莖瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了莖瘤芥來源的抗逆基因BjEFh1及其植物表達(dá)載體及應(yīng)用。本發(fā)明抗逆基因BjEFh1，其堿基序列如SEQ ID NO.1；本發(fā)明所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-BjEFh1是由SEQ ID NO.1序列連入植物表達(dá)載體pCAMBIA1302構(gòu)成；所述植物表達(dá)載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，BjEFh1基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達(dá)，大量合成BjEFh1蛋白，從而提高植物耐逆境能力。
【專利說明】莖瘤芥抗逆基因BjEFhl及其植物表達(dá)載體及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及莖瘤芥來源的抗逆基因BjEFhl及其植物表 達(dá)載體及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫對作物的產(chǎn)量及生長發(fā)育有很大影響，因此，有關(guān) 植物抗逆性的研究一直是植物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
[0003] 莖瘤芥（Brassicajunceavar.tumidaTsenetLee)，又稱青菜頭，是十字花科 蕓薹屬植物，為榨菜的主要原料，是我國重慶、四川、浙江等地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一。多年 來，莖瘤芥的相關(guān)研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術(shù)、品質(zhì)安全等領(lǐng)域，近年才 陸續(xù)有生物學(xué)方面研究的報(bào)道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關(guān)研 究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產(chǎn)量、質(zhì)量以及抗病性、抗逆性等。
[0004] 鈣離子信號在許多細(xì)胞活動，如細(xì)胞代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞骨架動態(tài)變化、細(xì)胞周 期、細(xì)胞死亡、信號傳導(dǎo)等過程中有重要作用。
[0005] 在植物細(xì)胞中，鈣離子的作用之一是作為第二信使，很多外界環(huán)境信號，如光、生 物脅迫、非生物脅迫、植物激素等都會刺激胞液中Ca2+濃度的增加，從而引發(fā)鈣離子信號傳 導(dǎo)。鈣離子信號傳導(dǎo)途徑中首先響應(yīng)的即是能結(jié)合Ca2+的鈣結(jié)合蛋白，其結(jié)合Ca2+以后會 發(fā)生構(gòu)想變化，使疏水面外露，從而激活或抑制其它蛋白的活性，從而引發(fā)信號傳導(dǎo)。具報(bào) 道，鈣結(jié)合蛋白包括鈣調(diào)素、類鈣調(diào)蛋白、鈣依賴蛋白激酶等，其中對鈣調(diào)素功能研究的報(bào) 道最多；但對類鈣調(diào)蛋白、鈣依賴蛋白激酶的功能研究較少，其分子機(jī)理研究更少報(bào)道。
[0006] 本發(fā)明克隆了一個莖瘤芥基因BjEFhl，由于其含有1對EF-hand(簡稱EFh)結(jié)構(gòu) 域，而EFh結(jié)構(gòu)域通常是可能結(jié)合鈣離子的結(jié)構(gòu)基序，目前報(bào)道的鈣結(jié)合蛋白中，通常具有 1-3對EFh結(jié)構(gòu)域，因此推測本發(fā)明克隆的莖瘤芥抗逆基因BjEFhl為鈣結(jié)合蛋白家族基因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供莖瘤芥抗逆基因BjEFhl，該基因全長821bp，其 核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示；通過NCBI的0RF工具檢測知其最大開放閱讀框570bp， 如SEQIDNO. 1所示；因此，其5'端非編碼區(qū)有88bp，3'端非編碼區(qū)有163bp。
[0008] 本發(fā)明的目的之二是提供莖瘤芥抗逆基因蛋白，其氨基酸序列為SEQIDNO. 3所 示，有189個氨基酸，且序列通過NCBI的保守結(jié)構(gòu)域（conserveddomains)檢測知具有1 對EF-hand結(jié)構(gòu)域。
[0009] 本發(fā)明的目的之三是提供莖瘤芥抗逆基因BjEFhl的重組植物表達(dá)載體 pCAMBIA1302-BjEFhl，其由SEQIDNO. 1序列連入植物表達(dá)載體pCAMBIA1302構(gòu)成。
[0010] 本發(fā)明的目的之四是提供莖瘤芥抗逆基因BjEFhl在提高植物耐逆境特性中的應(yīng) 用，尤其是提高植物在高鹽條件的耐受力。
[0011] 本發(fā)明通過莖瘤芥轉(zhuǎn)錄組測序獲得序列片段SEQIDN0. 4,然后根據(jù)片段SEQID NO. 4設(shè)計(jì)巢式引物并通過RACE方法擴(kuò)增獲得莖瘤芥抗逆基因BjEFhl，基因編碼189個氨 基酸，NCBI比對預(yù)測具有1對EF-hand結(jié)構(gòu)域，推測屬于鈣結(jié)合蛋白家族成員；通過構(gòu)建 BjEFhl基因植物表達(dá)載體，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐逆境新種質(zhì)，提高植 物的逆境耐受力特性，尤其是耐鹽特性，可進(jìn)行植物品種改良。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明BjEFhl基因編碼區(qū)序列PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0013] 圖2為本發(fā)明重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-BjEFhl的構(gòu)建流程圖；
