一種監(jiān)控總rna中線狀rna消除的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法。所述方法包括：人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA；對(duì)外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行質(zhì)量控制；將外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，得到混合外源RNA；向待檢樣本的總RNA中加入混合外源RNA，得到第一混合物；去除第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物；去除第二混合物中的線性RNA，線性RNA包括總RNA中的線性RNA和外源線性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；分別檢測(cè)第一混合物和第三混合物中的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量；根據(jù)含量計(jì)算總RNA中線性RNA的去除比例。所述方法能夠有效監(jiān)控總RNA中線性RNA的去除程度。
【專利說明】-種監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物體內(nèi)大部分的RNA為線性，但有少部分RNA首尾連接形成環(huán)狀，被稱為環(huán)狀 RNA。近年來，環(huán)狀RNA迅速成為RNA世界研究的熱點(diǎn)，這是因?yàn)楦咄繙y(cè)序技術(shù)可以被用 于檢測(cè)環(huán)狀RNA，這極大地加快了對(duì)環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)及對(duì)環(huán)狀RNA功能的分析。
[0003] 研究環(huán)狀RNA的前提是將環(huán)狀RNA從生物體內(nèi)分離出來，目前還沒有直接從生物 體內(nèi)獲取環(huán)狀RNA的方法，只能從總RNA中去除線性RNA，間接達(dá)到富集環(huán)狀RNA的目的。 通常，環(huán)狀RNA占總RNA的比例不到1 %，在高通量測(cè)序檢測(cè)環(huán)狀RNA前，需要監(jiān)控總RNA 中線性RNA的去除程度。目前，一個(gè)環(huán)狀RNA樣本高通量測(cè)序檢測(cè)成本在10萬(wàn)元以上。若 有較多的線性RNA存在，則線性RNA會(huì)在高通量測(cè)序過程占用大量的測(cè)序資源，產(chǎn)生無(wú)效數(shù) 據(jù)，造成人力、物力與財(cái)力的大量浪費(fèi)。然而，目前還沒有監(jiān)控總RNA中線性RNA的消除的 方法，導(dǎo)致浪費(fèi)難以避免。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法有效監(jiān)控總RNA中線性RNA的去除程度的問題，本發(fā)明 實(shí)施例提供了一種監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法。所述技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法，所述方法包括：
[0006] 人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA ;
[0007] 對(duì)所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行質(zhì)量控制；
[0008] 將所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混 合，得到混合外源RNA;
[0009] 向待檢樣本的總RNA中加入所述混合外源RNA，所述總RNA與所述混合外源RNA的 質(zhì)量比為2000:1，得到第一混合物；
[0010] 去除所述第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物；
[0011] 去除所述第二混合物中的線性RNA，所述線性RNA包括所述總RNA中的內(nèi)源線性 RNA和所述外源線性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；
[0012] 分別檢測(cè)所述第一混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外 源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量；
[0013] 根據(jù)所述含量計(jì)算所述總RNA中所述線性RNA的去除比例。
[0014] 具體地，所述人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，包 括：
[0015]選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序 列表中SEQIDN0:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQIDN0:2所示；
[0016] 將所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達(dá)載體 中，分別獲得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；
[0017] 將獲得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因分別 在體外轉(zhuǎn)錄，分別合成所述外源線性ERCC-0004-RNA和外源線性ERCC-0013-RNA;
[0018] 去除所述外源線性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在所述外源線性 ERCC-0013-RNA的5'端合成羥基；
[0019] 對(duì)5'端為羥基的所述外源線性ERCC-0013-RNA進(jìn)行磷酸化修飾，合成5'端經(jīng)磷 酸化修飾的所述外源線性ERCC-0013-RNA;
[0020] 將所述5'端經(jīng)磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端連接，合成 所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA ;
[0021] 利用RNA酶R切掉未環(huán)化成功的所述外源線性ERCC-0013-RNA，得到所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA。
[0022] 進(jìn)一步地，所述待檢樣本的基因中不存在與所述外源ERCC-0004基因和所述外源 ERCC-0013基因相同或同源的基因。
[0023] 具體地，所述對(duì)所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行質(zhì)量控制，包括：
[0024] 利用隨機(jī)引物對(duì)合成的所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源 ERCC-0013-cDNA，所述外源ERCC-0013-cDNA包括外源線性ERCC-0013-cDNA和外源環(huán)狀 ERCC-0013-cDNA；
[0025] 利用第一引物和第二引物分別對(duì)所述外源ERCC-0013-cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò) 增，所述第一引物包括如序列表中SEQIDN0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQID N0:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQIDN0:5所示的第二正向引 物和如序列表中SEQIDN0:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于擴(kuò)增所述外源線性 ERCC-0013-cDNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于擴(kuò)增所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-cDNA，通過所述第一引物擴(kuò)增獲得CT1值，通過所述第二引物擴(kuò)增獲得CT2值；
[0026] 通過CT1值和CT2值以及公式2|('_々Gt1]x1〇〇%,計(jì)算合成的所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的環(huán)化比例，并選用環(huán)化比例超過90%時(shí)的所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0027] 具體地，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的線性RNA。
