一種合成2,5-呋喃二甲酸的土生拉烏爾菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種合成2,5-呋喃二甲酸的土生拉烏爾菌及其應用，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開的Raoultella terrigena BF60菌株于2014年8月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No.M 2014391。所述Raoultella terrigena是從生產(chǎn)5-羥甲基糠醛的工廠附近的土壤中篩選得到的。應用該菌進行全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2,5-呋喃二甲酸的產(chǎn)量可達7.95g/L，為進一步利用土生拉烏爾菌生產(chǎn)2,5-呋喃二甲酸奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的土生拉烏爾菌生產(chǎn)2,5-呋喃二甲酸的方法簡單，具有很好的應用前景。
CCTCC No:M2014391
20140826
【專利說明】-種合成2, 5-映喃二甲酸的土生拉烏爾菌及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種合成2, 5-呋喃二甲酸的土生拉烏爾菌及其應用，屬于微生物技 術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 2,5-呋喃二甲酸（2,5_卩11四11(^〇3也(《711。3(^(1，卩00六）是重要的化工原料和有 機合成中間體，可用來制備各種脂類呋喃或烷基取代衍生物，并且被美國能源部列為最具 有應用前景的12種平臺化合物之一。此外，2, 5-呋喃二甲酸可以取代對苯二甲酸用來制造 聚酯類的塑膠材料，具有廣闊的應用前景。
[0003] 目前，制備2, 5-呋喃二甲酸的方法有化學合成法和生物轉(zhuǎn)化法，化學合成法一般 采用貴金屬作為催化劑，需要高溫、高壓和有機溶劑等條件，成本較高且環(huán)境污染嚴重。生 物合成法一般采用以5-羥甲基糠醛為底物，轉(zhuǎn)化生成2, 5-呋喃二甲酸。與化學合成法相 t匕，生物轉(zhuǎn)化法條件更溫和、低毒和環(huán)保。但是由于5-羥甲基糠醛對細胞有毒害作用，只有 極少數(shù)的微生物可以利用5-羥甲基糠醛生產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸，因此雖然生物轉(zhuǎn)化法有較 多優(yōu)點，但是目前關(guān)于采用生物轉(zhuǎn)化法來生產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸的報道卻較少。現(xiàn)有報道了 來自海洋真菌Caldariomyces fumago所產(chǎn)的氯過氧化物酶可以以5-輕甲基糠醒為底物生 成60-75%的2, 5-呋喃二甲酸。也有研究者在惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaS12中異 源表達了來自貪銅菌屬的Cupriavidus basilensis HMF14的5-輕甲基糠醒氧化酶，可以 利用5-羥甲基糠醛生成2, 5-呋喃二甲酸。目前，利用土生拉烏爾菌來生產(chǎn)2, 5-呋喃二甲 酸還未見報道。
[0004] 2, 5-呋喃二甲酸可以通過5-羥甲基糠醛氧化得到，而5-羥甲基糠醛可以由葡萄 糖或果糖脫水生成。該合成途徑的研究可以將豐富的生物質(zhì)資源應用于材料領(lǐng)域，減少人 類對石油資源的依賴，減少環(huán)境污染，具有十分廣闊的應用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種合成2, 5-呋喃二甲酸的土生拉烏爾菌（Raoultella terrigena， R.terrigena)BF60。所述R.terrigena BF60菌株于2014年8月26日保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No :M2014391。
[0006] 所述菌株具有5-羥甲基糠醛抗性，抗性濃度范圍為0-35mM。
[0007] 所述菌株在5-羥甲基糠醛為35mM的培養(yǎng)基中仍能生長，是已報道的現(xiàn)有同屬菌 株中5-羥甲基糠醛抗性最高的菌株。
[0008] 所述R. terrigena BF60菌株篩選來自生產(chǎn)5-羥甲基糠醛的工廠附近的土樣。
[0009] 本發(fā)明還提供一種所述R. terrigena BF60菌株的篩選方法，是取生產(chǎn)5-輕甲基 糠醛的工廠附近的土樣，在含有5-羥甲基糠醛的培養(yǎng)基中進行富集、篩選、發(fā)酵培養(yǎng)，檢測 發(fā)酵液中2, 5-呋喃二甲酸的產(chǎn)量，得到一株2, 5-呋喃二甲酸產(chǎn)量較高的菌株。
[0010] 所述R. terrigena BF60菌株的篩選方法中的培養(yǎng)基為：