[0014] 圖3為本發(fā)明T1代轉(zhuǎn)BjEFhl基因擬南芥在含潮霉素（25mg/L)的MS培養(yǎng)基上的 篩選攝影圖；
[0015] 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因型擬南芥和野生型中的BjEFhl基因表達(dá)水平檢測圖；
[0016] 圖5為本發(fā)明正常條件下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)圖；
[0017] 圖6為本發(fā)明NaCl條件下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)圖；
[0018] 圖7為本發(fā)明NaCl條件下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥根的長度統(tǒng)計(jì)圖；
[0019] 圖8為本發(fā)明NaCl條件下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥根的生長對比攝影圖；
[0020] 圖9為本發(fā)明NaCl條件下轉(zhuǎn)BjEFhl基因擬南芥和野生型擬南芥耐鹽能力對比攝 影圖；
[0021] 圖10為本發(fā)明NaCl條件下野生型與轉(zhuǎn)基因型擬南芥的存活率統(tǒng)計(jì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例和附圖僅起說明性作 用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明不限于下述實(shí)施方式或?qū)嵤├?，凡不違背本發(fā)明 精神所做出的修改及變形，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0023] 實(shí)驗(yàn)例1 :莖瘤芥抗逆基因BjEFhl的克隆
[0024] 1主要試劑：柱式小量植物總RNA抽提試劑盒（W7021)購自上海華舜生物技術(shù) 有限公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；5'-FullRACEKit試劑盒、 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、PremixExTaq、DL2000DNAMarker、pMD19-T載體均購自大連寶生物工程 有限公司。
[0025] 2實(shí)驗(yàn)方法與步驟
[0026] BjEFhl基因序列片段SEQIDN0. 4的獲取：采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒 方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA，總RNA取小部分通過紫外分光光度計(jì)檢測0D260/0D280 的比值為1. 93,通過瓊脂糖凝膠電泳28S的亮度約是18S的2倍，說明RNA的純度高且無降 解，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。將總RNA樣品送北京華大基因研究中心進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq)，方 法為用帶有Oligo(dT)的磁珠富集莖瘤芥總RNA中的mRNA，加入fragmentationbuffer將 mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖 液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuickPCR試劑 盒（Qiagen公司）純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly(A)并連接測序接頭， 然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測序文庫（200bp)用 IlluminaHiSeqTM2000進(jìn)行測序。通過對測序結(jié)果進(jìn)行注釋，選取可能的鈣結(jié)合蛋白片段 序列SEQIDNO. 4,然后根據(jù)該片段序列進(jìn)行基因全長的克隆以及功能分析。
[0027] 2.lBjEFhl基因5'端未知序列擴(kuò)增
[0028] 2. 1. 1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄：采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得 莖瘤芥瘤莖的總RNA，然后取約1yg總RNA通過5'-FullRACEKit試劑盒方法去磷酸化、 去帽子、加接頭，最后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。

【權(quán)利要求】
1. 莖瘤芥抗逆基因BjEFhl，其特征在于：其基因序列為SEQ ID NO. 1。
2. 莖瘤芥抗逆基因蛋白，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3所示。
3. 莖瘤芥抗逆基因BjEFhl的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-BjEFhl，其特征在于：由 權(quán)利要求1所述SEQ ID NO. 1序列連入植物表達(dá)載體pCAMBIA1302構(gòu)成。
4. 莖瘤芥抗逆基因BjEFhl在提高植物耐逆境特性的應(yīng)用，其特征在于：所述耐逆境特 性為耐鹽特性。
【文檔編號】C12N15/82GK104328127SQ201410606963
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】向?yàn)g欣, 汪露, 劉吉軍, 王小艷, 鄭慧, 鄧朝偉, 高翔 申請人:重慶郵電大學(xué)