[0028] 具體地，所述分別檢測(cè)所述第一混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述 外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA 和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量，包括：
[0029] 采用逆轉(zhuǎn)錄引物0004和逆轉(zhuǎn)錄引物0013分別對(duì)所述第一混合物和所述第三混合 物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到含有cDNA的所述第一混合物和含有cDNA的所述第三混合物，所述逆轉(zhuǎn) 錄引物0004如序列表中SEQIDN0:7所示，所述逆轉(zhuǎn)錄引物0013如序列表中SEQIDN0:8 所示；
[0030]采用第三引物0004和第四引物0013分別對(duì)所述含有cDNA的第一混合物進(jìn)行定 量PCR檢測(cè)，分別獲得CT3值和CT4值，采用所述第三引物0004和所述第四引物0013分別 對(duì)所述含有cDNA的第三混合物進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，分別獲得CT5值和CT6值，所述第三引物 0004包括如序列表中SEQIDN0:9所示的第三正向引物0004和如序列表中SEQIDN0:10 所示的第三反向引物0004,所述第四引物0013包括如序列表中SEQIDNO: 11所示的第四 正向引物0004和如序列表中SEQIDNO: 12所示的第四反向引物0004。
[0031] 進(jìn)一步地，所述逆轉(zhuǎn)錄的方法包括：取所述第一混合物0. 5yg與下列成分混合： 5yl濃度為1UM的所述逆轉(zhuǎn)錄引物0004、2ill濃度為10mM的dNTP、5ill濃度為lOOmM的 DL-二硫蘇糖醇、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶和10yl5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，用水補(bǔ)足50yl后混勻， 于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘；
[0032] 取所述第三混合物0. 5yg與下列成分混合：5yl濃度為1yM的所述逆轉(zhuǎn)錄引物 0013、2ill濃度為10mM的dNTP、5ill濃度為lOOmM的DL-二硫蘇糖醇、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶和 10iil5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，用水補(bǔ)足50iU后混勻，于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分 鐘。
[0033] 進(jìn)一步地，根據(jù)公式l-2[eT5+eT4<V^T3]x1〇〇%,計(jì)算所述總RNA中所述線性RNA 的去除比例。
[0034] 進(jìn)一步地，所述實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C20秒；95°C3秒，60°C20 秒，共40個(gè)循環(huán)。
[0035] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供了一種監(jiān)控 總RNA中線狀RNA消除的方法，該方法利用人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA與待檢樣本的總RNA混合，一同去除混合物中的線性RNA。檢測(cè)去除線性 RNA前的溶液中的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量，以及去除 線性RNA后的溶液中的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量，通過 外源線性ERCC-0004-RNA相對(duì)于外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量推算出總RNA中線性RNA 的去除比例，從而避免采用線性RNA去除效果不好的樣本進(jìn)行高通量測(cè)序所造成的巨大人 力、物力與財(cái)力的浪費(fèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 的附圖。
[0037] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方 式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0039] 本發(fā)明實(shí)施例中的試劑均為市售試劑。
[0040] 實(shí)施例
[0041] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法，本發(fā)明實(shí)施例提 供的待檢樣本為萊茵衣藻，且該萊茵衣藻的品系為CC503(購(gòu)自于衣藻資源中心，網(wǎng)址為： http://chlamycollection.org/)，如圖 1 所示，具體方法包括：
[0042] 步驟100 :人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。已有的 RNA研究都是采用一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源RNA作為參照。為了監(jiān)控線狀RNA消除是否干凈， 可以檢測(cè)并計(jì)算出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源線性RNA與內(nèi)源環(huán)狀RNA分別在去除線性RNA前后的比 例，通過這個(gè)比例來監(jiān)控線狀RNA去除是否干凈。然而，目前還沒有發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源環(huán) 狀RNA，因而無(wú)法直接利用內(nèi)源環(huán)狀RNA進(jìn)行監(jiān)控。在本發(fā)明實(shí)施例中，為了監(jiān)控內(nèi)源線性 RNA的去除程度，人工合成了外源環(huán)狀RNA與外源線狀RNA，按比例加入總RNA后作為參照， 以模擬體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源環(huán)狀RNA與內(nèi)源線狀RNA，使得監(jiān)控線性RNA去除具有了現(xiàn)實(shí)可 行性。對(duì)于本發(fā)明實(shí)施例提供的人工合成外源RNA，需要考慮幾點(diǎn)：所設(shè)計(jì)的外源環(huán)狀RNA 與外源線性RNA在體內(nèi)沒有相同序列或同源性較高的序列，因?yàn)榧尤肟俁NA后，是無(wú)法將外 源RNA與內(nèi)源RNA區(qū)分開的，若二者存在重疊，將導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確；此外，外源基因長(zhǎng)度也不 宜太長(zhǎng)，否則影響環(huán)化效率。考慮到合成的RNA量較大，且需要經(jīng)常使用，本發(fā)明實(shí)施例將 RNA對(duì)應(yīng)的DNA序列轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中，通過質(zhì)粒增殖而增加相應(yīng)的DNA的量，從而靈活獲得大量 DNA序列，再通過體外轉(zhuǎn)錄，將質(zhì)粒DNA變?yōu)镽NA。為此，在DNA前端設(shè)計(jì)了體外轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子 序列。轉(zhuǎn)錄成的RNA需要純化，為了實(shí)現(xiàn)這一目的，又在DNA的未端設(shè)計(jì)了寡聚T，轉(zhuǎn)錄后形 成寡聚A尾巴，寡聚A可用于純化RNA。合成的外源RNA是線狀，需要環(huán)化后才能成為環(huán)狀 RNA。由于合成時(shí)的RNA的5'端為三磷酸基團(tuán)，而連接時(shí)，需要的是單磷酸基團(tuán)，為此，去掉 了外源RNA的三磷酸基團(tuán)后，再加上單磷酸基團(tuán)這一步，從而合成能夠環(huán)化成環(huán)的前體RNA 的狀態(tài)。具體操作步驟如下：
