一種快速檢測暗紋東方鲀幼魚性別差異單堿基突變的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測暗紋東方鲀幼魚性別差異單堿基突變的引物和方法，本發(fā)明針對暗紋東方鲀雌雄個體性別差異基因上存在單核苷酸突變位點，設(shè)計了分別擴增性別差異基因序列的一對外側(cè)PCR引物和含有針對突變位點的錯配堿基的內(nèi)側(cè)PCR引物。利用所述引物，暗紋東方鲀不同性別DNA樣品可以得到不同擴增結(jié)果，從而判斷暗紋東方鲀性別差異。本發(fā)明成本低廉、操作簡單、快速、準確并適合于推廣應(yīng)用，可在提取1齡以內(nèi)暗紋東方鲀基因組DNA的基礎(chǔ)上快速準確對暗紋東方鲀幼魚的性別進行鑒定，對加快暗紋東方鲀單性選育進程及分子生物學領(lǐng)域快速的PCR檢測方法研究有著重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種快速檢測暗紋東方鈍幼魚性別差異單堿基突變的引物和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的引物和方法。

【背景技術(shù)】
[0002]暗紋東方飩(Takifugu),俗稱河豚,屬硬骨魚綱,飩形目，飩科,東方飩屬，主要分布在我國近海北部沿海(東海、黃海、渤海)和長江中下游，具有溯河洄游的習性，成魚在海中育肥和成熟，春季親魚由海逆河而上到淡水中產(chǎn)卵，仔稚魚在長江和湖泊中發(fā)育成長，翌年春天幼魚入海。暗紋東方飩本身不產(chǎn)生毒素，但是可以蓄積所捕食的餌料生物中的毒素，尤以卵巢、肝臟、血液和皮膚等部位含量較高，誤食沒有經(jīng)過特殊處理和烹飪的野生暗紋東方飩，可致人死亡。然而暗紋東方飩?cè)赓|(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，特別是其精巢不僅不含毒素，而且潔白如乳，豐腴鮮美，入口即化，給人以難以用言辭表達的美妙絕倫的感覺，有“西施乳”之美譽。暗紋東方飩在我國有2000多年的食用歷史，與鋪魚、刀魚并稱為“長江三鮮”，頗受江蘇、上海一帶消費者的尊崇，素有“拼死吃河豚”和“不吃河豚不知魚味，吃河豚百味皆無”等說法，足見暗紋東方飩在長江流域飲食文化中的重要地位。
[0003]由于暗紋東方飩可進入江河或定居于淡水湖中，造成了養(yǎng)殖環(huán)境的不同，適合于淡水養(yǎng)殖的暗紋東方飩和適合于海水養(yǎng)殖的紅鰭東方飩在水溶性及揮發(fā)性風味上存在著較大差異，從而影響著人們的食用喜好。國內(nèi)食用較多的品種為淡水養(yǎng)殖的暗紋東方飩，而出口較多的品種為海水養(yǎng)殖的紅鰭東方飩。2007年全國河豚魚養(yǎng)殖就達到了淡水養(yǎng)殖和海水養(yǎng)殖分別為1404噸和10141噸的產(chǎn)量。
[0004]但是由于過度捕撈導(dǎo)致野生暗紋東方飩捕撈量嚴重下滑，不能滿足消費者的主球，我國從20世紀90年代初期開始人工養(yǎng)殖暗紋東方飩，目前養(yǎng)殖范圍遍及江蘇、廣東和上海等十多個省市，養(yǎng)殖年產(chǎn)量接近4萬t，暗紋東方飩的養(yǎng)殖也已成為上述省市的一項重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。由于暗紋東方飩屬于有毒魚類，在我國的食用受到限制，妨礙了暗紋東方飩養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。因此，研究全雄苗種的制種技術(shù)，養(yǎng)殖全雄暗紋東方飩，可以充分利用雄魚精巢無毒、市場價格高以及可以作為高檔化妝品魚精蛋白的加工原料等優(yōu)勢，對于提高養(yǎng)殖利潤和促進產(chǎn)業(yè)發(fā)展都有重要意義。
[0005]迄今為止，有關(guān)暗紋東方飩?cè)勖绶N培育工作的研究僅限于性別分化時期、性別分化相關(guān)基因的表達規(guī)律(李延伸，戴奇，郭正龍，朱永祥，黃波，周忠良，2011.暗紋東方飩o/wctf/YAs)性別分化的組織學及芳香化酶基因表達研究.復(fù)旦學報(自然科學版)，645-652.)以及芳香化酶抑制劑對性別分化和相關(guān)芳香化酶基因表達的影響(黃波，楊小玉，戴奇，汪奇，云丹，周忠良，2013.芳香化酶抑制劑對暗紋東方飩CYP19A、DMRTl基因表達及性腺分化的影響.中國水產(chǎn)科學，68-74 ;汪奇，郭正龍，李延伸，云丹，黃波，周忠良，2012.來曲唑?qū)Π导y東方飩性腺分化及相關(guān)基因表達的影響.動物學雜志，16-23.)等方面，缺乏全雄苗種制種的基礎(chǔ)研究，包括未成熟稚幼魚性別的無損鑒定方法，特別是雌雄性別差異單堿基突變的等位基因特異PCR方法以及弓丨物國內(nèi)外尚未見報道。
