一種能驅(qū)動(dòng)或調(diào)節(jié)基因在植物雄蕊中表達(dá)的啟動(dòng)子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能驅(qū)動(dòng)或調(diào)節(jié)基因在植物雄蕊中表達(dá)的啟動(dòng)子，其包含下列中的至少一種：(a)SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列；(c)在SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲得的核苷酸序列；(d)在SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲得的核苷酸序列；(e)與SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(f)與SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(g)與SEQ ID NO1具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者(h)與SEQ ID NO2具有至少90％同源性的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子有利于控制目的基因僅在雄蕊中特異表達(dá)。
【專利說(shuō)明】-種能驅(qū)動(dòng)或調(diào)節(jié)基因在植物雄蕊中表達(dá)的啟動(dòng)子

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從植物中分離的具有特定功能的基因片段，尤其涉及從水稻中分 離的雄蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物基因工程的目標(biāo)之一是產(chǎn)生具有農(nóng)業(yè)所需特征或性狀的植物。就基因工程的 進(jìn)展而言，現(xiàn)在已經(jīng)能夠提供轉(zhuǎn)化植物以使其含有并表達(dá)外來(lái)基因的必需工具。植物轉(zhuǎn)化 和再生中的技術(shù)進(jìn)展已使研究人員能夠獲取外源核苷酸分子、并將這些核苷酸分子整合到 植物基因組中。外源核苷酸分子于是可以在植物細(xì)胞中得到表達(dá)以表現(xiàn)出添加的特征或性 狀。從而，可以為植物，尤其是作物提供一些該作物原本所不具有的性狀，使得作物的生長(zhǎng) 方式更加符合人們生產(chǎn)和生活的需求。
[0003] 在驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的過(guò)程中，啟動(dòng)子往往是一個(gè)有效的工具。啟動(dòng)子是RNA聚 合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，是重要的順式作用元件，一般位于結(jié)構(gòu)基因5,端上游 區(qū)。高等植物基因調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行，啟動(dòng)子控制著基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程 度，同時(shí)對(duì)所使用的RNA聚合酶類型也起著決定性作用，所以它是理解基因表達(dá)模式和轉(zhuǎn) 錄調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵，是植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。
[0004] 根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式及功能，可將其分為三類：組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異 性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。目前，在植物基因工程中使用的大多數(shù)為組成型啟動(dòng)子，使外 源目的基因在植物各組織部位高水平表達(dá)，但是，在此過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種多樣的問(wèn)題，例如 不能從時(shí)間和空間上有效的調(diào)控目的基因的表達(dá)，過(guò)度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量（Gittin JR，etal. 2000);大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破植物的代謝平衡，不利于 植物生長(zhǎng)；引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象；此外還存在轉(zhuǎn)基因植物安全性隱憂。因此，科學(xué)家 們不斷尋找更為有效的組織或器官特異性啟動(dòng)子來(lái)代替組成型啟動(dòng)子，以期更精確的調(diào)控 外源基因的表達(dá)。
[0005] 組織或器官特異性啟動(dòng)子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程一般只發(fā)生在某些特定的組織 或者器官中。組織或器官特異性啟動(dòng)子可以更加有效的調(diào)控外源基因的表達(dá)，特異地在特 定需要的部位發(fā)揮作用，這樣不僅可以提高外源基因的表達(dá)豐度，而且將生物能耗降到最 低，從而不影響植株的正常生長(zhǎng)。另外，深入研究組織或器官特異性啟動(dòng)子有助于闡明植物 形態(tài)、發(fā)育、代謝途徑等基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)組織或器官特異性表達(dá)啟 動(dòng)子進(jìn)行深入地研究已成為當(dāng)前植物基因工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
