乙型流感病毒一步法檢測試劑盒及乙型流感病毒檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乙型流感病毒一步法檢測試劑盒及乙型流感病毒檢測方法。該乙型流感病毒一步法檢測試劑盒包含RT-PCR反應(yīng)液，所述RT-PCR反應(yīng)液包含彼此被分開的第一反應(yīng)液、含有酶的第二反應(yīng)液，所述第一反應(yīng)液包含用于熒光定量PCR的乙型流感病毒Bv、By亞型基因的引物探針。乙型流感病毒檢測方法包括提取待測樣本RNA、一步法RT-PCR和將熒光信號檢測結(jié)果與對照組比較判斷等步驟。本發(fā)明乙型流感病毒一步法檢測試劑盒能將含有乙型流感病毒Bv、By亞型基因的引物探針的第一反應(yīng)液與含有酶的第二反應(yīng)液在檢測時直接混合進(jìn)行RT-PCR，能一步法快速的檢測乙型流感病毒Bv、By亞型，且能避免污染，靈敏度高。
【專利說明】乙型流感病毒一步法檢測試劑盒及乙型流感病毒檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于衛(wèi)生防預(yù)病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的涉及一種乙型流感病毒一步法檢 測試劑盒及乙型流感病毒的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒（正黏液病毒科）為單鏈RNA膜病毒，其RNA含有八個片斷。流感病毒 的基因結(jié)構(gòu)使其有不斷交換基因片斷進(jìn)而形成優(yōu)勢變異的條件。根據(jù)核蛋白和膜表面蛋白 抗原，流感病毒分為甲、乙、丙三型。其中，乙型流感病毒是常見的流感流行病毒，其僅在人 類之間轉(zhuǎn)播，乙型流感通常有肌炎及胃腸道癥狀，在某些年份成為強(qiáng)勢株。相比較甲型流 感，乙型流感病毒更容易引起較嚴(yán)重的合并癥。1983年以來把乙型流感病毒分為2個主要 亞型：Victoria 型和 Yamagata 型。
[0003] 目前經(jīng)典的乙型流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)分離方法步驟如下：
[0004] 1)75?90%成片細(xì)胞的準(zhǔn)備：
[0005] 用40倍光學(xué)顯微鏡鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。選擇處于對數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞用于 病毒的分離；輕輕倒出細(xì)胞生長液，用IOmL的無菌移液管吸6mL pH7. 4-7. 6的Hank's液清 洗細(xì)胞3遍。
[0006] 2)接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶：
[0007] 用無菌的移液管將清洗細(xì)胞的Hank's液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中移出。用無菌的移液管 吸取500μ 1臨床樣品置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，溫和搖動數(shù)次，使之均勻鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。將 步驟2)中的培養(yǎng)瓶放入35°C，5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1?2h。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 用IOmL的無菌移液管吸取6mL pH7. 4-7. 6的Hank's液清洗細(xì)胞，加入5mL含終濃度2 μ g/ mL TPCK-胰酶的病毒生長液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。放置于35°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察 細(xì)胞病變情況（細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大成網(wǎng)狀，細(xì)胞核固縮或破 裂，嚴(yán)重時細(xì)胞部分或全部脫落）。
[0008] 3)細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲：
[0009] 當(dāng)75%?100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時進(jìn)行收獲。即使無細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲。 進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA)，用HI方法進(jìn)行流感病毒的鑒定。
[0010] 根據(jù)上述目前經(jīng)典的方法，檢測樣品中乙型流感病毒的周期過長（至少7天以 上）、操作煩瑣、靈敏度低、易污染、程序復(fù)雜和所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足快速檢 測的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種乙型流感病毒一步法檢測 試劑盒和一步法檢測乙型流感病毒的方法。旨在解決現(xiàn)有檢測乙型流感病毒周期長、靈敏 的低等技術(shù)問題。
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0013] 一種乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，包含RT-PCR反應(yīng)液，所述RT-PCR反應(yīng)液包 含彼此被分開的第一反應(yīng)液、含有酶的第二反應(yīng)液，所述第一反應(yīng)液包含用于熒光定量PCR 的乙型流感病毒Bv、By亞型基因的引物探針。
[0014] 一種一步法檢測乙型流感病毒的方法，包括如下步驟：
[0015] 提取待測樣本RNA ;
[0016] 以所述提取待測樣本RNA為模板，采用如上述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒 進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后收集熒光數(shù)據(jù)；