[0043] 1、選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，該外源ERCC-0004基因如序 列表中3￡0 10勵(lì)：1所示，該外源￡1?〇：-0013基因如序列表中5￡0 10勵(lì):2所示。
[0044] 上述SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2及其互補(bǔ)鏈由生工生物工程（上海）股份有限公 司合成。
[0045] 通過NCBI的BLAST程序檢索，沒有發(fā)現(xiàn)生物中存在與外源ERCC-0004基因和外源 ERCC-0013基因的同源基因。選擇的外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因的長(zhǎng)度不 超過lOOObp。分別在外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因的5'端和3'端分別添加 了ctcgag和aagctt序列，該ctcgag和aagctt序列分別為限制性內(nèi)切酶Xhol和Hindlll 的酶切位點(diǎn)，便于將外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因克隆進(jìn)入原核表達(dá)載體，夕卜 源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因的5'端的taatacgactcactata序列為17轉(zhuǎn)錄酶 的啟動(dòng)子序列，其余序列為可轉(zhuǎn)錄的序列。在taatacgactcactata序列之后連接有g(shù)gg序 列，ggg序列能夠增加17轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄效率。
[0046] 2、將外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達(dá)載體中，獲 得克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因，包括：
[0047] 所選用的克隆載體為pBluescriptIISK(+)(該克隆載體從長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù) 有限公司購(gòu)買，貨號(hào)為VKS0288)，采用內(nèi)切酶XhoI(購(gòu)買自NEB公司，貨號(hào)為R0146)和內(nèi) 切酶HindIII(購(gòu)買自NEB公司，貨號(hào)為R0104)對(duì)pBluescriptIISK(+)載體進(jìn)行雙酶 切。具體地，在20ill的反應(yīng)體系中，包含有10iigpBluescriptIISK(+)載體、20U的 內(nèi)切酶HindIII、20U的內(nèi)切酶Xhol和2X的NEBuffer2. 1(由NEB公司提供）。將上述 反應(yīng)體系混合均勻，經(jīng)短暫離心，于37°C保溫1小時(shí)后，經(jīng)80°C20分鐘將酶滅活，并獲得 線性pBluescriptIISK(+)載體，該線性pBluescriptIISK(+)載體的濃度為 10/20 = 0. 5yg/y1 〇
[0048] 將外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因用無(wú)菌水溶解后，分別配制成濃度 為0. 5i!g/ill的溶液，將外源ERCC-0004基因及其互補(bǔ)鏈按體積比1 :1混合均勻，于PCR儀中依次經(jīng)歷94°C10分鐘；65°C10分鐘和37°C10分鐘，形成外源ERCC-0004-雙鏈DNA 基因；將外源ERCC-0013基因及其互補(bǔ)鏈按相同的方法進(jìn)行處理，獲得外源ERCC-0013-雙 鏈DNA基因。
[0049] 在20ii1的反應(yīng)體系中包括線性的pBluescriptIISK(+)載體10y1、外源 ERCC-0004-雙鏈DNA基因1ii1、T4DNA連接酶（購(gòu)買自NEB公司，貨號(hào)為M0202)400U 和1XT4DNA連接酶緩沖液（隨T4DNA連接酶一起購(gòu)買自NEB公司），16°C溫育過夜后， 65°C10分鐘，T4DNA連接酶經(jīng)熱失活，獲得含有外源ERCC-0004基因的pBluescriptII SK(+)質(zhì)粒載體。按同樣的方法，獲得含有外源ERCC-0013基因的pBluescriptIISK(+) 質(zhì)粒載體。
[0050] 利用熱激法將含有外源ERCC-0004基因的pBluescriptIISK(+)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化 進(jìn)入大腸桿菌，具體方法如下：取50yl感受態(tài)細(xì)胞（由北京全式金生物技術(shù)有限公司生 產(chǎn)，目錄號(hào)為CD501)在冰浴中自然解凍，加入含有外源ERCC-0004基因的pBluescriptII SK(+)質(zhì)粒載體，輕輕混勻，在冰浴上孵育30分鐘，42°C熱激30秒，快速轉(zhuǎn)移至冰浴中冰浴 3分鐘，該過程中不要搖動(dòng)離心管，然后加入300yl不含抗生素的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基（LB 液體培養(yǎng)基成份：牛肉膏〇. 5g，蛋白胨1. 0g，氯化鈉0. 5g，蒸餾水100mL，pH7. 2?7. 5)，于 37°C200轉(zhuǎn)/分鐘，復(fù)蘇1小時(shí)，取復(fù)蘇后的菌液200 均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的 LB固體培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊 脂粉15g/L)上，待菌液完全吸收后倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)過夜。挑取LB固體培 養(yǎng)基上長(zhǎng)出來的單克隆至5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37°C200轉(zhuǎn)/分鐘，搖 菌擴(kuò)增繁殖6-8小時(shí)，制備成感受態(tài)細(xì)胞。
[0051] 利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的快速質(zhì)粒小提試劑盒（貨號(hào)為DP105) 從上述感受態(tài)細(xì)胞中，提取并純化含有外源ERCC-0004基因的pBluescriptIISK(+)質(zhì)粒 載體的DNA，提取與純化的方法按照隨試劑盒提供的說明書進(jìn)行。利用分光光度計(jì)（美國(guó) Quawell公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)中的雙鏈DNA程序，檢測(cè)純化后的pBluescriptIISK(+) 質(zhì)粒的質(zhì)量濃度。利用外源ERCC-0004基因的PCR引物從純化后的pBluescriptIISK(+) 質(zhì)粒上擴(kuò)增外源ERCC-0004基因。具體地，20ill的擴(kuò)增體系包括：純化后的pBluescript IISK⑴質(zhì)粒50ng、10iilQ5高保真擴(kuò)增混合物（購(gòu)自于NEB公司，貨號(hào)為M0492)和10iiM 的外源ERCC-0004基因的PCR引物（該P(yáng)CR引物為正向引物與反向引物的混合物）。擴(kuò)增 程序如下：98°C30秒；（98°C8秒，56°C20秒，72°C20秒）X30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物利用 乙醇沉淀進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物溶解于10U1無(wú)酶水中，獲得外源線性ERCC-0004基因的PCR 產(chǎn)物，利用Q5000(美國(guó)Quawell公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)中的雙褳DNA定量程序?qū)CR產(chǎn) 物進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明：本次擴(kuò)增獲得的外源線性ERCC-0004基因的PCR產(chǎn)物濃度 為610ng/yl。擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，確認(rèn)克隆的ERCC-0004的正 確性，從而獲得含有正確克隆外源ERCC-0004基因的BluescriptIISK(+)質(zhì)粒與外源線 性ERCC-0004基因的PCR產(chǎn)物。按同樣的方法，獲得含有正確克隆外源ERCC-0013基因的 BluescriptIISK(+)質(zhì)粒與外源線性ERCC-0013基因的PCR產(chǎn)物。