[0006] 目前，與植物開花相關(guān)的組織或器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子的研究主要集中在擬南 芥、煙草等草本模式植物，而對(duì)于農(nóng)作物水稻的雄蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究卻鮮有報(bào)道。雄 蕊是植物重要的生殖器官，隨著近年來(lái)雄蕊發(fā)育的分子機(jī)理逐漸成為植物研究的熱點(diǎn)，其 中，花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子起到了重要作用。比如，選用不同啟動(dòng)子調(diào)控C類基因在轉(zhuǎn)基因花 卉的不同時(shí)空予以表達(dá)，極有可能創(chuàng)造出花型改良的花卉新品系，如雄性不育系等，其對(duì)豐 富觀賞種類、改良花型、減少花粉污染以及簡(jiǎn)化育種程序等具有一定的理論及使用價(jià)值。由 于，雄蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子克服了組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異性表達(dá) 所造成的浪費(fèi)，同時(shí)也為雄蕊相關(guān)基因的研究提供了表達(dá)元件，也可以使某些特定的基因 只在雄蕊中表達(dá)以改良花的觀賞品質(zhì)（王緯等，2013)。
[0007] 然而，目前人們所知的雄蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子的種類有限，而且，如上面所提到的， 現(xiàn)有的雄蕊啟動(dòng)子主要適用于對(duì)花卉的觀賞品質(zhì)進(jìn)行改良，目前尚沒(méi)有足夠的能夠應(yīng)用于 農(nóng)作物，尤其是單子葉作物，特別是水稻中的雄蕊啟動(dòng)子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明希望能夠提供一種適用于農(nóng)作物，尤其是單子葉作物，特別 是水稻的雄蕊啟動(dòng)子，以便能夠驅(qū)動(dòng)或調(diào)節(jié)引入到作物中的外源基因在作物雄蕊中特異性 地表達(dá)。
[0009] 具體而言，本發(fā)明提供了一種能驅(qū)動(dòng)或調(diào)節(jié)基因在植物雄蕊中表達(dá)的啟動(dòng)子，其 特征是，所述啟動(dòng)子包含：
[0010] (a)SEQIDN01中所示的核苷酸序列；或者
[0011] (b)SEQIDN02中所示的核苷酸序列；或者
[0012] (C)在SEQIDN01中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后 所獲得的核苷酸序列；或者
[0013] (d)在SEQIDN02中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后 所獲得的核苷酸序列；或者
[0014] (e)與SEQIDN01中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或者
[0015] (f)與SEQIDN02中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或者
[0016] (g)與SEQIDN01中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或者
[0017] (h)與SEQIDN02中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。
[0018] 進(jìn)一步地，所述啟動(dòng)子分離自日本晴水稻的成熟種子，分離所采用的擴(kuò)增引物包 括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQIDN0 3所示，所述第二引物的 核苷酸序列如SEQIDN0 4所示。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供一種DNA構(gòu)建體，其特征是，所述DNA構(gòu)建體包含上述的啟 動(dòng)子。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供一種包含上述的啟動(dòng)子或上述的DNA構(gòu)建體的植物表達(dá) 盒。
[0021] 另一方面，本發(fā)明提供一種包含上述的啟動(dòng)子或上述的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載 體。
[0022] 進(jìn)一步地，在所述重組表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子連接于待表達(dá)基因上游，所述待表 達(dá)基因具有調(diào)控雄蕊以使其不育的功能。
[0023] 另一方面，本發(fā)明提供一種包含上述的啟動(dòng)子或上述的DNA構(gòu)建體的宿主菌或轉(zhuǎn) 化子。
[0024] 需要說(shuō)明的是，本文中所提到的"植物"優(yōu)選為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉 米、大麥、高粱或燕麥，最優(yōu)選為水稻。本發(fā)明還涉及上述啟動(dòng)子在培育植物新品種等方面 的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述植物雄蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子連接于載體的待表 達(dá)的基因序列上游（例如，將所述啟動(dòng)子序列置于目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載 體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。所述重組表達(dá)載體為 PCAMBIA1391-STA1，該重組表達(dá)載體為將STA1或啟動(dòng)子STA1構(gòu)建于pCAMBIA1391中得到 的重組表達(dá)載體，本文中稱為PCAMBIA1391-STA1。
[0025] 序列表中SEQIDNo:l或SEQIDN0 :2所示的DNA序列為來(lái)源于日本晴水稻 (OryzasativaLcv.Nipponbare)的水稻雄蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子，本文中稱為STA1或啟動(dòng)子 STA1。