[0017] 將熒光信號檢測結(jié)果與對照組比較判斷。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)異技術(shù)效果：
[0019] 上述乙型流感病毒一步法檢測試劑盒能將含有乙型流感病毒Bv、By亞型基因的 引物探針的第一反應(yīng)液與含有酶的第二反應(yīng)液在檢測時直接混合進(jìn)行RT-PCR，能一步法快 速的檢測乙型流感病毒Bv、By亞型，且能避免污染，靈敏度高，有效避免了傳統(tǒng)檢測乙型流 感病毒的周期長，易污染且靈敏度低的不足。
[0020] 上述一步法檢測乙型流感病毒的方法利用上述乙型流感病毒一步法檢測試劑盒 采用一步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，顯著縮短了乙型流感病毒檢測的時間和檢測質(zhì)量，克服了目 前傳統(tǒng)經(jīng)典乙型流感病毒檢測方法存在的不足，彌補(bǔ)了目前應(yīng)急應(yīng)對預(yù)防和控制流感病毒 感染癥候病因?qū)W確認(rèn)等領(lǐng)域存在的缺陷和不足，具有重要的實(shí)用價值和現(xiàn)實(shí)推廣意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例使用的Ct值的示意性說明，其中所述的閾值線對應(yīng)于特定探 針；
[0022] 圖2為使用本發(fā)明實(shí)施例一步法檢測乙型流感病毒的方法流程圖；
[0023] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例乙型流感病毒一步法檢測試劑盒中陽性對照PCR擴(kuò)增圖；
[0024] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例乙型流感病毒一步法檢測試劑盒中陰性對照PCR擴(kuò)增圖；
[0025] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中對20份樣品采用本發(fā)明實(shí)施例乙型流感病毒一步法檢 測試劑盒進(jìn)行的PCR擴(kuò)增圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0027] 與本發(fā)明相關(guān)關(guān)鍵詞的解釋：
[0028] Tris :三異丙基乙磺酰
[0029] EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
[0030] dNTP :deoxy_ribonucleoside triphosphate,脫氧核糖核苷三憐酸
[0031] FAM :CarboxyfIuorescein,竣基突光素
[0032] HEX :hexachloro_fIuorescein,六氣 _6_ 甲基突光素。
[0033] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR):是體外酶促合成特異DNA 片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循 環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。
[0034] 逆轉(zhuǎn)錄 PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR):是 反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段。RT-PCR包括兩步：1、 mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;2、以cDNA為模版進(jìn)行PCR。將這兩個步驟合二為一個反應(yīng)管進(jìn)行即 為一步法，將兩個步驟分開兩管反應(yīng)為兩步法。一步法更方便快捷。
[0035] 實(shí)時熒光PCR法：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān) 測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定性定量分析的方法。
[0036] Ct值：cycle threshold,每個PCR反應(yīng)管內(nèi)的突光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷 的循環(huán)數(shù)，參見圖1。
[0037] 熒光定量PCR技術(shù)在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有 廣泛應(yīng)用。其基本原理為：在PCR反應(yīng)體系中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行， PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號 強(qiáng)度，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，見圖1， 在曲線指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可進(jìn)行定量分 析。
[0038] Bv亞型乙型流感病毒：Victoria型；By亞型乙型流感病毒：Yamagata型；Bv、By亞 型為乙型流感病毒的2個主要亞型。
[0039] 另外，本說明書中使用的術(shù)語"濃度"，如非特別說明，均指初始濃度，即與其它液 體混合之前的濃度。
[0040] 根據(jù)乙型流感病毒的上述特性，本發(fā)明實(shí)施例針對Bv、By亞型的基因設(shè)計(jì)特異性 引物和Taqman探針，提供了一種乙型流感病毒一步法檢測試劑盒。該乙型流感病毒一步法 檢測試劑盒包含RT-PCR反應(yīng)液，所述RT-PCR反應(yīng)液包含彼此被分開的第一反應(yīng)液、含有酶 的第二反應(yīng)液。
[0041] 其中，所述第一反應(yīng)液包含用于熒光定量PCR的乙型流感病毒Bv、By亞型基因的 引物探針。針對該Bv、By亞型靶基因特性，在一實(shí)施例中，所述乙型流感病毒Bv、By亞型基 因的引物探針為：
[0042] 乙型流感病毒Bv亞型基因的引物：
[0043] BvF :5' -CGCTACCAGTAGAAGCGGATT-3'（SEQ ID N0:1);
