可分泌抗ii型登革病毒ns1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種靈敏度較高且特異性較強(qiáng)的II型登革病毒檢測試紙，該檢測試紙通過使用上述雜交瘤細(xì)胞分泌的抗II型登革病毒NS1單克隆抗體，在標(biāo)記物為較大的納米顆粒時，間接標(biāo)記可以降低標(biāo)記抗原的使用量，在提高靈敏度的同時改善特異性。此外，本發(fā)明還涉及一種可分泌抗II型登革病毒NS1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及應(yīng)用。該雜交瘤細(xì)胞為兩株，保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號是CCTCC No：C2014183和CCTCC No：C2014182。CCTCC No：C20141822014.09.25CCTCC No：C20141832014.09.25
【專利說明】可分泌抗M型登革病毒NSI單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、單 克隆抗體及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種可分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗 體的雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，主要通過埃及伊蚊傳播，登革病毒包括4種血 清型（I?IV型），任何型別的登革病毒感染均可引起一系列的臨床癥狀，表現(xiàn)為隱形感 染、發(fā)熱、登革熱或更為嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合征。登革病毒主要流行于熱帶和 亞熱帶地區(qū)，目前，全球有超過100個國家報告了登革熱疫情，25億人生活在感染的高危地 區(qū)，每年有5千萬?一億的病例報告，其中有20萬?50萬例登革熱感染成為登革出血熱。 在登革疫區(qū)中，多見4型登革病毒交替流行，更增加了不同型別反復(fù)感染的危險性。從發(fā)病 率、死亡率和經(jīng)濟(jì)成本來說，登革熱是世界上通過蚊媒傳播的最嚴(yán)重的病毒性疾病。初次感 染登革病毒所獲得的免疫力對于同型病毒的再次感染可產(chǎn)生終身的免疫保護(hù)作用，但是對 于其它型別登革病毒的再次感染僅能產(chǎn)生部分而且短暫的免疫保護(hù)作用。由于存在抗體依 賴的感染增強(qiáng)作用，異型登革病毒再次感染是發(fā)生登革出血熱/登革休克綜合征的主要危 險因素。
[0003] 登革病毒基因組為單股正鏈RNA，由11000個核巧酸組成，病毒有3種結(jié)構(gòu)蛋白和 7種非結(jié)構(gòu)蛋白。編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因區(qū)集中于5'端，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因區(qū)位于3' 端，其順序為；5, C - PreM - M - E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3,。目前使用的登 革熱診斷試劑主要是W全病毒或者重組E蛋白為抗原，檢測抗登革病毒的IgM和IgG抗體。 由于黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白之間具有共同抗原決定簇，存在交叉反應(yīng)，用登革病毒結(jié)構(gòu)蛋白為抗 原的診斷試劑不能很好地滿足臨床診斷需要。NSl蛋白是登革病毒的一種非結(jié)構(gòu)糖蛋白，在 登革發(fā)病早期的血清中可W檢測到登革病毒NSl蛋白，且其出現(xiàn)時間早于IgM抗體，因此檢 測急性期病人血清中的NSl抗原可用于早期診斷登革病毒感染。并且，有研究表明及早的 臨床處理可W減少登革出血熱的發(fā)病率和致死率，那么，在尚未成功研制具有保護(hù)性的登 革病毒疫苗和建立具有特異性的治療措施W前，登革熱的早期診斷就顯得尤為重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要提供一種可W用于II型登革病毒早期檢測的II型登革病毒檢測 試劑盒，W及可應(yīng)用在該II型登革病毒檢測試劑盒中的可分泌抗II型登革病毒NSl單克 隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及應(yīng)用。
[0005] -種可分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，保藏號為CCTCC No : C2014183。
[0006] 上述的雜交瘤細(xì)胞在制備II型登革病毒檢測試劑或II型登革病毒檢測設(shè)備中的 應(yīng)用。
[0007] 在一個實施例中，所述抗II型登革病毒NSl單克隆抗體記為DN2-25，DN2-25作為 檢測抗體。