[0052] 其中，外源ERCC-0004基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQIDN0:13所 示，外源ERCC-0004基因的PCR引物的反向引物如序列表中SEQIDNO: 14所示；外源 ERCC-0013基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQID勵(lì)：13所示，外源￡此(：-0013基 因的？〇?引物的反向引物如序列表中5￡0 10勵(lì)：15所示。其中，5￡0 10勵(lì)：13與5￡0 10 NO: 15中的多聚T序列是為了在轉(zhuǎn)錄時(shí)獲得多聚A，用于模擬生物RNA的多聚A尾巴，該多 聚A尾巴可用于RNA的逆轉(zhuǎn)錄和純化。
[0053] 3、將克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因通過體外轉(zhuǎn)錄，合成外源線性 ERCC-0004-RNA和外源線性ERCC-0013-RNA，包括：
[0054] 采用I7RNA快速高效合成試劑盒（購(gòu)自于NEB公司，貨號(hào)為E2050)轉(zhuǎn)錄合成外源 ERCC-0004-RNA。該試劑盒中的成份包括：無(wú)酶水、含有NTP的緩沖液混合物和I7RNA聚合酶 混合物。反應(yīng)體系中包括：lug上述外源線性ERCC-0004基因的PCR產(chǎn)物、lOiil含有NTP 的緩沖液混合物和2ii1 17RNA聚合酶混合物，加水補(bǔ)足20ii1混合均勻，并短暫離心，經(jīng) 37°C保溫2小時(shí)后，加入30iil無(wú)酶水和2iilDNase1(購(gòu)自于NEB公司，貨號(hào)為M0303)， 混合均勻后，經(jīng)37°C保溫15分鐘，去除DNA模板。再利用DynabeadsmRNA純化試劑盒（由 ABI公司生產(chǎn)，貨號(hào)為61006)進(jìn)行純化，并用50ill無(wú)酶水溶解純化產(chǎn)物，獲得純化的外源 線性ERCC-0004-RNA。采用同樣的方法，獲得純化的外源線性ERCC-0013-RNA。
[0055] 4、去除外源線性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在外源線性 ERCC-0013-RNA的5'端合成羥基。因體外合成的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端為三磷 酸結(jié)構(gòu)，使得外源線性ERCC-0013-RNA的5'端無(wú)法與3'端連接形成環(huán)狀，所以必須去除該 5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，再在5'端加上單磷酸結(jié)構(gòu)，這樣才能使得外源線性ERCC-0013-RNA的 首尾相連成環(huán)狀，具體步驟包括：
[0056] 采用小牛腸堿性磷酸酶（購(gòu)自于NEB公司，貨號(hào)為M0290)去除外源線 性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)。反應(yīng)體系包括：20iig純化的外源線性 ERCC-0013-RNA和7U的小牛腸堿性磷酸酶，用水補(bǔ)足20yl后混合均勻，經(jīng)短暫離心，于 37°C保溫1小時(shí)，獲得去除5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)的外源線性ERCC-0013-RNA。利用Dynabeads mRNA純化試劑盒（由ABI公司生產(chǎn)，貨號(hào)為61006)純化去除5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)的外源線 性ERCC-0013-RNA，得到5'端為羥基的外源線性ERCC-0013-RNA。
[0057] 5、對(duì)5'端為羥基的外源線性ERCC-0013-RNA進(jìn)行磷酸化修飾，合成5'端磷酸化 修飾的外源線性ERCC-0013-RNA，包括：
[0058] 利用T4PNK激酶（由NEB公司，貨號(hào)為M0201)修飾該5'端為羥基的外源線性 已1?〇：-0013-1?隱。隨酶一起提供的有10\了4?疆激酶緩沖液。在50111的反應(yīng)體系中，包 含如下成份：1XT4PNK激酶緩沖液、ImMATP、10UT4PNK激酶、以及上述獲得的5'端為羥 基的外源線性ERCC-0013-RNA，用水補(bǔ)足50ill并混合均勻，經(jīng)短暫離心，于37°C保溫30分 鐘。利用DynabeadsmRNA純化試劑盒（由ABI公司生產(chǎn)，貨號(hào)為61006)進(jìn)行純化，操作方 法按該試劑盒的說明書進(jìn)行，獲得5'端磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA。
[0059] 6、將5'端磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端連接，合成外源 環(huán)狀ERCC-0013-RNA，包括：
[0060] 利用T4 RNA連接酶I (NEB公司生產(chǎn)，貨號(hào)為M0204)對(duì)該5'端磷酸化修飾的外源 線性ERCC-0013-RNA的5'端與3'端進(jìn)行連接。隨該T4 RNA連接酶I 一起提供的成份還 包括：10XT4 RNA連接酶反應(yīng)緩沖液、10mMATP、10U/iil的RNA酶抑制劑和PEG 8000。在 20ul的反體系中包含如下成份：1XT4 RNA連接酶反應(yīng)緩沖液、10U/iil的T4 RNA連接酶 1 ill、10U/ill的RNA酶抑制劑0? 5 ill、濃度為10%的PEG8000、20-50 i! M的ATP和上述獲 得的5'端磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA，用水補(bǔ)足20iU并混合均勻，經(jīng)短暫離 心，于PCR儀中于16°C過夜，經(jīng)95°C 2分鐘終止反應(yīng)，得到外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0061] 純化外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，具體地，向得到的含有外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA 的混合物中加入以下成份：5M的醋酸銨（Ambion公司生產(chǎn)，貨號(hào)為AM9071) 10iU、濃度 為100%的乙醇200ill和水80iil，混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于-80°C冰箱（海爾公司生 產(chǎn)，型號(hào)為DW-86L626)中放置30分鐘；取出后經(jīng)14000rpm4°C離心25分鐘，用移液器 的槍頭小心吸去上層清液，向沉淀中加入300yl濃度為70%的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng) 14000rpm4°C離心5分鐘后吸去上層清液，于室溫下，空氣中干燥10分鐘，用于去除殘留的 乙醇，再用10U1無(wú)酶水溶解沉淀，獲得純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0062] 7、利用RNA酶R切掉未環(huán)化成功的外源線性ERCC-0013-RNA。具體步驟包括：
[0063] 在獲得的純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA中，還有部分未環(huán)化成功的外源線性 ERCC-0013-RNA，利用RNA酶R(由Epicentre公司生產(chǎn)，貨號(hào)為RNR07250)切掉未環(huán)化成功 的外源線性ERCC-0013-RNA。隨該RNA酶R -起提供的還有10XRNA酶R反應(yīng)緩沖液，向 獲得的純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA中加入2 ill 10 X RNA酶R反應(yīng)緩沖液、1 ill 20U/ yl的RNA酶R和7 yl水混合均勻，經(jīng)短暫離心后于40°C保溫1小時(shí)，獲得去除了外源線 狀 ERCC-0013-RNA 的外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA。
[0064] 8、純化去除了外源線狀ERCC-0013-RNA的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，包括：
