一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應用。該棲木槿假單胞菌DT1保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO.M2014244。該棲木槿假單胞菌DT1在含有四環(huán)素的環(huán)境中具有較強的生長能力和良好的降解四環(huán)素的能力，該菌株能在72小時之內(nèi)有效去除廢水中的四環(huán)素，去除效率達到83.21wt%。本發(fā)明為降解四環(huán)素類有機污染物提供了有用的菌源，拓寬了對棲木槿假單胞菌功能方面的應用，具有較強的應用價值。CCTCC NO：M 201424420140604
【專利說明】一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應用。

【背景技術】
[0002]四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，其結構均含有并四苯基本骨架。四環(huán)素類抗生素是目前世界上使用最廣泛、用量最大的抗生素種類之一，近些年來，四環(huán)素類抗生素在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中作為獸藥和飼料添加劑被大量使用，然而這些抗生素未被完全吸收，大部分通過原藥和代謝產(chǎn)物的形式排除，其中80%的糞便未經(jīng)綜合處理施用于農(nóng)田，造成土壤污染。四環(huán)素類抗生素進入土壤環(huán)境后，通過吸附和分配作用長期存在于土壤環(huán)境中?？股卦诃h(huán)境中持續(xù)暴露對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的毒性效應:抑制微生物的生長代謝，誘發(fā)微生物抗性基因污染，破壞土壤中土著微生物群落結構及功能，抑制植物葉綠體活性和根系生長等。四環(huán)素對生態(tài)和人類健康的危害成為人們普遍關注的對象和研究的熱點，其相關研究也得到越來越多的重視。
[0003]四環(huán)素的降解途徑主要包括水解、光解和生物降解，其中，微生物降解是四環(huán)素的主要降解途徑，也是重要的驅(qū)動力之一。在微生物與污染物交互作用中，生物酶是污染物降解過程的直接參與者。微生物通過各類生物酶的作用將抗生素降解轉(zhuǎn)化為能源物質(zhì)或者對自身無毒害作用的其他代謝產(chǎn)物。因此，篩選到合適的高效的降解菌株顯得尤為重要。利用微生物酶的催化作用來處理有機污染物能有效的降低有毒有機污染物的含量，同時還能降低其毒性，因此，微生物降解是一種很有潛力的處理有機污染物的方法，在工業(yè)生產(chǎn)的各個方面具有很高的推廣價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應用。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術方案為:
[0006]一種水體四環(huán)素污染物降解菌，經(jīng)鑒定命名為棲木槿假單胞菌DT1，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年6月4，保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2014244。
[0007]該菌株的菌落形態(tài)特征以及生理生化特性為:菌落呈黃色、不透明、圓形、表面光滑，中間隆起、邊緣整齊；需氧，革蘭氏陰性菌，硝酸鹽可以還原成亞硝酸鹽；接觸酶陽性，氧化酶陽性，脲酶陽性；MR陽性，VP陰性；不產(chǎn)硫化氫，不能淀粉水解；能利用葡萄糖等碳源；最適生長pH值:6.5?9,最適生長溫度:25?35°C。
[0008]上述棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物中的應用。
[0009]按上述方案，所述棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物的應用方法為:(I)挑取棲木槿假單胞菌DTl單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；(2)取棲木槿假單胞菌DTl菌液，將菌液以體積百分比為0.5%?2%的比例接種于含四環(huán)素污染物的廢水中，pH值調(diào)節(jié)為6?9，置于30?35°C的條件下恒溫培養(yǎng)48?72小時。
[0010]本發(fā)明的有益效果:與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述棲木槿假單胞菌DTl在含有四環(huán)素污染物的環(huán)境中具有較強的生長能力和良好的降解四環(huán)素的能力，該菌株能在72小時之內(nèi)有效降解廢水中的四環(huán)素有機污染物，降解率達到83.21wt%。本發(fā)明為降解四環(huán)素有機污染物提供了有用的菌源，同時拓寬了對棲木槿假單胞菌功能方面的應用，因此具有較強的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為棲木槿假單胞菌DTl的16S rDNA分子鑒定過程中PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(左為Marker ;右為擴增產(chǎn)物)。