[0008] -種可分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，保藏號為CCTCC No : C2014182。
[0009] 上述的抗II型登革病毒NSl單克隆抗體在制備II型登革病毒檢測試劑或檢測設(shè) 備中的應(yīng)用。
[0010] 在一個實施例中，所述抗II型登革病毒NSl單克隆抗體記為DN2-9，DN2-9作為捕 獲抗體。
[0011] 一種II型登革病毒檢測試紙，包括上述的DN2-25和如權(quán)利要求6所述的DN2-9。
[0012] 在一個實施例中，包括支撐薄片、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線 及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸收墊從所述支撐薄片的一 端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo)墊 與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊部分重疊，所述檢測線及 所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測線設(shè)在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì) 控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂覆有DN2-25包附膠體金顆粒形成的膠 體金標(biāo)記的單克隆抗體，所述檢測線為DN2-9,所述質(zhì)控線為羊抗鼠IgG抗體。
[0013] 一種II型登革病毒檢測試劑盒，包括上述的II型登革病毒檢測試紙。
[0014] 上述雜交瘤細(xì)胞的分泌產(chǎn)量高，分泌得到的抗登革病毒NSl單克隆抗體具有高敏 感性、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在制備登革熱早期分型診斷的檢測領(lǐng)域，如檢測試劑或 檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等，可W實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速地檢測出II型登革病毒，而與其它I型、III型 和IV型登革病毒無交叉，有利于對II型登革病毒作出早期分型診斷，且在特異性、靈敏度 等方面較之傳統(tǒng)的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢，可W應(yīng)用于II型登革病毒早期檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為一實施方式的檢測試紙的正面示意圖；
[0016] 圖2為圖1中檢測試紙的縱截面示意圖；
[0017] 圖3為檢測試劑盒示意圖；
[001引 圖4為實施例1中化曲five細(xì)胞表達(dá)的NSl蛋白的SDS-PAGE照片；
[0019] 圖5為實施例1中小鼠腹水提取的純化的DN2-25和純化的DN2-9的SDS-PAGE照 片。

【具體實施方式】
[0020] 下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對可分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0021] 一實施方式的可分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞于2013年11 月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中也（CCTCC)，保藏號為CCTCC No ;C2014183。該雜交 瘤細(xì)胞可分泌出抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的單克隆抗體，記為DN2-25, DN2-25可W 作為檢測抗體。DN2-25可W應(yīng)用于II型登革病毒檢測試劑或I型登革病毒檢測設(shè)備的制 備領(lǐng)域中。
[0022] 另一實施方式的可分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞于2013年 11月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中也（CCTCC)，保藏號為CCTCC No ;C2014182。該雜 交瘤細(xì)胞也可分泌出抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的單克隆抗體，記為DN2-9, DN2-9可 W作為捕獲抗體。DN2-9可W應(yīng)用于II型登革病毒檢測試劑或I型登革病毒檢測設(shè)備的制 備領(lǐng)域中。
[0023] -實施方式的II型登革病毒檢測試劑盒包括殼體、II型登革病毒檢測試紙和其 他檢測試劑。