[0044] BvR :5' -GTGGATTCGTTGCTGTTTTGT-3'（SEQ ID N0:2);
[0045] 乙型流感病毒Bv亞型基因的探針：
[0046] BvA :5'-(X)-TCGCAACAATGGCTTGGGCTGTCCCA-(Y)-3'（SEQ ID N0:3);其中，所述探 針中X選用FAM、HEX、JOE、R0X、CY5或CY3熒光基團(tuán)，Y選用BHQ、TAMAR或DABCYL熒光淬 滅基團(tuán)。
[0047] 乙型流感病毒By亞型基因的引物：
[0048] ByF :5, -AACGGATTTTTCGCAACAATG-3'（SEQ ID N0:4);
[0049] ByR :5, -CAAATGTATGGTACTTCTACTYTT-3,（SEQ ID N0:5);
[0050] 乙型流感病毒By亞型基因的探針：
[0051] ByH : 5 ' - (N) -CGACAACAACAAAACAGCAACAAATTCA (M) -3 '（SEQ ID NO: 6)。其中，所述 探針中N選用FAM、HEX、JOE、ROX、CY5或CY3熒光基團(tuán)，且N優(yōu)選與上述X所選用的熒光基 團(tuán)不同；M為相同或不同的選用BHQ、TAMAR或DABCYL熒光淬滅基團(tuán)。
[0052] 上述各引物和分子信標(biāo)探針如下表1所示：
[0053] 表1引物與探針列

【權(quán)利要求】
1. 一種乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，包含RT-PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述 RT-PCR反應(yīng)液包含彼此被分開的第一反應(yīng)液、含有酶的第二反應(yīng)液，所述第一反應(yīng)液包含 用于熒光定量PCR的乙型流感病毒Bv、By亞型基因的引物探針。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，其特征在于， 所述乙型流感病毒Bv、By亞型基因的引物探針為： 乙型流感病毒Bv亞型基因的引物： BvF:5' -CGCTACCAGTAGAAGCGGATT-3' （SEQ ID Ν0:1); BvR:5' -GTGGATTCGTTGCTGTTTTGT-3' （SEQ ID Ν0:2); 乙型流感病毒Bv亞型基因的探針： BvA:5' _(X)-TCGCAACAATGGCTTGGGCTGTCCCA-(Y)-3'（SEQ ID Ν0:3); 乙型流感病毒By亞型基因的引物： ByF:5' -AACGGATTTTTCGCMCAATG-3'（SEQ ID N0:4); ByR:5' -CAAATGTATGGTACTTCTACTYTT-3' （SEQ ID N0:5); 乙型流感病毒By亞型基因的探針： ByH :5' - (N)-CGACAACAACAAAACAGCAACAAATTCA-(M)-3'（SEQ ID NO: 6) 其中，所述探針中X、N不同的選用FAM、HEX、JOE、ROX、CY5或CY3熒光基團(tuán)，Y、M為相 同或不同的選用BHQ、TAMR或DABCYL熒光淬滅基團(tuán)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反 應(yīng)液還包括不含鎂離子的lOXbuffer、MgCl 2、dNTPs、滅菌超純水，所述第一反應(yīng)液各組分 體積份數(shù)為：
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，其特征在于，所述 第二反應(yīng)液包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、顯色液和滅菌超純水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合 酶選自濃度為5U/ μ 1的Taq酶，所述逆轉(zhuǎn)錄酶選自濃度為50U/ μ 1的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，所 述顯色液為溴酚藍(lán)，且所述DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、顯色液和滅菌超純水的體積份數(shù)為：
6. 根據(jù)權(quán)利要求1_3、5任一所述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，其特征在于，所 述第一反應(yīng)液和所述第二反應(yīng)液裝設(shè)于同一容器中，且通過石蠟將所述第一反應(yīng)液和所述 第二反應(yīng)液彼此隔開。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1_3、5任一所述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，其特征在于，還 包括不含有乙型流感病毒Bv、By亞型的RNA陰性對照液和含有乙型流感病毒Bv、By亞型的 RNA陽性對照液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1_3、5任一所述的乙型流感病毒一步法檢測試劑盒，其特征在于，還 包括用于提取待測樣本RNA的溶劑：Trizol試劑、氯仿與異戊醇的混合溶劑和DEPC-H 2O15
9. 一種一步法檢測乙型流感病毒的方法，包括如下步驟： 提取待測樣本RNA ; 以所述提取待測樣本RNA為模板，采用如權(quán)利要求1-8任一所述的乙型流感病毒一步 法檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后收集熒光數(shù)據(jù)； 將熒光信號檢測結(jié)果與對照組比較判斷。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一步法檢測乙型流感病毒的方法，其特征在于：所述RT-PCR 反應(yīng)的反應(yīng)條件為： 42-50〇C ：10-15min ； 92-95〇C ：2-3min ； 92-95°C :5-10S，55-60°C :40-80S ;共 40 個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388587SQ201410614129
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】田仁鵬, 吳成貢, 高忠平, 王茵茵 申請人:深圳市生科源技術(shù)有限公司