[0011] 富集培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉 10g，5-羥甲基 糠醛3. 15g ;篩選培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉 10g，5-羥甲基糠醛4.4g， 瓊脂20g ;
[0012] 本發(fā)明還提供一種應用所述1?461^8611&8?60來生產(chǎn)2,5-呋喃二甲酸的方法， 是以5-羥甲基糠醛為底物采用全細胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。
[0013] 所述方法是將底物5-羥甲基糠醛加入R. terrigena BF60菌懸液中，采用全細胞 轉(zhuǎn)化法，實現(xiàn)2, 5-呋喃二甲酸的積累。
[0014] 所述方法，全細胞轉(zhuǎn)化的條件是：在OD6tltl為80-120的R. terrigena BF60菌懸液 中添加5-羥甲基糠醛至終濃度為75-150mM，在25-37°C、150-220rpm下轉(zhuǎn)化50-150h。
[0015] 所述R. terrigena直接在含有5-輕甲基糠醒底物的培養(yǎng)基中，能耐受35mM的 5_羥甲基糠醛，而在全細胞轉(zhuǎn)化過程中，細胞濃度較高，可以將底物濃度75-150mM的5-羥 甲基糠醛轉(zhuǎn)化生成2, 5-呋喃二甲酸。
[0016] 所述方法中，制備菌懸液的土生拉烏爾菌體的培養(yǎng)方法為：將R. terrigena BF60 于25-37°C、150-220rpm條件下的菌體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-30h，離心得菌體。
[0017] 所述方法中，菌體培養(yǎng)基（g/L)為酵母粉0· 1-1、K2HPO4 · 3H2010-25、 NaH2PO4 · 2H205-1 5、（NH4) 2S04卜5、MgCI · 6H200· I-O· 6、EDTAO· 0 I-O· 05、 ZnSO4 · 7H200. 001-0. 005, CaCl2 · 2H200. 001-0. 005, FeSO4 · 7H200. 005-0. 02, Na2MoO4 · 2H200. 001-0. 005、CuSO4 · 5H200. 0005-0. 002、CoCl2 · 6H200. 0005-0. 002、 MnCl2 · 2H200. 001-0. 005、甘油 5-15。
[0018] 所述方法中菌懸液的制備，是將R. terrigena BF60菌體用pH6-9的緩沖液洗滌后 重懸菌體。
[0019] 所述方法，具體包括：將R. terrigena BF60于25-37 °C、150-220rpm條件下的菌 體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-30h，離心得菌體，用pH6-9的緩沖液重懸菌體，使菌體最終濃度為0D_ 為80-120,然后加入5-羥甲基糠醛，使5-羥甲基糠醛的終濃度為75-150mM，于25-37°C、 150-220rpm 條件下轉(zhuǎn)化 50-150h。
[0020] 所述緩沖液是以下任意一種：磷酸鹽緩沖液、tris-HCl緩沖液,Britton-Robinson 緩沖液。
[0021] 所述緩沖液重懸菌體，在本發(fā)明的一種實施方式中，是先洗滌3次再重懸。
[0022] 所述緩沖液，在本發(fā)明的一種實施方式中是pH為7的磷酸鹽緩沖液。
[0023] 所述菌懸液的0D_，在本發(fā)明的一種實施方式中為90-110。
[0024] 所述5-羥甲基糠醛的終濃度，在本發(fā)明的一種實施方式中為80-110mM。
[0025] 所述全細胞轉(zhuǎn)化時的溫度，在本發(fā)明的一種實施方式中為28_32°C。
[0026] 所述全細胞轉(zhuǎn)化時的轉(zhuǎn)速，在本發(fā)明的一種實施方式中為200_220rpm。
[0027] 所述全細胞轉(zhuǎn)化時間，在本發(fā)明的一種實施方式中為90_120h。
[0028] 本發(fā)明提供的R. terrigena BF60可實現(xiàn)2, 5-呋喃二甲酸的積累，其產(chǎn)量可達到 7. 95g/L，為進一步利用土生拉烏爾菌生產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的土 生拉烏爾菌生產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸的方法簡單，具有很好的應用前景。
[0029] 生物材料
[0030] 土生拉烏爾菌Raoultella terrigena BF60已于2014年8月26日保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No :M2014391，保藏地址為中國武漢武漢大學。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖IR. terrigena BF60的光學顯微鏡照片（物鏡100X，目鏡10X)
[0032] 圖2R. terrigena BF60的透射電子顯微鏡照片