[0065] 向獲得的去除了外源線狀ERCC-0013-RNA的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA中加入以下 成份：5M的醋酸銨（Ambion公司生產(chǎn)，貨號(hào)為AM9071) 10iil、濃度為100%的乙醇200iil和 水80 ill并混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于-80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號(hào)為DW-86L626)中 放置30分鐘，取出后經(jīng)14000rpm 4°C離心25分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液，向 沉淀中加入300 yl濃度為70%的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng)14000rpm 4°C離心5分鐘后吸 去上層清液，于室溫下，空氣中干燥10分鐘，用于去除殘留的乙醇，用50 yl無(wú)酶水溶解沉 淀，獲得純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0066] 步驟200 :對(duì)外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行質(zhì)量控制。即使是采用了以上去 除線性ERCC-0013-RNA的步驟，外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA中仍然可能混有外源線狀 ERCC-0013-RNA，因此需要對(duì)外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行質(zhì)量控制。具體步驟包括：
[0067]1、利用隨機(jī)引物對(duì)合成的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源 ERCC-0013-cDNA，外源ERCC-0013-cDNA包括外源線性ERCC-0013-cDNA和外源環(huán)狀 ERCC-0013-cDNA，具體步驟如下：
[0068] 利用分光光度計(jì)（美國(guó)Quawell公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)中RNA定量程序，測(cè) 定并獲得上述純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的質(zhì)量濃度，本實(shí)施例提供的外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNARNA的質(zhì)量濃度為 8. 99ng/ii 1。
[0069] 取獲得純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA 0. 1 ii g，與下列成分混合：5 ill濃度為 1iiM的6堿基隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、2ill濃度為 10mM的dNTP、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Invitrigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為18064-014)、5iil濃度 為100mM的DL-二硫蘇糖醇（DL_Dithiothreitol，DTT，隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起由美國(guó)Invitrigen 公司提供）和10U1 5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液（隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起由美國(guó)Invitrigen公司提 供），用水補(bǔ)足50yl混勻后，經(jīng)42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘，使酶失活，合成外源ERCC-0013-cDNA。
[0070] 2、利用第一引物和第二引物分別對(duì)外源ERCC-0013-cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增， 第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所 示的第一反向引物，第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引物和如序列 表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，第一引物用于擴(kuò)增外源線性ERCC-0013-cDNA和外 源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，第二引物用于擴(kuò)增外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，通過第一引物擴(kuò)增 獲得CT1值，通過第二引物擴(kuò)增獲得CT2值。
[0071] 其中，第一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物不跨越外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的環(huán)化連接點(diǎn)，使得 該第一引物可擴(kuò)增外源線性ERCC-0013-cDNA，又可擴(kuò)增外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA;第二引 物或其擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的環(huán)化連接點(diǎn)，使得該第二引物只能擴(kuò)增外 源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA。
[0072] 其中，第一引物和第二引物分別在兩個(gè)反應(yīng)體系中平行進(jìn)行，且反應(yīng)體系和反應(yīng) 條件均相同，僅引物不同。具體地，取2yl外源ERCC-0013-cDNA、3yl濃度為1yM的第 一引物、10111定量？〇?混合物（由！'〇7〇13〇公司生產(chǎn)，貨號(hào)為0?5-201)和0.411150倍的 R0X熒光校正染料（由Toyobo公司隨QPS-201 -起提供）混合均勻后，經(jīng)短暫離心，在ABI StepOne實(shí)時(shí)定量PCR儀中按如下擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增：95°C20秒；95°C3秒， 60°C20秒，共40個(gè)循環(huán)，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，該熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用于 衡量表達(dá)量的多少。
[0073] 3、通過CT1值和CT2值以及公式2[e+ eTl] x 1〇〇%,計(jì)算合成的外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的環(huán)化比例，當(dāng)環(huán)化比例超過90%時(shí)，外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA可以使用。
[0074] 通過第一引物擴(kuò)增獲得(^1值，該CT1值為21. 55;采用第二引物按同樣的方 法進(jìn)行擴(kuò)增，獲得CT2值，該CT2值為21. 45。將CT1值和CT2值代入公式計(jì)算外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的環(huán)化比例為：2[Ct2-Ct1] x 1〇〇% =2[21.45-21.55] x 1〇〇〇/0=93. 30%。若外 源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的環(huán)化比例超過90%，該外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA可以使用，否則， 該外源環(huán)狀￡1?〇：-0013-1?隱不能使用，需重新制備外源環(huán)狀￡1?〇：-0013-1?隱。其中，90%的 環(huán)化比例作為外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA合格的標(biāo)準(zhǔn)是一經(jīng)驗(yàn)值，該比例可根據(jù)具體情況作 出調(diào)整。