[0024] 如圖1和圖2所示，本實施方式的II型登革病毒檢測試紙100包括支撐薄片110、 樣品墊120、金標(biāo)墊130、硝酸纖維素膜140、吸收墊150、檢測線160及質(zhì)控線170。樣品墊 120、金標(biāo)墊130、硝酸纖維素膜140及吸收墊150從支撐薄片110的一端向另一端依次設(shè)置 在支撐薄片110上。樣品墊120與金標(biāo)墊130部分重疊，金標(biāo)墊130與硝酸纖維素膜140部 分重疊，硝酸纖維素膜140與吸收墊150部分重疊。檢測線160及質(zhì)控線170設(shè)在硝酸纖 維素膜140上，且檢測線160設(shè)在靠近金標(biāo)墊130的一端，質(zhì)控線170設(shè)在靠近吸收墊150 的一端。支撐薄片110采用不吸水的材料制作。樣品墊120用于樣品點樣。金標(biāo)墊130上 涂覆有DN2-25包附膠體金顆粒形成的膠體金標(biāo)記的DN2-25。檢測線160為DN2-9。質(zhì)控 線170為羊抗鼠IgG抗體。
[0025] 如圖3所示，檢測試紙100可置于檢測試劑盒的殼體200內(nèi)。殼體200上開設(shè)有 加樣孔210及觀察窗220。加樣孔210對應(yīng)樣品墊120的位置。檢測線160及質(zhì)控線170 裸露于觀察窗220中，方便觀察。
[0026] 其他檢測試劑可W根據(jù)需要直接在實驗室制備。
[0027] 上述檢測試劑盒利用雙抗體夾也法來檢測被檢材料中的是否含有NSl蛋白。檢測 時，NSl蛋白先和膠體金標(biāo)記的DN2-25結(jié)合形成NSl-膠體金標(biāo)記的DN2-25復(fù)合物，由于 毛細(xì)管作用，NSl-膠體金標(biāo)記的DN2-25復(fù)合物沿硝酸纖維素膜140向前泳動，到達(dá)檢測線 160時，NSl-膠體金標(biāo)記的DN2-25復(fù)合物會與DN2-9結(jié)合，形成DN2-9-NS1-膠體金標(biāo)記的 DN2-25的復(fù)合物，從而富集在檢測線160上，形成紅色沉淀線。未結(jié)合NSl蛋白的膠體金標(biāo) 記的DN2-25則通過檢測線160,被羊抗鼠IgG抗體捕獲，富集在質(zhì)控線170上，形成紅色沉 淀線。當(dāng)檢測線160與質(zhì)控線170上同時有紅色沉淀線時判為陽性結(jié)果。若樣品中不含有 NSl蛋白，未結(jié)合NSl蛋白的膠體金標(biāo)記的DN2-25到達(dá)檢測線160時，不會形成DN2-9-NS1 蛋白-膠體金標(biāo)記的DN2-25復(fù)合物，未結(jié)合NSl蛋白的膠體金標(biāo)記的DN2-25通過檢測線 160,僅富集在質(zhì)控線170上形成紅色沉淀線，此時判為陰性結(jié)果。
[0028] 此外，在其他實施方式中，該檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)不限于上文描述。上述單克隆抗 體除應(yīng)用在上述膠體金標(biāo)記的單抗檢測試劑盒外，還可W用于其他II型登革病毒檢測試 劑盒或設(shè)備中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解，將本實施方式的單克隆抗體直接或間接結(jié)合其 他信號基團(tuán)（如磁性微球、辣根過氧化酶等），或?qū)⒈緦嵤┓绞降膯慰寺】贵w作為包被抗體 (例如化ISA)，則可用于其他形式的NSl蛋白檢測試劑或設(shè)備。故本實施方式所制備得到 的雜交瘤細(xì)胞及其分泌的單克隆抗體可廣泛適用于制備NSl蛋白檢測試劑或設(shè)備。
[0029] 通過使用上述雜交瘤細(xì)胞分泌的抗II型登革病毒NSl單克隆抗體，在標(biāo)記物為較 大的納米顆粒如膠體金、乳膠或其他納米顆粒類標(biāo)記物時，間接標(biāo)記可W降低標(biāo)記抗原的 使用量，在提高靈敏度的同時改善特異性。間接標(biāo)記相對于傳統(tǒng)雙抗原夾也法的兩部特異 識別而言相對于多了一步特異識別，即H步特異識別，可W提高檢測試劑盒的特異性，而且 相對標(biāo)記抗原的純度要求降低又可W降低檢測試劑盒的成本。通過使用上述抗II型登革 病毒NSl單克隆抗體，制備得到的試劑盒與現(xiàn)有II型登革病毒檢測試劑盒相比，在特異性、 靈敏度及檢出率方面都具有顯著的優(yōu)勢。
[0030] 下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對可分泌抗NSl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及相 關(guān)應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[00引]實施例1
[0032] 雜交瘤細(xì)胞的建立與抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的制備。
[0033] 1、免疫原的制備。