[0006]隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，多種生物的全基因組測序工作宣告完成，決定生物多樣性的遺傳信息得以揭示，這為各類生物個體差異的鑒定和研究提供了廣泛依據(jù)。核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是指群體中基因組DNA序列上單個核苷酸的變異，生物中的SNP數(shù)量多、分布廣、高度穩(wěn)定，并且易于分型，是開發(fā)新型分子標記的重要遺傳基礎(chǔ)。目前，基于SNP的分子標記已經(jīng)在人類、擬南芥、水稻基因組中大量開發(fā)。此外，根據(jù)群體中的SNP設(shè)計等位基因特異引物，針對性的建立等位基因特異PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)，是檢測己知突變位點SNP的一種快速、簡便、低成本的有效方法，該方法能夠以基因組DNA為模板，僅僅通過簡單的PCR和電泳結(jié)果就能夠進行基因型的鑒定，從而克服其他方法操作較繁瑣，耗時較長的缺點，尤其適合于對大樣本進行快速鑒定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供了一種快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的引物和方法，本發(fā)明針對暗紋東方飩雌雄個體雌雄性別差異基因上單核苷酸突變位點，設(shè)計了分別擴增雌雄性別差異基因序列的一對上、下游PCR引物和含有針對突變位點的錯配堿基的下游PCR引物，其中一條含有錯配堿基的下游PCR引物，該引物的3’端堿基序列位于突變位點上。利用所述引物，采用雙重PCR方法對暗紋東方飩不同性別DNA樣品可以得到不同的擴增結(jié)果，從而判斷暗紋東方飩雌雄性別差異。利用本發(fā)明所述技術(shù)方案能夠快速、準確地對暗紋東方飩未成熟幼魚的性別進行鑒定。
[0008]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的引物，所述引物包括擴增雌雄性別差異基因序列的上游引物AWF、下游引物AWR和含有針對單堿基突變位點的錯配堿基的下游引物Inner Reverse,
所述上游引物 AWF:5’ - GGCTACCAGAGAAGCTACAAC -3’ ；
所述下游引物 AWR:5’ - TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC -3’ ；
所述下游引物Inner Reverse:
5’- TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC -3’ 。
[0009]對上述技術(shù)方案的進一步改進:所述單堿基突變位點位于暗紋東方飩BMPR2基因上。
[0010]本發(fā)明還提供了利用所述引物快速檢測暗紋東方飩幼魚雌雄性別差異單堿基突變的方法，它包括以下步驟:采集待測暗紋東方飩幼魚樣品，提取暗紋東方飩幼魚的全基因組DNA ;采用所述上游引物AWF和下游引物AWR進行第一輪PCR擴增，進行電泳檢測，呈現(xiàn)545bp條帶的為雌雄性別差異基因序列，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋后作為模板，采用所述上游引物AWF和下游引物Inner Reverse進行第二輪PCR擴增，進行電泳檢測，擴增出341bp條帶的為暗紋東方飩雄性個體，該位置無擴增條帶的為暗紋東方飩雌性個體。
[0011]對上述技術(shù)方案的進一步改進:第一輪PCR擴增體系為25PL反應(yīng)體系，包括濃度ΙΟμΜ的引物AWF和引物AWR各為?μ?，濃度2.5mM的dNTP Ιμ?,濃度5U/^L的Taq DNA聚合酶 0.5μ?，含 Mg2+ 15 μΜ 的 1X Buffe 2.5μ?，DNA 模板 ?μ?，去離子水 18μ?。
[0012]對上述技術(shù)方案的進一步改進:所述第一輪PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C 5min,變性94°C 60s，退火58°C 45s，延伸72°C 45s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
[0013]對上述技術(shù)方案的進一步改進:第二輪PCR擴增體系為25μ?反應(yīng)體系，包括濃度ΙΟμΜ的引物AWF和引物AWR各為?μ?，濃度2.5mM的dNTP Ιμ?,濃度5U/^L的Taq DNA聚合酶 0.5μ?，含 Mg2+ 15 μΜ 的 1X Buffe 2.5μ?，DNA 模板 ?μ?，去離子水 18μ?。
