單核細胞增生李斯特菌檢測用引物對及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及單核細胞增生李斯特菌檢測用引物對及其檢測方法。該引物對中的上游引物為SEQIDNO:2堿基序列，下游引物為SEQIDNO:3所示的堿基序列。采用本發(fā)明方法檢測單核細胞增生李斯特菌，檢測時間短，成本低；本發(fā)明的檢測靶點具有很強的特異性，檢測結(jié)果特異，結(jié)果判斷簡單。
【專利說明】單核細胞增生李斯特菌檢測用弓I物對及其檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種單核細胞增生李斯特菌檢測用引物對及其檢測方法。

【背景技術】
[0002]單核細胞增生李斯特菌{Listeria monocytogenes)簡稱單增李斯特菌是一種重要的食源性人畜共患病源菌。它廣泛分布于自然界中，肉類、禽類、海產(chǎn)品類、乳制品和蔬菜中均有其存在。它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多，特別對孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人危害還嚴重。被感染者也會出現(xiàn)和流感類似的癥狀，但并不常見。孕婦感染后，如果治療不當，會引發(fā)菌血癥導致早產(chǎn)、死嬰等嚴重后果。雖然丹增李斯特菌在食物中毒和感染的事件發(fā)生的較少，但其致死率較高，平均達33.3%，是細菌中致死率較高的一種，如2006年法國因食物感染引起67人死亡。國內(nèi)外對單增李斯特菌的危害均給以高度重視，WHO將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一。食品是導致人類受單核細胞增生李斯特菌感染的主要傳播途徑，該菌在4 °C冰箱保存的食物中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌。隨著我國冷藏、速凍食品消費量的迅速增多，食品中單增李斯特氏菌的潛在危險性也越來越突出，因此在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加以重視。因此，如何通過快速的檢測單增李斯特菌來解決食品安全問題成為了國家迫切的需求。我國目前對食品中單增李斯特菌的檢測仍使用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，但是檢測過程中，制備培養(yǎng)基、計算菌落數(shù)量和鑒定菌落的生化特征都耗時耗力，并且培養(yǎng)方法的成功依賴于樣本中細菌的數(shù)量和狀況、培養(yǎng)基的靈敏度、孵化條件和分離培養(yǎng)基的選擇性，不適合當前食品快速檢測的需求。
[0003]PCR技術以其操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點，逐步應用于各種食源性致病菌的檢測之中去。聚合酶鏈式反應(Polymerase chain React1n, PCR )最早由Mulhs和Cetus公司的同事于1985年發(fā)明的，是一種通過在體外模擬自然DNA復制過程快速擴增特定DNA序列的方。Bessesen MT等于1990年建立了 PCR檢測單核細胞增生李斯特菌的方法，通過擴增李斯特氏菌溶血素基因hlyA中386 bp的PCR方法檢測單核細胞增生李斯特菌，DNA檢測量為25 ng，詳見:BESSESEN MT, LUO QA, ROTBARTHA., et al.“Detect1n of Listeria monoeytogenes by using the Polymerase chainreact1n” [J].Appl Environ Mierob1l, 1990, 56(9): 2930-2932.(BESSESEN MT, LUOQA, ROTBART HA., et al等.“運用PCR檢測單核細胞增生李斯特菌”，應用環(huán)境微生物學，1990，56 (9) =2930-2932 頁。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有檢測技術的不足，提供一種單核細胞增生李斯特菌檢測用引物對。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供采用該引物對檢測單核細胞增生李斯特菌的方法，該方法檢測時間短，成本低，檢測結(jié)果特異，結(jié)果判定簡便，滿足現(xiàn)在食品安全檢測的需求。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種單核細胞增生李斯特菌檢測用弓I物對，其特征在于該引物對中的上游引物為SEQID N0:2堿基序列，下游引物為SEQ ID N0:3所示的堿基序列。
[0007]—種檢測單核細胞增生李斯特菌的方法，采用上述的單核細胞增生李斯特菌檢測用弓I物對進行PCR擴增，其特征在于該PCR檢測體系為:10 X PCR反應緩沖液5 μ L，dNTP為3 μ L,5 μ M上游引物和下游引物分別為IyL,模板溶液為IyL, TAQ酶為IyL,最后補充ddH20至50 μ L ;PCR檢測體系的具體參數(shù)為:95° C預變性2min，之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為:95° C變性45s，53° C退火45s，72° C延生55s ;循環(huán)30次后，最后72° C延生lOmin，降溫至10° C，PCR擴增結(jié)束。