[0034] 用昆蟲細(xì)胞（本實施例中為S巧細(xì)胞和化曲Five細(xì)胞）表達(dá)的重組II型登革 病毒NSl蛋白作為免疫原。將II型登革病毒NSl基因（上海生工生物工程股份有限公司） 與桿狀病毒的基因組（購自上海英駿生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行同源重組，構(gòu)建攜帶II型登 革病毒NSl基因的桿狀病毒，再通過轉(zhuǎn)染S巧細(xì)胞（購自上海英駿生物技術(shù)有限公司，由本 公司保藏），對重組桿狀病毒進(jìn)行大量擴(kuò)增，將擴(kuò)增好的重組桿狀病毒感染化曲Five細(xì)胞 (購自上海英駿生物技術(shù)有限公司，由本公司保藏），通過化曲five細(xì)胞高效分泌表達(dá)目的 NSl蛋白。
[00巧]收集培養(yǎng)基上清，通過離子交換層析獲得純化的重組NSl蛋白，其SDS-PAGE分析 跑膠得到圖4。如圖4所示，泳道1為純化的重組NSl抗原，泳道2為蛋白Marker,純化的 重組NSl抗原的分子量約為40kD?50kD。
[0036] 2、抗原免疫。
[0037] 將昆蟲細(xì)胞表達(dá)的II型重組登革病毒NSl抗原（1. 3mg/ml，深圳市菲鵬生物股份 有限公司生產(chǎn)，貨號AG-DN2-NS1-HP 0002)與等體積的弗氏完全佐劑（外觀：玻巧色細(xì)胞 息浮液組份：Para巧in Oil 85%, Mannide Monooleate 15%, Mycobacterium smegmatis Img/ml)混合，得到油狀乳液。將該油狀乳液W 0. 2ml的劑量皮下施給BALB/c小鼠（廣州 省實驗動物中也，6周齡雌性，5只）背部位點，第一次免疫14天后腹腔增強(qiáng)免疫（抗原與 等量弗氏不完全佐劑混合），增強(qiáng)免疫到四針后，采尾血進(jìn)行效價檢測，效價達(dá)到融合要求。 [003引融合前3天，用相同劑量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。
[0039] 3、雜交瘤細(xì)胞的制備。
[0040] (1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備。
[0041] WBALB/c鼠腹腔巨瞻細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞。在融合前1天，將BALB/c鼠拉頸處死并 用75%酒精全身浸泡，在超凈臺內(nèi)，無菌操作下用剪刀剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器 腹腔注入RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液5ml，反復(fù)沖洗，回收沖洗液，IO(K)巧m，離也5分鐘，留沉淀， 用RPMI 1640篩選培養(yǎng)液（含HAT的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中）重息，調(diào)整細(xì)胞濃度1 X 1〇5 個/ml,加入96孔板，150y 1/孔，在37°C、5% (?環(huán)境中培養(yǎng)過夜。
[0042] (2)免疫脾細(xì)胞的制備。
[0043] 小鼠末次免疫后H天，在無菌條件下取出脾臟，置于平皿中，RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng) 液沖洗一次，放于小燒杯的尼龍網(wǎng)上磨碎過濾，制成細(xì)胞息液。離也，棄上清，RPMI 1640基 礎(chǔ)培養(yǎng)液重息，如此重復(fù)H次，得到免疫脾細(xì)胞，計數(shù)。
[0044] (3)骨髓瘤細(xì)胞的制備。
[0045] 將小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 (深圳市菲鵬生物股份有限公司保存）經(jīng)8-氮鳥嘿嶺篩 選后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取兩大瓶制成細(xì)胞息液，離也，棄上清，用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液 重息，如些重復(fù)H次，得到骨髓瘤細(xì)胞，計數(shù)。
[0046] (4)細(xì)胞融合及HAT選擇雜交瘤。
[0047] 將骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1:10的細(xì)胞數(shù)量比例混合，在50ml塑膠離也管內(nèi) 用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗1次，在120化pm下離也8分鐘，棄上清，將細(xì)胞混勻，緩慢加入 Iml 50%的陽G1500融合，融合1分鐘后加入15ml的RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細(xì)胞融合。 1000巧m，離也5分鐘，棄上清，用50ml的RPMI 1640篩選培養(yǎng)液輕輕混息，平分于10塊96 孔板，50 y 1/孔，在37C、5% C〇2環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第六天，換HT培養(yǎng)液（含HT的RPMI 1640完全培養(yǎng)液）兩次。