[0026] 需要說(shuō)明的是，在序列表中，SEQIDNo:l中所示的DNA序列與SEQIDNo:2 所示的啟動(dòng)子的區(qū)別主要在于SEQIDN〇:l中所示的DNA序列在開頭部分多了 "CCCAGCAACCTGCGAATCCACG" 共計(jì) 22bp，在結(jié)尾部分多了 "AACCCCCGCTCCGCTACCGCCC" 共計(jì) 22bp，這兩部分為獲得啟動(dòng)子過(guò)程中使用的正向引物的留存序列。而SEQIDN〇:2所示的 DNA序列為純獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強(qiáng)調(diào)的是，本文中所提到的啟動(dòng)子既可以 指SEQIDNo: 1，也可以指SEQIDNo: 2,二者可以發(fā)揮相同的作用。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人從日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)中分 離克隆STA1基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1938bp(如果不考慮引物留存為1894)的 DNA序列，并將其命名為STA1。本申請(qǐng)的發(fā)明人將該序列經(jīng)酶切后連接到植物雙元表達(dá)載 體PCAMBIA1391上，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體），利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng) 桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。本申請(qǐng) 的發(fā)明人對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行GUS表達(dá)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株僅僅在雄蕊部位上 的Gus基因表達(dá)水平提高，而在其他部位的表達(dá)水平并未有明顯變化，從而證明該1938bp 的序列具有驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的活性，而且該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Gus基因在水稻雄蕊部位特異表 達(dá)。
[0028] 也就是說(shuō)，本發(fā)明所述的啟動(dòng)子序列可與植物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成 型啟動(dòng)子。并且，該啟動(dòng)子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn) 化后，可驅(qū)動(dòng)靶標(biāo)基因在植株中特異性表達(dá)，從而提高外源靶標(biāo)基因在植物中的表達(dá)量，增 加轉(zhuǎn)基因的效果。
[0029] 技術(shù)效果
[0030] 本發(fā)明通過(guò)分離克隆得到了雄蕊特異表達(dá)啟動(dòng)子STA1，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該啟動(dòng)子有利 于控制目的基因僅在雄蕊中特異表達(dá)，一則不會(huì)造成植物內(nèi)部代謝資源浪費(fèi)，不至于目的 基因過(guò)量表達(dá)給植物帶來(lái)不利影響；二則有利于更好地研究花發(fā)育的部分基因的功能，了 解植物有性生殖發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，從而運(yùn)用于生產(chǎn)實(shí)踐，達(dá)到改良花型和簡(jiǎn)化育種程序等 多重效果。
[0031] 通過(guò)本發(fā)明的啟動(dòng)子對(duì)農(nóng)作物品種進(jìn)行基因改造，如通過(guò)該啟動(dòng)子調(diào)控目標(biāo)基因 在植株中表達(dá)，可以提高和改善水稻的生長(zhǎng)特性和機(jī)制，代替35S等組成型啟動(dòng)子，從而培 育出實(shí)用有效的轉(zhuǎn)基因植物品種。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032] 以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0033] 圖1為將STA1啟動(dòng)子構(gòu)建于pCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為pCAMBIA1391-STAl示意圖，其中示出了利用STA1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)位 于其下游的GUS基因表達(dá)；
[0034] 圖2為對(duì)本發(fā)明的啟動(dòng)子進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。
[0035] 圖3為STA1::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株在水稻根部的表達(dá)的染色驗(yàn)證示意圖。
[0036] 圖4為STA1::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株在水稻莖部的表達(dá)的染色驗(yàn)證示意圖；
[0037] 圖5為STA1::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株在水稻葉片部位的表達(dá)的染色驗(yàn)證示意圖；
[0038] 圖6為STA1::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株在水稻葉鞘部位的表達(dá)的染色驗(yàn)證示意圖；
[0039] 圖7為STA1::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株在水稻花處的表達(dá)的染色驗(yàn)證示意圖，從該表 達(dá)結(jié)果看，⑶S染色僅在轉(zhuǎn)基因植株的雄蕊部位明顯表達(dá)。（圖3-7中的標(biāo)尺=lcm)。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。
[0041] 1、植物材料