[0033] 圖3標準品㈧和發(fā)酵液（B)中2, 5-呋喃二甲酸的液相色譜圖
[0034] 圖4標準品（A)和發(fā)酵液B)中2, 5-呋喃二甲酸的二級質(zhì)譜圖

【具體實施方式】
[0035] 2, 5-呋喃二甲酸的高效液相色譜（HPLC)測定方法：
[0036] 儀器為Agilent 1260,檢測器為VWD ;檢測波長為230nm ;色譜柱為Aminex HPX-87H(300X7. 8mm);流動相為 5mM H2SO4 ;流速為 0. 5mL/min ;柱溫為 40°C ;進樣量為 10 μ L0
[0037] 2, 5-呋喃二甲酸的液質(zhì)聯(lián)用儀檢測方法：
[0038] 儀器：WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS ;
[0039] 液相色譜條件：色譜儀為WATERS ACQUITY UPLC;檢測器為WATERS ACQUITY PDA ;分析柱為CSH(2. I X 50mm，1. 7 μ m);流動相為A :100%乙腈；B :0. 1 %甲酸；梯度洗脫 (lmin :0% A ;4min :10% A ;7min :100% A ;8min :100% A ;8. Imin :0% A ;10min :0% A);柱 溫為45°C ;流速為0. 3mL/min ;進樣量為1 μ L。
[0040] 質(zhì)譜條件：離子方式：ESI-;毛細管電壓：3. OKV ;錐孔電壓：30V;離子源溫度： l〇〇°C ;脫溶劑氣溫度：400°C ;脫溶劑氣流量：500L/h ;錐孔氣流量：50L/h ;碰撞能量：6eV ; 質(zhì)量范圍：50-1000m/z ;檢測電壓：1900V。
[0041] 實施例1高產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸菌株的篩選
[0042] 將Ig取自一生產(chǎn)5-羥甲基糠醛的工廠附近的土樣加入到裝有20mL富集培養(yǎng)基 的250mL三角瓶中，在30°C，220rpm下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液經(jīng)短時離心后，取上清液涂布于篩 選培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。挑取菌落形態(tài)較大的菌株轉(zhuǎn)移到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，取500yL 培養(yǎng)液移入含有500 μ L40%甘油的保藏管中，置于-80°C冰箱保存。
[0043] 富集培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，5_羥甲基 糠醛3. 15g。
[0044] 篩選培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，5_羥甲基糠醛4.4g，瓊 脂 20g ;
[0045] 挑取_80°C保藏的菌株在固體種子培養(yǎng)基上劃線，于30°C培養(yǎng)24h后，挑取單菌落 接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，30°C在轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床中培養(yǎng)72h 后，將發(fā)酵液于12000rpm下離心lOmin，用去離子水稀釋一定倍數(shù)后，經(jīng)0. 22μπι濾膜過濾 后采用高效液相色譜儀和液質(zhì)聯(lián)用儀對發(fā)酵液進行2, 5-呋喃二甲酸的定性分析，最終檢 測到一株2, 5-呋喃二甲酸產(chǎn)量較高的菌株，將其編號為BF60。
[0046] 種子培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10。如需固體培養(yǎng)基，再添加 2%瓊脂。
[0047] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，5_羥甲基糠醛3.15g。
[0048] 液相色譜圖和質(zhì)譜圖分別見圖3和圖4。從圖3中的高效液相色譜圖可以看出發(fā)酵 液中出現(xiàn)和2, 5-呋喃二甲酸標準品具有同樣保留時間（分別為19. 136min和19. 138min) 的色譜峰，并且往發(fā)酵液中外源添加2, 5-呋喃二甲酸標準品后，該保留時間下的色譜峰峰 面積會相應增大，因此確定該化合物是2, 5-呋喃二甲酸。為了進一步驗證該化合物，采用 二級質(zhì)譜對質(zhì)核比（m/z) 155的離子進行轟擊，得二級質(zhì)譜圖4,從圖4中可以看出發(fā)酵液 和2, 5-呋喃二甲酸標準品中均有質(zhì)核比（m/z)為111、67的離子碎片，因此可以確定該化 合物是2, 5-呋喃二甲酸。
[0049] 實施例2產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸菌株的分子生物學鑒定
