一種來(lái)源于綠色巴夫藻的delta12去飽和酶新基因的制作方法
【專利摘要】多不飽和脂肪酸，如共軛亞油酸（CLA）、二十碳五烯酸（EPA）等，是人體必需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。針對(duì)于能夠自然合成大量多不飽和脂肪酸的一種微藻-綠色巴夫藻( Pavlovaviridis )，本申請(qǐng)使用了保守區(qū)序列擴(kuò)增和RACE相結(jié)合的方法克隆獲得了一種新的delta12脂肪酸去飽和酶的基因。該基因的獲得為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和利用極有現(xiàn)實(shí)意義的亞油酸和共軛亞油酸的生物合成過(guò)程提供了依據(jù)。
【專利說(shuō)明】-種來(lái)源于綠色巴夫藻的delta12去飽和酶新基因

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)屬于基因克隆分離的【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及于一種來(lái)源于微藻的有關(guān)多不 飽和脂肪酸合成的去飽和酶基因及其分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微藻因富含多不飽和脂肪酸而成 為重要的生物資源。綠色巴夫藻（Pavlova viridis)含有豐富的多不飽和脂肪酸，是進(jìn)行 多不飽和脂肪酸相關(guān)合成基因識(shí)別與克隆的良好實(shí)驗(yàn)材料。
[0003] RACE 全稱 rapid-amplification of cDNA ends，是一種常用的通過(guò) PCR 進(jìn)行 cDNA 末端快速克隆的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用RACE技術(shù)來(lái)獲得目的mRNA片段的全長(zhǎng)序列。
[0004] 在微藻的多不飽和脂肪酸的體內(nèi)合成途徑中，起到最關(guān)鍵作用的是多不飽和脂肪 酸去飽和酶和多不飽和脂肪酸延伸酶兩大酶類。但由于其為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的膜蛋白，上述 酶類在分子水平上的研究受到很大限制。其中，deltal2去飽和酶是催化油酸(十八碳一烯 酸）生成亞油酸(十八碳二烯酸）的關(guān)鍵酶，該酶因直接催化了單不飽和脂肪酸和多不飽和 脂肪酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程而具有較大的研究?jī)r(jià)值。目前在微藻中已經(jīng)有數(shù)個(gè)來(lái)自于不同物種的 deltal2去飽和酶獲得了分離和識(shí)別，但不同物種的同源酶顯然都存在序列上和結(jié)構(gòu)上的 差異，進(jìn)而導(dǎo)致其酶活性和功能的不同。因此，從綠色巴夫藻中分離得到其deltal2去飽和 酶的同源酶是對(duì)該部分研究資源的很好補(bǔ)充，本申請(qǐng)就試圖從這個(gè)角度展開相關(guān)的工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 綠色巴夫藻（/?Wora. ririi/is)為常用微藻，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院青島海洋研究 所。
[0006] 綠色巴夫藻deltal2去飽和酶基因的分離過(guò)程為： (1) 利用本領(lǐng)域常規(guī)的mRNA提取分離手段獲得綠色巴夫藻的總mRNA，并使用引物 OligodT以本領(lǐng)域常規(guī)手段將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA; (2) 使用cDNA作為模板，根據(jù)deltal2去飽和酶同源基因的保守性設(shè)計(jì)引物P12F、 卩121?來(lái)進(jìn)行保守區(qū)基因的擴(kuò)增，其引物序列為：？12? :5'-〇^0661661^111^^66-3'； P12R: 5'-CATGACACAACATCTGAAGA-3'； PCR反應(yīng)條件為：94oC 3 min;94oC 30 s, 57oC 30 s, 72oC I min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min;所獲PCR產(chǎn)物大小約為449bp; (3) 3'末端的擴(kuò)增反應(yīng)以cDNA為模板、使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒 來(lái)進(jìn)行，使用的擴(kuò)增引物分別是：UPM (IOXuniversal primer mix) ; desl2_3 GGCAGGCTCGGGCATCCTGT。