[0042]日本晴水稻的成熟種子，由安徽省農(nóng)科院水稻所生技室保存。
[0043] 2、菌株及質(zhì)粒
[0044] 本發(fā)明所用大腸桿菌菌株為XLl-blue;根癌農(nóng)桿菌為EHA105,安徽省農(nóng)科院水稻 所生物技術(shù)室保存；植物表達(dá)載體PCAMBIA1391購(gòu)自澳大利亞CAMBIA公司。當(dāng)然，本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)該理解，采用其他的菌株或表達(dá)載體也可以實(shí)現(xiàn)類似的效果，這里不做限定。
[0045] 3、試劑與藥品
[0046]次氯酸鈉（NaCIO,有效氯濃度4% )，Tween20購(gòu)自Sigma公司。潮霉素B購(gòu)自 Roche公司；PEASY-Tsimple和DNAmarker_Trans2K購(gòu)自Transgen公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu) 自NEB公司；K0D高保真聚合酶和定量PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa寶生物技術(shù)有限公司； T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；DNA片段回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；質(zhì)粒DNA提取采 用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒。引物合成和測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。
[0047] 緩沖液、試劑、細(xì)菌培養(yǎng)基配方、大腸桿菌感受態(tài)制備參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第三版）。
[0048] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方 式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例中所用 的藥材原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。
[0049] 4、引物的設(shè)計(jì)
[0050] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴（OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因組 序列，依據(jù)水稻STA1基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點(diǎn)，設(shè) 計(jì)引物的酶切位點(diǎn)。具體設(shè)計(jì)的引物為：正向引物（SEQIDN〇:2)5'端帶Sail，酶切位點(diǎn) (GTCGAC)，反向引物（SEQIDNo:3)5'端帶EcoRI，酶切位點(diǎn)（GAATTC)，引物序列如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種能驅(qū)動(dòng)或調(diào)節(jié)基因在植物雄蕊中表達(dá)的啟動(dòng)子，其特征是，所述啟動(dòng)子包含： (a) SEQ ID N01中所示的核苷酸序列；或者 (b) SEQ ID N02中所示的核苷酸序列；或者 (c) 在SEQ ID N01中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲 得的核苷酸序列；或者 (d) 在SEQ ID N02中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲 得的核苷酸序列；或者 (e) 與SEQ ID N01中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或者 (f) 與SEQ ID N02中所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或者 (g) 與SEQ ID N01中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或者 (h) 與SEQ ID N02中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征是，所述啟動(dòng)子分離自日本晴水稻的成熟種 子，分離所采用的擴(kuò)增引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
3. -種DNA構(gòu)建體，其特征是，所述DNA構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子。
4. 包含權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求3中所述的DNA構(gòu)建體的植物表達(dá)盒。
5. 包含權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求3中所述的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載 體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體，其特征是，在所述重組表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子 連接于待表達(dá)基因上游，所述待表達(dá)基因具有調(diào)控雄蕊以使其不育的功能。
7. 包含權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求3中所述的DNA構(gòu)建體的宿主菌或轉(zhuǎn)化 子。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104328124SQ201410614223
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】魏鵬程, 楊劍波, 秦瑞英, 楊亞春, 李 浩, 李莉, 馬卉, 許蓉芳 申請(qǐng)人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所