[0075] 步驟300 :將外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按摩爾比1:1混 合，得到混合外源RNA。具體操作如下：
[0076] 利用QubitRNA分析試劑盒（由Invitrigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為Q32852)測(cè)定外源 線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的質(zhì)量濃度，測(cè)定方法按該試劑盒的說明 書進(jìn)行。在本實(shí)施例中，檢測(cè)獲得的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的 質(zhì)量濃度分別為13393口 §/111和5298口§/111。利用網(wǎng)站工具（網(wǎng)址為：11?口://?醫(yī)允 &81(3. northwestern,edu/biotools/oligocalc.html)計(jì)算外源線性 ERCC-0004-RNA 和外源環(huán) 狀ERCC-0013-RNA的分子量分別為168246. 6和262445. 9,通過分子量分別計(jì)算外源線性 ERCC-0004-RNA 和外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA 的摩爾濃度分別為 79603. 39pM 和 20187. 02pM， 由此計(jì)算，若要求外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，那 么，二者混合的體積比應(yīng)該為1 :3. 94。具體地，取外源線性ERCC-0004-RNAlOiil與外源 環(huán)狀ERCC-0013-RNA39. 4yl混合均勻后，經(jīng)短暫離心，獲得混合外源RNA。計(jì)算得到該混 合外源RNA的摩爾濃度為32214. 62pM，質(zhì)量濃度為6936. 66pg/iil。
[0077] 步驟400:向萊茵衣藻的總RNA中加入該混合外源RNA，總RNA與混合外源RNA的 質(zhì)量比為2000:1，得到第一混合物。該第一混合物中既有外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，又有外 源線性ERCC-0004-RNA，模擬了內(nèi)源環(huán)狀RNA與內(nèi)源線狀RNA。1/2000的混合比例既保證了 有足夠的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA可以檢測(cè)，又不至于添加過 多外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，以至于浪費(fèi)后期高通量測(cè)序的檢 測(cè)成本。具體步驟包括：
[0078] 1、提取萊茵衣藻的總RNA:
[0079] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的萊茵衣藻5ml，且所取的萊茵衣藻的數(shù)目少于4000萬(wàn)個(gè)，若超過 4000萬(wàn)個(gè)，則相應(yīng)減少取樣體積。4000rpm常溫離心1分鐘，倒去上層的培養(yǎng)液后，利用 Trizol試劑（由Invirtigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為15596-018)提取萊茵衣藻的總RNA并溶解 于50yl無(wú)核酸酶的水中，總RNA的提取與純化的方法按照Trizol試劑的操作手冊(cè)進(jìn)行。
[0080] 利用分光光度計(jì)（分光光度計(jì)由美國(guó)Quawell公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)中RNA定 量程序，測(cè)定并獲得上述提取的萊茵衣藻的總RNA的質(zhì)量濃度。在本實(shí)施例中，獲得的萊 茵衣藻的總RNA的質(zhì)量濃度為1. 52iig/iil。由此計(jì)算，提取的萊茵衣藻的總RNA的量為 76ug〇
[0081] 2、向提取的萊茵衣藻總RNA中加入混合外源RNA，包括：
[0082]總RNA與混合外源RNA的質(zhì)量比為2000:1，具體地，向76iig萊茵衣藻的總RNA中 加入38ng混合外源RNA，根據(jù)混合外源RNA的質(zhì)量濃度（6936. 66pg/ii1)計(jì)算，應(yīng)加入的混 合外源RNA的體積為5. 48yl，加入后混合均勻，經(jīng)短暫離心，得到第一混合物。
[0083] 步驟500:去除第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物?？俁NA中絕大部分 都是核糖體RNA(>95% )，該核糖體RNA不是環(huán)狀的RNA，因此，需要消除。具體操作如下：
[0084] 利用植物核糖體RNA去除試劑盒（由Epicentre公司生產(chǎn)，貨號(hào)為MRZPL116-6) 去除第一混合物中的核糖體RNA。
[0085] 該試劑盒包括：RNA酶抑制劑（100U/ill)、核糖體RNA去除液、反應(yīng)緩沖液、糖原 (10mg/ml)、醋酸鈉（3M)、無(wú)核酸酶的水、磁珠和磁珠磁浮液。
[0086] 磁珠預(yù)處理：取225ii1磁珠，置于磁架上，并在室溫下靜置1分鐘，用225ii1無(wú)核 酸酶的水清洗一次，重復(fù)利用225ill無(wú)核酸酶的水再清洗一次，將磁珠振蕩懸浮于60ill 磁珠磁浮液中，再加入1Ul糖原，得到經(jīng)過預(yù)處理的磁珠。
[0087] 樣品預(yù)處理：在40iil的反應(yīng)體系中，加入以下成分：5iig第一混合物、8-10iil 核糖體RNA去除液和4yl反應(yīng)緩沖液，用水補(bǔ)足40yl，混勻后經(jīng)短暫離心，68°C保溫10分 鐘，取出后室溫放置5分鐘，得到經(jīng)過預(yù)處理的樣品混合物。
[0088] 去除核糖體RNA:向經(jīng)過預(yù)處理的磁珠中加入經(jīng)過預(yù)處理樣品混合物，用移液器 的槍頭吹打幾次混勻，經(jīng)短暫離心，于室溫下保溫5分鐘，進(jìn)行渦旋震蕩，50°C保溫5分鐘， 置于磁架上，于室溫下靜置1分鐘，丟棄吸附的磁珠，獲得去除核糖體RNA的混合物。
[0089] 純化樣品：向去除核糖體RNA的混合物中加入以下成份：5M的醋酸銨（Ambion公 司生產(chǎn)，貨號(hào)為AM9071) 10ill、100%的乙醇200ill和水60ill并混合均勻，經(jīng)短暫離心， 置于-80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號(hào)為DW-86L626)中放置30分鐘，14000rpm4°C離心25 分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液，再加入300yl濃度為70 %的乙醇，用于清洗沉 淀，再經(jīng)14000rpm4°C離心5分鐘后去除上層清液，于室溫下，空氣中干燥10分鐘，用于去 除殘留的乙醇，用10Ul無(wú)酶水溶解沉淀，獲得純化的去除了核糖體RNA的第一混合物，即 第二混合物。
[0090] 其中，總RNA中的線性RNA包括：外源線性ERCC-0004-RNA和內(nèi)源的線性RNA，環(huán) 狀RNA包括：外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA和內(nèi)源的環(huán)狀RNA。
[0091] 步驟600:去除第二混合物中的線性RNA，線性RNA包括總RNA中的內(nèi)源線性RNA 和外源線性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物。在第二混合物中，總RNA中的內(nèi)源線性RNA 和外源線性ERCC-0004-RNA為混合物狀態(tài)，因此，對(duì)第二混合物進(jìn)行去除線性RNA的處理， 同時(shí)對(duì)二者進(jìn)行了完全相同的處理。因此，外源線性ERCC-0004-RNA的去除程度與總RNA 中的內(nèi)源線性RNA的去除程度是相同的，通過監(jiān)控外源線性ERCC-0004-RNA的去除比例，可 以達(dá)到監(jiān)控內(nèi)源線性RNA的去除比例的目的。此時(shí)，外源線性ERCC-0004-RNA已經(jīng)等同于 內(nèi)源參照基因了。具體包括：
[0092] 利用RNA酶R(Epicentre公司生產(chǎn)，貨號(hào)為RNR07250)能夠酶切消化線性RNA的 特性，去除第二混合物中的線性RNA。隨RNA酶R-起提供的還有10XRNA酶R反應(yīng)緩沖 液。向上述第二混合物中加入2ill10XRNA酶R反應(yīng)緩沖液、1ill20U/ill的RNA酶R和 水7yl，混合均勻，經(jīng)短暫離心后40°C保溫1小時(shí)，得到了去除線性RNA的第二混合物。