梯度 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70〇C 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3 min，30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲PCR產(chǎn)物大小約為550 bp. (4) 5'末端的擴(kuò)增反應(yīng)使用總mRNA為模板并使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒來(lái)進(jìn) 行，使用的引物分別為：UPM5'（IOXuniversal primer mix); GSPl GCGGCACGGACATCGATGA; GSP2 AATCACCCAGACGCCTGTC。反應(yīng)程序?yàn)椋杭尤?GSPl 于 mRNA 中后以 94oC 3 min; 94oC 30 s，60〇C 30s，72oCl min反應(yīng)1個(gè)循環(huán)；隨后加入TdT于37oC反應(yīng)30min獲得特定末端 產(chǎn)物；然后向體系中加入U(xiǎn)PM5'和GSP2，以如下程序完成反應(yīng)：94oC 3 min; 94oC 30 s， 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70〇C 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3 min，30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲目的片段約為670bp。
[0007] 以上所有的片段均連入pMD18T載體后進(jìn)行測(cè)序后拼接。
[0008] (5)開放閱讀框的擴(kuò)增：在經(jīng)過(guò)拼接獲得了表達(dá)基因的全長(zhǎng)之后，分別設(shè)計(jì)上 下游引物 ATGGGGAAGAAGGCTGTTACC 和 TCAAGCGAATATGCTTTTACA，經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得完整的 deltal2 開放閱讀框片段。PCR 反應(yīng)條件為：94oC 3 min;94oC 30 s, 60〇C 30 s, 72oC 1 min, 30個(gè)循環(huán)；72oC IOmin;片段大小為1263bp。
[0009] 最終所得來(lái)自綠色巴夫藻的推定的多不飽和脂肪酸deltal2去飽和酶的全長(zhǎng) 多核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該基因所編碼的氨基酸序列與來(lái)自于Lobosphaera incise的deltal2去飽和酶的活性區(qū)域具有較高的序列相似性(如圖1所示)，并經(jīng)過(guò)在畢 赤酵母中的異源表達(dá)功能驗(yàn)證，證實(shí)其為一種多不飽和脂肪酸deltal2去飽和酶。
[0010] 本申請(qǐng)首次從綠色巴夫藻的基因組中分離獲得了多不飽和脂肪酸deltal2去飽 和酶基因，豐富了該類酶的重要的基因資源，為進(jìn)一步研究該酶的體內(nèi)和體外的作用機(jī)制 奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖 1 SEQ ID No. 1所編碼的氛基酸序列與來(lái)自Lobosphaera incise的deltal2去飽和酶 的比對(duì)結(jié)果(僅展示催化活性中心序列的比對(duì)結(jié)果）

【具體實(shí)施方式】
[0012] 綠色巴夫藻deltal2去飽和酶基因的分離過(guò)程為： (1) 利用本領(lǐng)域常規(guī)的mRNA提取分離手段獲得綠色巴夫藻的總mRNA，并使用引物 OligodT以本領(lǐng)域常規(guī)手段將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA; (2) 使用cDNA作為模板，根據(jù)deltal2去飽和酶同源基因的保守性設(shè)計(jì)引物P12F、 卩121?來(lái)進(jìn)行保守區(qū)基因的擴(kuò)增，其引物序列為：？12? :5'-〇^0661661^111^^66-3'； P12R: 5'-CATGACACAACATCTGAAGA-3'； PCR反應(yīng)條件為：94oC 3 min;94oC 30 s, 57oC 30 s, 72oC I min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min;所獲PCR產(chǎn)物大小約為449bp; (3) 3'末端的擴(kuò)增反應(yīng)以cDNA為模板、使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒 來(lái)進(jìn)行，使用的擴(kuò)增引物分別是：UPM (IOXuniversal primer mix) ; desl2_3 GGCAGGCTCGGGCATCCTGT。