[0008]本發(fā)明的單核細胞增生李斯特菌檢測用引物對是根據(jù)單核細胞增生李斯特菌的基因組DNA序列中的特異性序列l(wèi)mo0202 設計得到，李斯特菌的核酸序列SEQID NO: 3如下；
(a)檢測目的基因的序列特征:
* 長度:226bp
*類型:核酸 *鏈型:雙鏈 *拓撲類型:線形
(b)分子類型:DNA
(c)最初來源:單核細胞增生李斯特菌
(d)序列描述:SEQID N0.1:
ATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATC序列中下劃線部分的字母代表了引物hlyF和hlyR的位置，進行PCR擴增；再根據(jù)凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，判斷樣品是否含有單核細胞增生李斯特菌；判斷的方法具體如下:如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應的與設計大小一致的單一擴增條帶，則說明樣品中含有單核細胞增生李斯特菌；反之，如果電泳結(jié)果沒有出現(xiàn)相應的與設計大小一致的單一擴增條帶，則說明樣品中不含有單核細胞增生李斯特菌。
[0009]上游引物hly-F序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物hly-R序列如SEQ ID N0:2所示；
SEQ ID NO:2
Ca)上游引物hly-F基因的序列特征:
*長度:23bp *類型:核酸 *鏈型:單鏈 *拓撲類型:線形
(b)分子類型:DNA
(c)最初來源:人工合成
(d)序列描述:SEQID N0.2:
ATCAACCAGATGTTCTCCCTG
SEQ ID NO:3
(a)上游引物hly-R基因的序列特征:
*長度:23bp
*類型:核酸 *鏈型:單鏈 *拓撲類型:線形
(b)分子類型:DNA
(c)最初來源:人工合成
(d)序列描述:SEQID N0.3:
GACGAAATGGCTTACAGTGAATC
與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點:采用該法檢測單核細胞增生李斯特菌，檢測時間短，成本低；本發(fā)明的檢測靶點具有很強的特異性，檢測結(jié)果特異，結(jié)果判斷簡單。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為實施例1中PCR檢測方法特異性評價凝膠電泳圖；
圖2為實施例2中PCR檢測方法靈敏度評價凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0011]結(jié)合具體的實施例，進一步進行闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0012]實施例1:
單核細胞增生李斯特菌PCR檢測方法的建立
步驟1，根據(jù)單核細胞增生李斯特菌的基因組DNA序列中的保守序列設計引物，從單核細胞增生李斯特菌基因組序列中找到特異性基因lmo0202 基因，將其作為單核細胞增生李斯特菌基因的靶基因，基因序列如hlyID NO:1所示；
將此基因序列輸入引物設計軟件Primer Premier 5.0中設計引物,產(chǎn)物大小范圍為100?500bp，再從中篩選合適的引物，引物序列如下(引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成):
hly-F:5，-ATC AAC CAg ATg TTC TCC CTg TA-3’ (hly ID NO:2)
hly-R:5，- gAT TCA CTg TAA gCC ATT TCg TC-3，(hly ID NO:3)
步驟2，DNA模板的制備
將39株單核細胞增生李斯特菌和8株陰性菌株(綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、西爾李斯特菌、格氏李斯特菌、威氏利斯特菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌株、粘質(zhì)沙雷菌)接入到50mL的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C增菌12h后，取ImL菌液，放入1.5mL離心管中，2000r/min離心1min,取上清液，再在12000r/min離心1min,收集菌體。用雙蒸水進行洗滌菌體，洗滌完后加入100 μ L的無菌水，并用氯仿抽屜法提取基因組。加入10 μ L溶^(20mg/mL)，37。C 水浴 lh，再加入 10 μ L 蛋白酶 K(20mg/mL)水浴 lh。加人 200 μ L 的10%SDS,沸水lOmin。12000r/min離心5min,取上清放至干凈的EP管,加入苯酹:氯仿:異戊醇(25:24:1 )，然后12000r/min離心5min，再取上清放至干凈的EP管，加入0.1倍體積的乙酸銨(2.5mol/L, PH5.4)，再加入2倍預冷的無水乙醇(-20° C放置1min)，然后12000r/min離心5min。去上清,加入75%的乙醇洗漆，12000r/min離心5min,重復2次。去上清，晾干殘余乙醇，加50 μ L滅菌超凈水，溶解DNA，-20° C保存。