[0050] 應用細菌通用引物（27F/1492R)從篩選得到的菌株的基因組中擴增其16sDNA 序列，進行測序，比對。該菌株的16sRNA序列如SEQ ID NO. 1所示。將該序列在NCBI中 進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)，該菌株的目的序列與土生拉烏爾菌（R. terrigena NBRC14941)的 相似度為98%，因此，確定該菌株為土生拉烏爾菌（又稱土生克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena))。該菌株已于2014年8月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC No :M2014391，保藏地址為中國武漢武漢大學。
[0051] 實施例3Raoultella terrigena BF60的形態(tài)特征及生理生化特征
[0052] R. terrigena BF60在不含5-羥甲基糠醛的篩選培養(yǎng)基上30°C下培養(yǎng)24h，菌 落為淡黃色半球形，表面濕潤閃光，邊緣整齊，半透明，兼性厭氧生長，革蘭氏染色為陰性， 1000X顯微鏡（附圖1)和透射電子顯微鏡（附圖2)下觀察細胞呈桿狀，有莢膜，單個或成 對形式存在。參照第八版《伯杰細菌鑒定手冊》和相關(guān)文獻進行了相應的生理生化性能分 析實驗，結(jié)果如表1所示。
[0053] 表1目標菌株分類鑒定結(jié)果
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一株土生拉烏爾菌（Raoultella terrigena)BF60,于2014年8月26日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC No :M2014391。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株以5-羥甲基糠醛為底物生成 2, 5-呋喃二甲酸。
3. -種應用權(quán)利要求1所述的土生拉烏爾菌生產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸的方法，其特征在 于，所述方法是以5-羥甲基糠醛為底物采用全細胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述全細胞轉(zhuǎn)化法是：在0D_為80-120 的R. terrigena BF60菌懸液中添加底物5-羥甲基糠醛至終濃度為75-150mM，在25-37°C、 150-220rpm 下轉(zhuǎn)化 50-150h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌懸液的R. terrigena BF60菌體 的培養(yǎng)方法是將R. terrigena BF60于25-37°C，150-220rpm條件下的菌體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24-30h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌體培養(yǎng)基每升中含有：酵母粉 0? l-lg、K2HP04.3H20 10-25g、NaH2P04.2H20 5-15g、（NH4)2S04 l-5g、MgCl .6H20 0? 1-0. 6g、 EDTAO. 01-0. 05g、ZnS04 ? 7H20 0. 001-0. 005g、CaCl2 ? 2H20 0. 001-0. 005g、FeS04 ? 7H20 0. 005-0. 02g、Na2Mo04 ? 2H20 0. 00卜0. 005g、CuS04 ? 5H20 0. 0005-0. 002g、CoC12 ? 6H20 0? 0005-0. 002g、MnCl2 ? 2H20 0? 001-0. 005g、甘油 5-15g。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述方法具體為：將R. terrigena BF60于25-37°C、150-220rpm下的菌體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-30h，離心得菌體，用pH為6-9的 緩沖液重懸菌體，使菌體最終濃度為〇D_為80-120,然后加入5-羥甲基糠醛，使5-羥甲基 糠醛的終濃度為75-150mM，于25-37°C、150-220rpm條件下轉(zhuǎn)化50-150h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述緩沖液是以下任意一種：磷酸鹽緩沖 液、tris-HCl 緩沖液，Britton-Robinson 緩沖液。
9. 權(quán)利要求1所述土生拉烏爾菌在生產(chǎn)2, 5-呋喃二甲酸方面的應用。
【文檔編號】C12P17/04GK104371955SQ201410606067
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】劉龍, 陳堅, 堵國成, 李江華, 袁海波 申請人:江南大學