梯度 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70〇C 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3 min，30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲PCR產(chǎn)物大小約為650 bp. (4) 5'末端的擴(kuò)增反應(yīng)使用總mRNA為模板并使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒來(lái)進(jìn) 行，使用的引物分別為：UPM5'（IOXuniversal primer mix); GSPl GCGGCACGGACATCGATGA; GSP2 AATCACCCAGACGCCTGTC。反應(yīng)程序?yàn)椋杭尤?GSPl 于 mRNA 中后以 94oC 3 min; 94oC 30 s，60〇C 30s，72oCl min反應(yīng)1個(gè)循環(huán)；隨后加入TdT于37oC反應(yīng)30min獲得特定末端 產(chǎn)物；然后向體系中加入U(xiǎn)PM5'和GSP2，以如下程序完成反應(yīng)：94oC 3 min; 94oC 30 s， 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70〇C 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3 min，30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲目的片段約為670bp。
[0013] 以上所有的片段均連入PMD18T載體后進(jìn)行測(cè)序后拼接。
[0014] (5)開放閱讀框的擴(kuò)增：在經(jīng)過(guò)拼接獲得了表達(dá)基因的全長(zhǎng)之后，分別設(shè)計(jì)上 下游引物 ATGGGGAAGAAGGCTGTTACC 和 TCAAGCGAATATGCTTTTACA，經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得完整的 deltal2 開放閱讀框片段。PCR 反應(yīng)條件為：94oC 3 min;94oC 30 s, 60〇C 30 s, 72oC 1 min, 30個(gè)循環(huán)；72oC IOmin;片段大小為1263bp。
[0015] (6) deltal2去飽和酶功能的驗(yàn)證 獲得表達(dá)基因片段之后，隨后通過(guò)本領(lǐng)域常用的亞克隆手段將該片段連接到載體 pPIC3. 5k，得到畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3. 5k-delta-12，隨后將該質(zhì)粒與空載體分別電轉(zhuǎn) 化入畢赤酵母中得到GS115-12和GS115-pPIC3. 5K。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到裝有5mlBMGY 液體培養(yǎng)基的試管中，29〇C，180rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜。然后吸取500μ1過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接 種至50mlBMGY液體培養(yǎng)基的三角瓶中，正常條件培養(yǎng)至0D600達(dá)到4-6。離心收集菌體，稀 釋4-6倍將菌體轉(zhuǎn)移至BMMY液體培養(yǎng)基中，使初始的菌密度值達(dá)到1. 0。向培養(yǎng)基中加入 終濃度為0.5%的甲醇開始誘導(dǎo)。要每隔半天添加甲醇維持0.5%的誘導(dǎo)濃度。培養(yǎng)96h后 離心收集菌體，超聲法提取脂肪酸并進(jìn)行甲酯化，氣相色譜分析脂肪酸組成變化。脂肪酸變 化的結(jié)果如表1所示。通過(guò)表1的結(jié)果可以看出，重組菌具備了將十八碳單烯酸合成十八 碳二烯酸（π6族）的能力，表明我們所克隆得到的基因?yàn)橐环N新的脂肪酸deltal2去飽和 酶的編碼基因。
[0016] 表1重組畢赤酵母的長(zhǎng)鏈脂肪酸纟目成（數(shù)倌為含量百分比）

【權(quán)利要求】
1. 一種從微藻中克隆得到脂肪酸去飽和酶基因的方法，其特征在于，首先分離得到微 藻的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以之為模板，根據(jù)去飽和酶基因保守組氨酸框的序列設(shè)計(jì) 簡(jiǎn)并引物從而擴(kuò)增得到保守區(qū)基因；接下來(lái)分別對(duì)其5'末端和3'末端進(jìn)行末端擴(kuò)增獲得 全基因序列后，通過(guò)普通PCR的方法獲得表達(dá)基因。
2. -種來(lái)自于綠色巴夫藻的deltal2去飽和酶基因的開放閱讀框序列，其特征在于， 其序列如SEQ ID. No. 1所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK104388442SQ201410611541
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:徐毅