲?；?L-酒石酸溶于10克水中制成的溶液（二苯甲?；?L-酒石酸與TEOS的質(zhì)量 比3:32)。加入50mg/ml纖維二糖酶緩沖液6克（纖維二糖酶緩沖液與TEOS的質(zhì)量比為 6:32)。稀堿液為濃度為0. 7M的NaOH溶液。
[0054] 最后進(jìn)入去除模板干燥步驟S1300 :將形成的凝膠研碎、加150ml水洗滌2次除去 葡萄糖抽濾得到白色凝膠，將抽濾得到的凝膠用濾紙埋在干燥的硅膠中干燥4天，研磨過(guò) 40目篩，裝袋備用。
[0055] 實(shí)施例5
[0056] 根據(jù)圖1示出的本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，首 先進(jìn)入溶膠形成步驟S1100 :稱取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在攪拌下加入12克0. 2M的稀 HC1溶液，鹽酸溶液與TE0S的質(zhì)量比為12:32,劇烈攪拌13min后，在常溫下以稀酸為催化 劑將TE0S水解至形成透明溶膠，將水解后的透明溶膠在6 °C冷卻降溫3h后用高真空系統(tǒng)抽 離體系水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙醇，抽離一段時(shí)間后將溶膠水浴恒溫至42 °C進(jìn)行抽離， 直至溶膠中乙醇質(zhì)量含量< 5%。
[0057] 然后進(jìn)入凝膠形成步驟S1200 :在攪拌下向所述溶膠中依次加入模板溶液和纖維 二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，在7°C下放置55h生成凝膠。模板溶液為3克葡萄 糖溶于10克水中制成的溶液（葡萄糖與TE0S的質(zhì)量比3:32)。加入70mg/ml纖維二糖酶 緩沖液8克（纖維二糖酶緩沖液與TE0S的質(zhì)量比為8:32)。稀堿液為濃度為0. 6M的NaOH 溶液。
[0058] 最后進(jìn)入去除模板干燥步驟S1300 :將形成的凝膠研碎、加150ml水洗滌2次除去 葡萄糖抽濾得到白色凝膠，將抽濾得到的凝膠用濾紙埋在干燥的硅膠中干燥4天，研磨過(guò) 40目篩，裝袋備用。
[0059] 實(shí)施例6
[0060] 根據(jù)圖1示出的本發(fā)明的高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，首 先進(jìn)入溶膠形成步驟S1100 :稱取正硅酸乙酯（TE0S)32克，在攪拌下加入12. 5克0. 1M的稀 此1溶液，鹽酸溶液與1￡05的質(zhì)量比為12.5:32，劇烈攪拌151^11后，在常溫下以稀酸為催 化劑將TE0S水解至形成透明溶膠，將水解后的透明溶膠在4°C冷卻降溫2h后用高真空系 統(tǒng)抽離體系水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙醇，抽離一段時(shí)間后將溶膠水浴恒溫至37°C進(jìn)行抽 離，直至溶膠中乙醇質(zhì)量含量< 5%。
[0061] 然后進(jìn)入凝膠形成步驟S1200 :在攪拌下向所述溶膠中依次加入模板溶液和纖維 二糖酶緩沖液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，在4°C下放置48h生成凝膠。模板溶液為2克果 糖溶于10克水中制成的溶液（果糖與TE0S的質(zhì)量比2:32)。加入10mg/ml纖維二糖酶緩 沖液1克（纖維二糖酶緩沖液與TE0S的質(zhì)量比為1:32)。稀堿液為濃度為0. 4M的NaOH溶 液。
[0062] 最后進(jìn)入去除模板干燥步驟S1300 :將形成的凝膠研碎、加150ml水?dāng)嚢柘礈? 次除去葡萄糖抽濾得到白色凝膠，將抽濾得到的凝膠用濾紙埋在干燥的硅膠中干燥3天 (72h)，研磨過(guò)40目篩，裝袋備用。
[0063] 根據(jù)實(shí)施例1-6制備得到的高活性固定化纖維二糖酶的納米介孔材料，固定化纖 維二糖酶產(chǎn)品活性可達(dá)自由纖維二糖酶活性的90%以上；所述材料可重復(fù)使用十次以上 而保持活性不降低；利用介孔材料固定纖維二糖酶可以提高纖維二糖酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和使 用溫度，延長(zhǎng)其在惡劣環(huán)境下的存儲(chǔ)周期。本發(fā)明方法采用非表面活性劑法，在室溫、常壓、 接近中性且?guī)缀跏羌兯嗟沫h(huán)境中制造出介孔結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)溶膠凝膠造孔與原位包埋生物活 性物質(zhì)的同步化，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、條件溫和、環(huán)境友好，適宜于工業(yè)化。
[0064] 對(duì)根據(jù)本發(fā)明的制備方法得到的高活性固定化纖維二糖酶的納米介孔材料進(jìn)行 了系列性能表征。
[0065] ( -）活性測(cè)定
[0066] 活力測(cè)定方法：纖維二糖酶活力（cellobiase activity, CBA)按照IUPAC推薦的 標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，以國(guó)際單位IU表示。取1. OmL纖維二糖底物（15mmol/L、pH = 4. 8)于試管 中，加入lmL適當(dāng)稀釋的酶液，在50°C下恒溫反應(yīng)30min。用葡萄糖氧化酶法測(cè)定生成的葡 萄糖，并扣除空白試驗(yàn)測(cè)定值。一個(gè)纖維二糖酶活力國(guó)際單位（CBIU)等于標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)條 件下每分鐘生成2. Oumol葡萄糖的酶量。則有：
[0067]

【權(quán)利要求】
1. 一種高活性固定化纖維二糖酶納米介孔材料的制備方法，該方法包括： 溶膠形成步驟S1100 :在常溫下以稀酸為催化劑將TEOS水解至形成透明溶膠，并將溶 膠中的乙醇抽離至質(zhì)量含量< 5% ; 凝膠形成步驟S1200 :在攪拌下向所述溶膠中依次加入模板溶液和纖維二糖酶緩沖 液，用稀堿液將體系調(diào)至中性，放置生成凝膠。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述稀酸為0. 1?0. 3M的HC1溶液，所述HC1 溶液與所述TEOS的質(zhì)量比為5:32?13:32。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述模板為葡萄糖、麥芽糖、果糖、二苯甲酰 基-L-酒石酸、環(huán)糊精、尿素、甘油、可溶性淀粉、檸檬酸、抗壞血酸或寡肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述模板與所述TEOS的質(zhì)量比為2:32? 6:32〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述纖維二糖酶緩沖液濃度為10?100mg/ ml〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中所述纖維二糖酶緩沖液與所述TEOS的質(zhì)量比 為 1:32 ?10:32。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述稀堿液為NaOH溶液、K0H溶液或NH3. H20。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中所述NaOH溶液的濃度為0. 4?0. 8M。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，該方法進(jìn)一步包括： 去除模板干燥步驟S1300 :將所述凝膠研碎、加水洗滌除去模板抽濾得到凝膠，將抽濾 得到的凝膠埋入硅膠中干燥3-7天。
10. -種根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述制備方法得到的高活性固定化纖維二糖酶納米介 孔材料。
【文檔編號(hào)】C12N11/04GK104450663SQ201410605836
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月2日
【發(fā)明者】危巖, 李書(shū)潤(rùn), 翟文濤 申請(qǐng)人:清華大學(xué)