[004引 妨抗體的檢測。
[0049] 用0. 06M pH9. 6碳酸緩沖溶液稀釋重組II型登革病毒NSl抗原（深圳市菲鵬生 物股份有限公司生產(chǎn)，貨號AG-DN2-NS1-HP 0002)，使其終濃度為8 y g/ml。加入96孔聚苯 己帰板，每孔0. lml，37°C 2小時或4C過夜。次日，用含10%小牛血清或1%脫脂奶粉的 0. 02M抑7. 2PBS，0. 15ml/孔，37°C封閉2小時，用于檢測。重組融合后第走天，取細(xì)胞上清 0. Iml于上述96孔檢測板中，37C 30分鐘，水洗六次后加入2000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo) 記的羊抗鼠IgG(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號BA-PAB-MU0001)，37°C 30分鐘同 上洗后，每孔加入100 含0. 1% (M/V)鄰苯二胺，0. 1% (V/V)雙氧水，抑5.0巧樣酸磯酸 緩沖液，37C 15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50 y 1，巧Ij 450皿吸收值。RPMI 1640完全培養(yǎng) 液作為陰性對照，W測定值與對照值得比^ 2. 0為陽性細(xì)胞孔。
[0050] 分泌抗體陽性細(xì)胞孔W 1個細(xì)胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽 性孔依上法連續(xù)克隆H次，擴(kuò)大培養(yǎng)后，用含10% DMSO的培養(yǎng)液凍存，細(xì)胞密度為IO6個 /ml。細(xì)胞融合一次共獲得2株能穩(wěn)定分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的細(xì)胞株，于 2013年11月13日保藏在湖北省武漢市武昌巧珊山武漢大學(xué)保藏中也（即中國典型培養(yǎng)物 保藏中也），保藏號是分別為CCTCC No ;C2014183和CCTCC No ;C2014182,二者分別分泌單 抗DN2-25和單抗DN2-9。
[0051] 4、單克隆抗體的制備。
[005引選6?8周健壯的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0. 5ml的降植焼；10天后腹腔 注射IX 106個雜交瘤細(xì)胞。接種細(xì)胞7?10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況 與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中， 一般一只小鼠可獲5?IOml腹水。收集腹水，離也取上清，放于-2(TC冰箱保存。
[0053] 取腹水上清，用濾紙過濾。在所得的濾液中加入2倍腹水體積的0. 06M、pH4. 4己酸 軸緩沖液，一邊攬拌一邊按40ul/ml腹水體積逐滴緩慢加入辛酸，在室溫下攬拌反應(yīng)30min 后，離也30min，取上清經(jīng)定性濾紙過濾后，用IM化OH調(diào)抑至7. 4,再加入與上清相同體積 的飽和硫酸饋，4度反應(yīng)化，離也30min后，用適量的0. OlM抑7. 4PBS將沉淀復(fù)溶，再將復(fù) 溶液4C過夜透析，充分透析后的抗體用紫外分光光度法測量蛋白濃度，測定A280,蛋白濃 度計算公式為；C = A280/1. 4X稀釋倍數(shù)。
[0054] 5、效價測定。
[00巧]W間接化ISA法檢測，上述能穩(wěn)定分泌抗II型登革病毒NSl單克隆抗體的細(xì)胞株 培養(yǎng)上清效價2. 35 X lO3,腹水抗體效價I. 41 X lO6。具體實驗步驟如下：
[005引 （1)包被；將免疫的NSl抗原稀釋至8ug/ml，IOOul/孔加至酶標(biāo)板，37度2小時或 者4度過夜；
[0057] 似用洗板機(jī)洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20砂；最后拍干；
[0058] (3)用洗涂液洗去包被液，用封閉液封閉，每孔150ul，37度放置1.化-2h ;
[0059] (4)洗板機(jī)洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20砂；最后拍干；
[0060] (5)加樣品：分別將稀釋成不同梯度的細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水加入用NSl蛋白包被 好的酶標(biāo)板，IOOul/孔，37度反應(yīng)1小時（同時做陰性對照孔和陽性對照孔）；