[0093] 純化去除線性RNA的第二混合物：向上述去除線性RNA的第二混合物中加入以下 成份：5M的醋酸銨（Ambion公司生產(chǎn)，貨號(hào)為AM9071) 10iil、濃度為100%的乙醇200iil 和水80iil，混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于-80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號(hào)為DW-86L626)中 放置30分鐘，14000rpm4°C離心25分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液，加入300yl 濃度為70%的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng)14000rpm4°C離心5分鐘后去除上層清液，于室溫 下，空氣中干燥10分鐘，用于去除殘留的乙醇，用l〇ul無(wú)酶水溶解沉淀，獲得了純化的去 除了線性RNA的第二混合物，即第三混合物。
[0094] 步驟700 :檢測(cè)第一混合物中的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的含量、以及第三混合物中的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的含量，計(jì)算總RNA中線性RNA的去除比例。第一混合物是去除線性RNA 前的溶液，第三混合物是去除線性RNA后的溶液，而在這兩種溶液中，環(huán)狀RNA的量不受 線狀RNA去除處理的影響，能夠保持含量恒定不變，因此可以作為線狀RNA去除程度的 參照。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)它們的量，之后先計(jì)算第三混合和第一混合物中外源線 性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量的比值，這兩個(gè)比值之間的商即為 線狀RNA去除比例。為了避免檢測(cè)到未環(huán)化的外源線性ERCC-0013-RNA，針對(duì)外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)定量PCR引物跨越了環(huán)化連接點(diǎn)。具體操作如下：
[0095] 1、逆轉(zhuǎn)錄。具體地，逆轉(zhuǎn)錄引物：逆轉(zhuǎn)錄引物0004和逆轉(zhuǎn)錄引物0013,采用逆轉(zhuǎn)錄 引物0004和逆轉(zhuǎn)錄引物0013分別對(duì)第一混合物和第三混合物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到含有cDNA 的第一混合物和含有cDNA的第三混合物，逆轉(zhuǎn)錄引物0004如序列表中SEQIDNO: 7所示， 逆轉(zhuǎn)錄引物0013如序列表中SEQIDN0:8所示，且逆轉(zhuǎn)錄引物0013要求只能逆轉(zhuǎn)錄外源 環(huán)化ERCC-0013-RNA，因此，該逆轉(zhuǎn)錄引物0013跨越了外源環(huán)化ERCC-0013-RNA的環(huán)化連接 點(diǎn)，逆轉(zhuǎn)錄引物0004和逆轉(zhuǎn)錄引物0013序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合 成。
[0096] 該逆轉(zhuǎn)錄過程包括兩類，第一類是以第一混合物為模板，并將第一混合物通過逆 轉(zhuǎn)錄引物0004進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的產(chǎn)物為含有cDNA的第一混合物；第二類是以第三混合物 為模板，將第三混合物通過逆轉(zhuǎn)錄引物0013進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并獲得的產(chǎn)物為含有cDNA的第三 混合物。在兩類逆轉(zhuǎn)錄過程中，除以上模板與引物不同外，其它成份均完全一樣，且兩類反 應(yīng)同時(shí)并平行進(jìn)行。
[0097] 第一類逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程如下：取0. 5yg第一混合物作為模板，并與下列成分混 合：5111濃度為11^的逆轉(zhuǎn)錄引物0004、2111濃度為101111的(1階1\2(^的逆轉(zhuǎn)錄酶（美 國(guó)11^^1^611公司生產(chǎn)，貨號(hào)為18064-014)，5111濃度為1001111的01-二硫蘇糖醇（隨 逆轉(zhuǎn)錄酶一起提供）和10Ul5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液（隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起提供），用水補(bǔ)足 50yl混勻后，于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘，使酶失活，且按照相同的方法進(jìn)行第 二類的逆轉(zhuǎn)錄，即取第三混合物〇. 5yg與下列成分混合：5yl濃度為1yM的所述逆轉(zhuǎn)錄 弓丨物0013、2ill濃度為10mM的dNTP、5ill濃度為lOOmM的DL-二硫蘇糖醇、20U的逆轉(zhuǎn)錄 酶和lOiil5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，用水補(bǔ)足50iU后混勻，于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫 15分鐘。
[0098] 2、實(shí)時(shí)定量PCR，具體地，定量PCR引物：第三引物0004和第四引物0013,第四引 物0013要求只能擴(kuò)增外源環(huán)化ERCC-0013-RNA，因此，該第四引物0013跨越了外源環(huán)化 ERCC-0013-RNA的環(huán)化連接點(diǎn)，第三引物0004包括如序列表中SEQIDN0:9所示的第三正 向引物0004和如序列表中SEQIDN0:10所示的第三反向引物0004,第四引物0013包括如 序列表中SEQIDN0:11所示的第四正向引物0004和如序列表中SEQIDN0:12所示的第 四反向引物0004,第三引物0004和第四引物0013均由生工生物工程（上海）股份有限公 司合成。
[0099] 具體地，該實(shí)時(shí)定量PCR包括四類：第一類為第三引物0004與含有cDNA的第一混 合物的組合，擴(kuò)增后獲得CT3值；第二類為第四引物0013與含有cDNA的第一混合物之間的 組合，擴(kuò)增后獲得CT4值；第三類為第三引物0004與含有cDNA的第三混合物的組合，擴(kuò)增 后獲得Ct5值；第四類為第四引物0013與含有cDNA的第三混合物的組合，擴(kuò)增后獲得Ct6 值。其中含有cDNA的第一混合物和含有cDNA的第三混合物均為模板，在四類實(shí)時(shí)定量PCR 過程中，除以上模板與引物不同外，其它成份均完全一樣，且這四類反應(yīng)同時(shí)并平行進(jìn)行。
[0100] 進(jìn)一步地，第一類實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：取2ill含有cDNA的第一混合物作為模板、 3ul濃度為luM的第三引物0004(正向引物和反向引物的混合物）、10iU定量PCR混合 物（由日本Toyobo公司生產(chǎn)，貨號(hào)為QPS-201)和0? 4iU50倍的R0X熒光校正染料（由 日本Toyobo公司生產(chǎn)，并且隨定量PCR混合物一起提供）。將以上混合物混合均勻，短暫 離心，在ABIStepOne實(shí)時(shí)定量PCR儀中按如下程序進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：95°C20秒； 95°C3秒，60°C20秒，共40個(gè)循環(huán)，在每一次循環(huán)的最后一步收集突光信號(hào)，突光信號(hào)的強(qiáng) 弱用于衡量cDNA量的多少。通過以上程序，獲得CT3為24. 35。
[0101] 按相同的方法進(jìn)行其它三類實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，獲得CT5為21. 20、CT4為24. 26、 CT6 為 24. 33。
[0102]步驟800 :根據(jù)含量計(jì)算總RNA中線性RNA的去除比例：計(jì)算總RNA中線性RNA的 去除比例的公式為：
[0103]

【權(quán)利要求】