[0013]步驟3，PCR檢測的特異性評定
加入38 μ L的無菌水到PCR反應管，再加入5 μ LlO XPCR反應緩沖液，3 μ L的dNTP,5μΜ上游引物和下游引物分別加入lyL，加入TAQ酶lyL，模板lyL，并以無菌水為模板作為反應的陰性對照。PCR的循環(huán)參數(shù)如下:95° C預變性2min，之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為:95° C變性45s，53° C退火45s，72° C延生55s ;循環(huán)30次后，最后72° C延生lOmin，降溫至10° C，PCR擴增結(jié)束。
[0014]取8株陰性菌株以及39株單核細胞增生李斯特菌，每株菌株DNA溶液均取I μ L作為PCR反應模板。
[0015]圖1所示為8株陰性菌株以及39株單核細胞增生李斯特菌的PCR的檢測結(jié)果。圖中1-39為單核細胞增生李斯特菌，40為綿羊李斯特菌，41為英諾克李斯特菌，42為西爾李斯特菌，43為格氏李斯特菌，44為威氏利斯特菌，45為豬霍亂沙門氏菌，46為鼠傷寒沙門氏菌株，47為粘質(zhì)沙雷菌，48為ddH20，M為5000bp Marker。圖中表明1_39單核細胞增生李斯特菌均有226bp的特異擴增條帶，而8株陰性菌株均沒有相應的特異擴增條帶。
[0016]步驟4，靈敏度評價試驗
純化的單核細胞增生李斯特菌的總DNA，經(jīng)DU-800紫外分光光度計測量，起含量分別為32.6ng/l.! L。將上述測定的單核細胞增生李斯特菌的總DNA溶液用無菌水10倍梯度稀釋，從32.6ng/ μ L-0.326fg/ μ LDNA溶液分別取2 μ L加入PCR反應體系(50 μ L)。如圖 2 所示，泳道 1-9 DNA 濃度分別為:1.304ng/ μ L, 130.4pg/yL, 13.(Mpg/μ L，1.304pg/μ L, 130.4fg/ μ L, 13.04fg/ μ L, 1.304fg/ μ L, 0.1304 fg/ μ L, 0.01304 fg/ μ L,泳道 10 為ddH20,泳道M為5000bp Marker。擴增結(jié)果如圖2所示,在第7條泳道可以看到清晰的條帶，所對應DNA濃度為lJCMfg/yL，而第8條泳道之后看不到擴增條帶。因此，判定PCR檢測靈敏度為1.304fg/l.! L，具有較高的靈敏度。
[0017]實施例2:單核細胞增生李斯特菌PCR檢測方法準確性評價
利用實施例1中建立的單核細胞增生李斯特菌PCR檢測方法，檢測人工污染肉類樣品是否含有單核細胞增生李斯特菌。從LB平板上挑取單核細胞增生李斯特菌的單菌落，接入到50mL LB液體培養(yǎng)基中去，在37° C培養(yǎng)12h。用生理鹽水作10倍的梯度稀釋，并取ImL稀釋度為10_8的菌液作平板計數(shù)，計算單核細胞增生李斯特菌純培養(yǎng)的起始濃度。40份豬肉樣品，無菌取樣25mL，接入ImL 10_2梯度稀釋的單核細胞增生李斯特菌菌懸液。將40份人工污染樣品添加到225mL LB液體培養(yǎng)基中。在37° C的搖床(120r/min)中增菌。12h后進行取樣I次。每份樣品取樣ImL,放入1.5mL離心管中，30000r/min離心1min,沉淀培養(yǎng)物中的食品殘渣。取上清液，在12000g/min離心5min，收集單核細胞增生李斯特菌菌體。倒去上清液后，用無菌雙蒸水重新懸浮菌體，離心洗滌3次。然后加入100 μ L無菌超純水，在沸水浴中煮1min然后取出，在-20° C放置301^11。37° C解凍后，12000g/min離心5min。上清液為PCR模板DNA溶液，獲得人工污染樣品中PCR模板DNA溶液，進行PCR檢測。檢測結(jié)果中都為陽性。因此利用單核細胞增生李斯特菌PCR檢測方法具有較高的準確性。
【權利要求】
1.一種單核細胞增生李斯特菌檢測用引物對，其特征在于該引物對中的上游引物為SEQ ID NO:2喊基序列，下游引物為SEQ ID N0:3所不的喊基序列。
2.一種檢測單核細胞增生李斯特菌的方法，采用根據(jù)權利要求1所述的單核細胞增生李斯特菌檢測用引物對進行PCR擴增，其特征在于該PCR檢測體系為:10 X PCR反應緩沖液5 μ L，dNTP為3 μ L，5 μ M上游引物和下游引物分別為I μ L，模板溶液為I μ L，TAQ酶為Iμ L，最后補充ddH20至SOyL5PCR檢測體系的具體參數(shù)為:95° C預變性2min，之后開始擴增循環(huán)，每個循環(huán)的程序為:95° C變性45s，53° C退火45s，72° C延生55s ;循環(huán)30次后，最后72° C延生lOmin，降溫至10° C，PCR擴增結(jié)束。
【文檔編號】C12N15/11GK104328187SQ201410614985
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權日:2014年11月5日
【發(fā)明者】劉戰(zhàn)民, 朱佳超 申請人:上海大學