[0061] (6)洗板機(jī)洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20砂；最后拍干；
[0062] (7)加辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(用封閉液稀釋2000倍），100ul/孔，37度 反應(yīng)1小時；
[0063] (8)洗板機(jī)洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20砂；最后拍干；
[0064] (9)加顯色液TMB ;即用即配，IOOul/孔，37度避光反應(yīng)30分鐘；
[0065] (10)終止反應(yīng)；于各反應(yīng)孔中加入2M的硫酸，50ul/孔；
[0066] (11)酶標(biāo)儀讀數(shù)；450nm，630nm波長測定，最終測定能穩(wěn)定分泌抗II型登革病毒 NSl單克隆抗體的細(xì)胞株培養(yǎng)上清與重組NSl抗原的反應(yīng)效價為2. 35 X 103,腹水抗體與重 組NSl抗原反應(yīng)效價為1. 41 X 1〇6。
[0067] 6、單克隆抗體特性鑒定。
[0068] (1)免疫球蛋白亞類鑒定。
[0069] 采用間接化ISA，包被純化好的重組II型登革病毒NSl抗原，封閉后與雜交瘤細(xì) 胞培養(yǎng)上清賠育，再分別與HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgM、IgGU IgG2a、IgG化和IgG3抗體反應(yīng)， 充分洗涂后TMB顯色，測A450值。結(jié)果顯示，本專利發(fā)明的兩株單抗，其中單抗DN2-25為 IgG2a，單抗DN2-9為IgM。為了進(jìn)一步確定兩株單抗的特性，分別進(jìn)行了 SDS-PAGE分析和 序列測定，具體見圖5。圖5中泳道1為蛋白Marker,泳道2為純化的DN2-25,泳道3為純 化的DN2-9。測得的DN2-25的基因序列包括重鏈序列和輕鏈序列，DN2-25的重鏈序列如 SEQ ID NO. 1所示，DN2-25的輕鏈序列如SEQ ID NO. 2所示。測得的DN2-9的基因序列包 括重鏈序列和輕鏈序列DN2-9的重鏈序列如SEQ ID NO. 3所示，DN2-9的輕鏈序列如SEQ ID NO. 4 所示。
[0070] (2)單克隆抗體特異性鑒定。
[0071] 采用間接化ISA法，分別用4個型的重組登革病毒NSl抗原和天然的登革病毒培 養(yǎng)液包被微孔板，按照常規(guī)間接化ISA法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示本專利發(fā)明的兩株單克隆抗 體均為II型特異性單抗。
[0072] (3)單克隆抗體競爭表位分析。
[0073] 采用競爭抑制實驗。純化的NSl蛋白lug/ml包被酶標(biāo)板，先加入Img/ml純化的 單抗50ul，再加入稀釋的生物素標(biāo)記單抗50ul，37°C賠育比后用0. 5% Tween 20的PBS 洗板，加入lOOulHRP標(biāo)記親和素，26°C賠育30min后洗板，TMB顯色，測定A450值。W單抗 對同一生物素標(biāo)記單抗的抑制為陽性對照，W已知的無關(guān)單抗對標(biāo)記單抗的抑制為陰性對 照，計算各單抗間的抑制率。抑制率計算公式為：（1-各孔測定值/陰性對照值）X100。抑 制率> 75%判定為表位相關(guān)，> 50%為不完全相關(guān)，< 50%為不相關(guān)，< 25%為完全不相 關(guān)。結(jié)果顯示2株單抗識別2個不完全相同的抗原位點。
[0074] 實施例2
[00巧]II型登革病毒NSl抗原膠體金檢測試紙的制備。
[0076] 1、硝酸纖維素膜的制備
[0077] 包被緩沖液的配制；含6%甲醇、0. OlM抑7. 2PBS緩沖液為包被緩沖液，0.22 Um 膜濾過，置4°C備用，有效期一周。IOOOml 6%甲醇的0. OlM pH 7. 2PBS緩沖液配方；化化 8g、K化0.2徑、化2冊〇4. 12&0 2.9徑、皿2口〇4〇.2徑、甲醇6〇1111，雙蒸去離子水定容至100〇1111。
[0078] 硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液將實施例1制得的單克隆抗體DN2-9稀釋到 1?5mg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為T線，即為檢測線，T線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm ;用 包被緩沖液將羊抗鼠IgG抗體（深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號BA-PAB-MU0001) 稀釋到1?5mg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為C線，即為控制線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。 兩線距離5?8mm，均勻。37°C烘干，封裝備用。