1. 一種監(jiān)控總RNA中線狀RNA消除的方法，其特征在于，所述方法包括： 人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA ; 對(duì)所述外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA進(jìn)行質(zhì)量控制； 將所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，得 到混合外源RNA ; 向待檢樣本的總RNA中加入所述混合外源RNA，所述總RNA與所述混合外源RNA的質(zhì)量 比為2000:1，得到第一混合物； 去除所述第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物； 去除所述第二混合物中的線性RNA，所述線性RNA包括所述總RNA中的內(nèi)源線性RNA和 所述外源線性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物； 分別檢測(cè)所述第一混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外 源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA的含量； 根據(jù)所述含量計(jì)算所述總RNA中所述線性RNA的去除比例。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和 外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，包括： 選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表 中SEQ ID NO: 1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO:2所示； 將所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達(dá)載體中， 分別獲得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因； 將獲得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因分別在體 外轉(zhuǎn)錄，分別合成所述外源線性ERCC-0004-RNA和外源線性ERCC-0013-RNA ; 去除所述外源線性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在所述外源線性 ERCC-OO 13-RNA的5'端合成羥基； 對(duì)5'端為羥基的所述外源線性ERCC-0013-RNA進(jìn)行磷酸化修飾，合成5'端經(jīng)磷酸化 修飾的所述外源線性ERCC-0013-RNA ; 將所述5'端經(jīng)磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端連接； 利用RNA酶R切掉未環(huán)化成功的所述外源線性ERCC-0013-RNA，得到所述外源環(huán)狀 ERCC-OO13-RNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述待檢樣本的基因中不存在與所述外 源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行 質(zhì)量控制，包括： 利用隨機(jī)引物對(duì)合成的所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源 ERCC-0013-cDNA，所述外源ERCC-0013-cDNA包括外源線性ERCC-0013-cDNA和外源環(huán)狀 ERCC-OO13-cDNA ； 利用第一引物和第二引物分別對(duì)所述外源ERCC-OO13-cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增， 所述第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引 物和如序列表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于擴(kuò)增所述外源線性 ERCC-0013-cDNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于擴(kuò)增所述外源環(huán)狀 ERCC-OO 13-cDNA，通過所述第一引物擴(kuò)增獲得CTl值，通過所述第二引物擴(kuò)增獲得CT2值； 通過CtI值和CT2值以及公式2K'_「2_ 1 X 1〇〇%,計(jì)算合成的所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的環(huán)化比例，并選用環(huán)化比例超過90%的所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的線 性 RNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分別檢測(cè)所述第一混合物中的所述 外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量、以及所述第三混合物中 的所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的含量，包括： 采用逆轉(zhuǎn)錄引物0004和逆轉(zhuǎn)錄引物0013分別對(duì)所述第一混合物和所述第三混合物進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄，得到含有cDNA的所述第一混合物和含有cDNA的所述第三混合物，所述逆轉(zhuǎn)錄引 物0004如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述逆轉(zhuǎn)錄引物0013如序列表中SEQ ID NO:8所 示； 采用第三引物0004和第四引物0013分別對(duì)所述含有cDNA的第一混合物進(jìn)行定量PCR 檢測(cè)，分別獲得CT3值和CT4值，采用所述第三引物0004和所述第四引物0013分別對(duì)所述 含有cDNA的第三混合物進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，分別獲得CT5值和CT6值，所述第三引物0004 包括如序列表中SEQ ID N0:9所示的第三正向引物0004和如序列表中SEQ ID NO: 10所示 的第三反向引物0004,所述第四引物0013包括如序列表中SEQ ID NO: 11所示的第四正向 引物0004和如序列表中SEQ ID NO: 12所示的第四反向引物0004。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄的方法包括：取所述第一混合 物0. 5 ii g與下列成分混合：5 ill濃度為I ii M的所述逆轉(zhuǎn)錄引物0004、2 ill濃度為IOmM的 dNTP、5 ill濃度為IOOmM的DL-二硫蘇糖醇、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶和10 iU5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖 液，用水補(bǔ)足50 ill后混勻，于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘； 取所述第三混合物〇. 5 y g與下列成分混合：5 iU濃度為I y M的所述逆轉(zhuǎn)錄引物 0013、2 ill濃度為IOmM的dNTP、5 ill濃度為IOOmM的DL-二硫蘇糖醇、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶和 10 iU5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，用水補(bǔ)足50 ill后混勻，于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分 鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，根據(jù)公式x 1〇〇%，計(jì) 算所述總RNA中所述線性RNA的去除比例。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)椋?95°C 20 秒；95°C 3 秒，60°C 20 秒，共 40 個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328185SQ201410606600
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】周俊飛, 李利利, 陳利紅, 高利芬, 張繼, 方治偉, 章偉雄, 盧龍, 李甜甜, 彭海 申請(qǐng)人:江漢大學(xué)