[0012]圖2為棲木槿假單胞菌DTl的發(fā)育樹。

【具體實施方式】
[0013]為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實例。
[0014]實施例1棲木槿假單胞菌DTl的篩選:
[0015](一)、材料準備:
[0016]1、實驗土壤為模擬四環(huán)素污染的土壤，取自中國地質(zhì)大學。
[0017]2、培養(yǎng)基:
[0018]篩選培養(yǎng)基:10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，0.5g/L磷酸氫二鉀，1.5g/L瓊脂，pH值7。
[0019]液體富集培養(yǎng)基:10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，0.5g/L磷酸氫二鉀，pH值7。
[0020]LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,氯化鈉10.0g/L,蒸餾水100mL,ρΗ7.0。
[0021]LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,氯化鈉10.0g/L,蒸餾水100mL,瓊月旨 15g/L(固)，ρΗ7.0。
[0022]LB斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,氯化鈉10.0g/L,蒸餾水100mL,瓊脂 20g/L(固)，ρΗ7.0。
[0023]3、實驗儀器和設備:
[0024]國華SHA-B恒溫振蕩器，
[0025]東器SPX生化培養(yǎng)箱，
[0026]立式壓力蒸汽滅菌器，
[0027]光學顯微鏡-----Olympus有限公司，
[0028]pH 計等-----sarporiusPD-10
[0029]超凈工作臺，
[0030]PTC200 型 PCR 儀，
[0031]電泳儀及電泳槽，
[0032]UVP凝膠紫外觀測儀。
[0033]( 二 )、菌株的篩選分離與純化:
[0034]1、稱取I克四環(huán)素污染土壤樣品，加入事先滅菌好的裝有10mL無菌水的250mL的三角瓶內(nèi)，30°C、200rpm振蕩20min，備用；
[0035]2、配置濃度為1000mg/L的四環(huán)素母液，微濾除菌后，備用；
[0036]3、將10ul四環(huán)素母液加入20ml 50°C的篩選培養(yǎng)基中，搖勻并倒入無菌平板上，待培養(yǎng)基冷卻，即得到含50mg/L四環(huán)素的篩選培養(yǎng)基平板，將土壤水混合物樣品在含50mg/L四環(huán)素的篩選培養(yǎng)基平板上劃線分離，30°C恒溫培養(yǎng)幾天，直至有菌落出現(xiàn)；
[0037]4、將平板上的不同菌落分別在含50mg/L四環(huán)素的篩選培養(yǎng)基平板上劃線分純，30°C恒溫培養(yǎng)，反復劃線操作4-5次。
[0038]5、分別將不同平板上的單菌落挑入到液體富集培養(yǎng)基中，30°C恒溫震蕩培養(yǎng)2d，再以1%接種量加入含50mg/L四環(huán)素的液體富集培養(yǎng)基中(取2.5ml四環(huán)素母液加入到47.5ml液體富集培養(yǎng)基中得到含50mg/L四環(huán)素的液體富集培養(yǎng)基)，30°C避光震蕩培養(yǎng)3d，測定培養(yǎng)基中四環(huán)素含量，淘汰不能降解四環(huán)素的菌株，得到一株能高效降解四環(huán)素的菌株，將此菌株置于甘油管中_20°C條件下冷凍保藏。
[0039]二、菌株的16S rDNA分子鑒定:
[0040]16S rDNA分子鑒定主要按照以下步驟:
[0041](I)細菌核DNA的提取
[0042]使用北京百泰克生物技術有限公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA提取試劑盒，
[0043](2) 16S rDNA 基因的 PCR 擴增，
[0044]由上海桑尼生物工程有限公司合成細菌的通用引物
[0045]27F: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
[0046]1492R: 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
[0047]在50yL 反應體積中，加入 IyL 模板 DNA(0.lyg)，L5yL 27F 和 1492R(終濃度為 10μΜ)，1μ? dNTP(lOmM)，I μ LTaq 聚合酶(5U/y L)和 5μ L 10XPCR 緩沖液，39 μ L ddH20。PCR 擴增條件為:95°C預變性 5min ;在 95°C變性 30s，58。。退火 30s，72。。延伸lmin30s，循環(huán)35次；最后72°C終延伸1min0
[0048](3) PCR產(chǎn)物的回收
[0049]將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳后(擴增帶長度為1412bp，如圖1所示)，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5mL離心管中加2倍體積TE，65°C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的lOmol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用濃度為70%乙醇洗沉淀一次，風干后溶于適量滅菌雙蒸水。(4)16S rDNA的序列的測定和分析