[0079] 2、膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備。
[0080] (1)溶液的配制。
[0081] ①氯金酸的配制；用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4C備用，有效期 四個月。IOOOml 1%氯金酸溶液配方；IOg氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。
[0082] ②巧樣酸H軸的配制：用雙蒸去離子水溶解巧樣酸軸，配成1 %溶液，0.22um膜 濾過，置4度備用，有效期容至IOOOml。
[0083] ③0. IM碳酸鐘的配制：用雙蒸去離子水配制，0.22 ym膜濾過，置4度備用，有效 期四個月。IOOOmlO. IM碳酸鐘溶液配方；13. Sg碳酸鐘；雙蒸去離子水定容至1000ml。
[0084] ④2%陽G-20000的配制：用雙蒸去離子水配制，0.22ym膜濾過，置4°C備用， 有效期四個月。IOOOml 2%陽G-20000溶液配方；20g陽G-20000;雙蒸去離子水定容至 1000ml。
[0085] ⑥標(biāo)記洗涂保存液的配制；2%牛血清白蛋白炬SA)，0. 05%疊氮軸（NaNs)，0. OlM pH7. 2PBS溶液，0. 22y膜濾過，置4°C備化有效期四個月。IOOOml標(biāo)記洗涂保存液配方： 20g BSA，0. 5g NaN3、0. OlM 抑7. 2PBS 溶液定容至 1000ml。
[0086] (2)膠體金的制備。
[0087] 用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每IOOml 0.01%氯 金酸加入2ml 1 %巧樣酸H軸，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ) 足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。
[008引 （3)膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備。
[0089] 用0. IM碳酸鐘調(diào)膠體金的抑值至8. 2,按8?10 U g抗體/ml膠體金加入實施 例1中制備得到的單克隆抗體DN2-25,磁力攬拌器混勻30min，攬拌下加入BSA至終濃度為 1 %靜置1小時。13000巧m、4°C離也30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗涂保存液洗涂兩次，用十 分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗涂保存液將沉淀重息，置4C備用，有效期一周。
[0090] 3、金標(biāo)墊的制備
[0091] (1)封閉液的配制。
[0092] 2% BSA，0. 1 % TritonX-100、0. 05% 化Ns, 0. OlM 抑7. 2PBS 溶液，0. 22 U m膜濾過， 置4度備用，有效期四個月。IOOOml封閉液配方；20g BSA，0. 5g NaNsUml TritonX-100、 0. OlM抑7. 2PBS溶液定容至1000ml。
[0093] (2)金標(biāo)墊的制備。
[0094] 將金標(biāo)墊浸泡于封閉液中30min后，于37C烘干。然后將制備好的金標(biāo)記抗體均 勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4C備用。
[0095] 4、試紙條樣品墊的制備
[0096] (1)封閉液的配制。
[0097] 2% BSA，0. 1 % TrtionX-100、0. 05% 化Ns, 0. OlM pH7. 2PBS 溶液，0. 22 U m膜濾過， 置4度備用，有效期四個月。IOOOml封閉液配方；20g BSA，0. 5g NaNsUml TrtionX-100、 0. OlM抑7. 2PBS溶液定容至1000ml。
[009引 （2)樣品墊的制備。
[0099] 將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37C烘干，封裝，置4C備用。
[0100] 5.檢測試紙的組裝
[0101] 將吸收墊（購自Millipore公司）、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊設(shè)置在不吸水 的支撐薄片上，切成3mm寬的小條。每十小條一包，加入干燥劑，真空封裝，得到所述檢測試 紙。
[0102] 實施例3
[0103] 檢測II型登革病毒NSl蛋白的試劑盒。
[0104] 1、快速檢測II型登革病毒NSl蛋白的試劑盒包括；實施例2制作的檢測試紙及樣 品稀釋液。
[0105] 樣品稀釋液為8%化Cl溶液。配制方法=SOgNaCl，加蒸觸水定容至1000ml。
[0106] 2、膠體金法檢測II型登革病毒NSl蛋白。