[0014]對上述技術(shù)方案的進一步改進:所述第二輪PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C lmin,變性94°C 60s，退火64°C 45s，延伸72°C 45s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
[0015]對上述技術(shù)方案的進一步改進:第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為第二輪PCR的模板。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:本發(fā)明以暗紋東方飩幼魚雌雄個體的基因組DNA為實驗材料，針對暗紋東方飩雌雄個體雌雄性別差異基因上存在的單核苷酸突變位點，設(shè)計了分別擴增雌雄性別差異基因序列的一對上游PCR引物AWF、下游PCR引物AWR和含有針對突變位點的錯配堿基的下游PCR引物Inner Reverse0以暗紋東方飩幼魚DNA樣品為模板進行雙重PCR，采用雌雄性別差異基因序列的上游PCR引物AWF和擴增雌雄性別差異基因序列的下游PCR引物AWR進行第一輪PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，呈現(xiàn)545bp條帶的為雌雄性別差異基因序列，該序列包含單核苷酸突變位點，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板，采用擴增雌雄性別差異基因序列的上游PCR引物AWF和含有針對突變位點的錯配堿基的下游PCR引物Inner Reverse進行第二輪PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出341bp條帶的為暗紋東方飩雄性個體DNA樣品，該位置無擴增條帶的為暗紋東方飩雌性個體DNA樣品。采取本發(fā)明對30尾不同性別暗紋東方飩幼魚進行性別鑒定的結(jié)果與通過性腺組織切片方法鑒定的結(jié)果完全一致，因此通過對本發(fā)明的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳就可以對暗紋東方飩被測樣品的性別作出準確判斷。
[0017]本發(fā)明能夠以基因組DNA為模板，僅僅通過簡單的PCR和電泳結(jié)果就能夠進行基因型的鑒定，從而克服其他方法操作較繁瑣，耗時較長的缺點，尤其適合于對大樣本進行快速鑒定。
[0018]本發(fā)明成本低廉、操作簡單、快速、準確并適合于推廣應(yīng)用，可在提取I齡以內(nèi)暗紋東方飩幼魚基因組DNA的基礎(chǔ)上快速準確對暗紋東方飩幼魚的性別進行鑒定，對加快暗紋東方飩單性選育進程及分子生物學領(lǐng)域快速的PCR檢測方法研究有著重要的應(yīng)用價值。
[0019]結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實施方式】后，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將變得更加清
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【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是暗紋東方飩幼魚8個個體的性別差異基因的第一輪PCR反應(yīng)和第二輪PCR反應(yīng)后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，其中M為分子量標記，從下至上的條帶依次為lOObp、250bp、500bp、750bp、100bp和2000bp，750bp條帶亮度最大；1、3、5、7泳道為暗紋東方飩雌性幼魚，2、4、6、8泳道為暗紋東方飩雄性幼魚；9、10、11、12泳道為暗紋東方飩雄性幼魚，13、14、15、16泳道為暗紋東方飩雌性幼魚。

【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細的說明。
[0022]實施例1
本發(fā)明所述快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異的方法包括以下步驟:
1、樣品米集
本實施例采用不同性別的暗紋東方飩幼魚作為研究對象，所有30個個體均隨機抽取自江蘇中洋集團養(yǎng)殖的暗紋東方飩幼魚群體。每個個體分別取性腺組織放入Bouin’s液中固定24h，50%乙醇沖洗后置于70%乙醇中保存；剪取鰭條組織冷凍保存(_20°C)。