[0050]取菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用測序儀ABI3730-XL進行DNA測序，其序列見SEQID NO:1。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，該菌株與棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)的同源性高達99.0%,最終從分子水平上確定該菌的種屬為棲木槿假單胞菌。
[0051]三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性:
[0052]棲木槿假單胞菌DTl的菌落形態(tài)為:菌落呈黃色、不透明、圓形、表面光滑，中間隆起、邊緣整齊；需氧，革蘭氏陰性菌；硝酸鹽可以還原成亞硝酸鹽；接觸酶陽性，氧化酶陽性，脲酶陽性；MR陽性，VP陰性；不產(chǎn)硫化氫，不能淀粉水解；能利用葡萄糖等碳源；最適生長pH值:6.5?9，最適生長溫度:25?35°C。
[0053]綜合菌株的分子鑒定結果以及生理生化特性，確定該菌株為棲木槿假單胞菌，并命名為棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)DTl。棲木槿假單胞菌DTl的發(fā)育樹見圖2。從圖2可以看到，菌株DTl的16S rDNA序列和假單胞菌屬的細菌歸屬于同一簇群，同源性在99%以上，且菌株DTl與Pseudomonas hibiscicola聚在一起，證明DTl菌株為棲木槿假單胞菌。查閱有關資料，尚無此菌株有關降解四環(huán)素能力研究的報道。棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)DTl,已于2014年6月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱 CCTCC)，保藏號:CCTCC N0:M 2014244。
[0054]本發(fā)明從模擬四環(huán)素長期污染土壤中篩選分離出這一株細菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解四環(huán)素的功能。這拓寬了人們對棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)在其功能方面的應用研究思路，并為環(huán)境中四環(huán)素污染的降解提供了有用的菌源和技術，具有較強的實際應用價值。
[0055]四、棲木槿假單胞菌DTl的應用:
[0056]挑取棲木樓假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola) DTl單菌落于LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，待平板菌落長出后挑選單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，按體積分數(shù)比為
0.5%-2%的接種量將棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)的種子液接種至含有四環(huán)素類污染物的模擬污水中，30?35°C恒溫培養(yǎng)，pH值為6.5?9，反應48?72小時。
[0057]五、棲木槿假單胞菌DTl降解四環(huán)素污染物的能力驗證:
[0058]分別挑取棲木槿假單胞菌DTl單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取0.5mL菌液接種于裝有50mL四環(huán)素模擬污水中(其四環(huán)素含量為50mg/L)的三角瓶中，留一瓶作空白對比。置于30°C、150rpm振蕩培養(yǎng)3d，檢測四環(huán)素殘留量計算菌株對四環(huán)素去除情況。該菌株能在72小時之內(nèi)有效去除四環(huán)素模擬污水中的四環(huán)素，其去除率為83.21wt%。
[0059]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1.一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌DT1，其特征在于，保藏號為CCTCCNO: M 2014244。
2.權利要求1所述的棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物中的應用方法為:(I)挑取棲木槿假單胞菌DTl單菌落，于LB液體養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；(2)取棲木槿假單胞菌DTl菌液，將菌液以體積百分比為0.59Γ2%的比例接種于含四環(huán)素污染物的廢水中，pH值調(diào)節(jié)為6?9，置于3(T35°C的條件下恒溫培養(yǎng)48?72小時。
【文檔編號】C12N1/20GK104403965SQ201410610014
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權日:2014年11月3日
【發(fā)明者】冷一非, 鮑建國 申請人:中國地質(zhì)大學（武漢）