[0107] (1)直接吸取120 采集好的人血清或血漿加入到試紙卡加樣孔，等待15min后 即可觀察結(jié)果。
[0108] (2)結(jié)果判定：當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紅色 檢測線，結(jié)果判為陰性；當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紅色質(zhì)控線，同時也出現(xiàn)肉眼可見的紅色 檢測線，結(jié)果判為陽性。檢測線顏色越深說明被檢測樣品的II型登革病毒NSl蛋白水平越 高。當(dāng)試紙條沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，不管有沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測 線，結(jié)果都判為檢測試紙條失效，應(yīng)廢棄。
[0109] 實施例4
[0110] 快速檢測II型登革病毒NSl蛋白試劑盒的應(yīng)用。
[0111] W Panbio Dengue Early ELISA試劑盒巧-DEN02巧檢出的NSl陽性樣本和陰性 樣本作為本試劑盒的檢測樣本，其中89例登革NSl檢出陽性樣本，500例檢出陰性樣本，89 例陽性標(biāo)本再通過商品化的登革病毒分型多重PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR分型檢測，其中37 份為II型登革病毒，剩下的52份陽性標(biāo)本中18份為I型登革病毒、13份為III型登革病 毒、21份為IV型登革病毒。采用本專利發(fā)明的II型登革病毒NSl檢測試劑盒檢測上述89 份陽性樣本和500份陰性樣本，檢出結(jié)果見表1。
[0112] 表1 ;實施例3的II型登革病毒NSl檢測試劑盒的檢測結(jié)果 [011 引

【權(quán)利要求】
1. 一種可分泌抗II型登革病毒NS1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，保藏號為 CCTCC No ：C2014183〇
2. 如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞在制備II型登革病毒檢測試劑或II型登革病毒檢 測設(shè)備中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗II型登革病毒NS1單克隆抗體，其特征在 于，所述抗II型登革病毒NS1單克隆抗體記為DN2-25。
4. 一種可分泌抗II型登革病毒NS1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，保藏號為 CCTCC No ：C2014182〇
5. 如權(quán)利要求4所述的抗II型登革病毒NS1單克隆抗體在制備II型登革病毒檢測試 劑或檢測設(shè)備中的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗II型登革病毒NS1單克隆抗體，其特征在 于，所述抗II型登革病毒NS1單克隆抗體記為DN2-9。
7. -種II型登革病毒檢測試紙，其特征在于，包括如權(quán)利要求3所述的DN2-25和如權(quán) 利要求6所述的DN2-9。
8. 如權(quán)利要求7所述的II型登革病毒檢測試紙，其特征在于，包括支撐薄片、樣品墊、 金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維 素膜及所述吸收墊從所述支撐薄片的一端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品 墊與所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜 與所述吸收墊部分重疊，所述檢測線及所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測 線設(shè)在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì)控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂 覆有DN2-25包附膠體金顆粒形成的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體，所述檢測線為DN2-9,所述 質(zhì)控線為羊抗鼠IgG抗體。
9. 一種II型登革病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求7或8所述的II型登 革病毒檢測試紙。
【文檔編號】C12N5/20GK104357401SQ201410606685
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】楊耿周, 朱碧銀, 龔春喜, 霍永庭, 馮瓊, 李可國, 范凌云, 彭亮, 韓日才, 劉德榮 申請人:深圳市菲鵬生物股份有限公司