[0023]2、暗紋東方飩幼魚性腺組織切片和性別分化鑒定
將固定好的暗紋東方飩幼魚性腺組織樣品采用常規(guī)方法進行組織切片，切片厚度OMm, H.E染色。用OLYMPUS DP72顯微鏡觀察并拍照，在選取的30個暗紋東方飩幼魚個體中，經(jīng)過切片鑒定后，雌雄個體的比例為21:9。
[0024]3、提取暗紋東方飩幼魚的全基因組DNA
剪取暗紋東方飩幼魚的鰭條部分組織冷凍保存(_20°C )，采用天根公司的海洋動物基因組DNA提取試劑盒和方法，經(jīng)優(yōu)化后提取暗紋東方飩幼魚的基因組總DNA。具體步驟為:首先每個樣品取冷凍保存的鰭條組織20mg，加入200μ? GA溶液，漩渦震蕩15秒，加入20μ?Proteinase-K (20mg/mL)漩渦均勻后置于56°C下裂解I小時，然后加入200μ? GB，充分混勻后，70°C下放置10分鐘，然后加入200μ?無水乙醇，充分混合后將溶液和絮狀沉淀都加入到I個吸附柱CB3中，12000轉(zhuǎn)/分離心30秒，然后倒掉廢液，向吸附柱CB3中加入500μ?緩沖液GD，12000轉(zhuǎn)/分離心30秒，倒掉廢液，隨后向吸附柱CB3中加入700μ?漂洗液PW，12000轉(zhuǎn)/分離心30秒，倒掉廢液，隨后向吸附柱CB3中再加入500μ?漂洗液PW，12000轉(zhuǎn)/分離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3 12000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，倒掉廢液，空氣中晾干后置于一個干凈的離心管中，向吸附柱中心的吸附膜上加入50-100μ?洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，收集溶液到離心管中。
[0025]4、聚合酶鏈式反應(yīng)
本發(fā)明DNA模板采用4尾暗紋東方飩雄魚和4尾暗紋東方飩雌魚的全基因組DNA，各反應(yīng)成分的組成如下:
所述上游引物 AWF:5’ - GGCTACCAGAGAAGCTACAAC -3’ (SEQ ID No:1)；
所述下游引物 AWR:5’ - TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC -3’(SEQ ID No:2);
所述下游引物Inner Reverse:
5’- TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC -3’ (SEQ ID No:3)。
[0026]第一輪PCR擴增體系為25μ?反應(yīng)體系，包括:引物AffF (濃度ΙΟμΜ)和AWR (濃度ΙΟμΜ)各為 ?μ?，dNTP (濃度 2.5mM) ?μ?, Taq DNA 聚合酶(濃度 5U/^L) 0.5μ?, 1XBuffe(含 Mg2+ 15 μΜ) 2.5μ?, DNA 模板 ?μ?，去離子水 18μ?。
[0027]第一輪PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 5min，變性94°C 60s，退火58°C 45s，延伸72°C 45s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
[0028]第二輪PCR擴增體系為25μ?反應(yīng)體系，包括:引物AffF (濃度ΙΟμΜ)和AWR (濃度ΙΟμΜ)各為 ?μ?，dNTP (濃度 2.5mM) ?μ?, Taq DNA 聚合酶(濃度 5U/^L) 0.5μ?, 1XBuffe(含 Mg2+ 15 μΜ) 2.5μ?，DNA 模板 ?μ?，去離子水 18μ?。
[0029]第二輪PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C lmin，變性94 °C 60s，退火64 °C 45s，延伸72°C 45s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
5、結(jié)果與分析
第一輪和第二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR實驗樣品采用1%瓊脂糖凝膠電泳(110V，20min)將擴增條帶進行電泳分離，隨后用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測分析。第一輪PCR結(jié)果顯示:M為分子量標記(從下至上的條帶依次為100bp、250bp、500bp、750bp、100bp和2000bp，750bp條帶亮度最大)，1-4泳道為暗紋東方飩雄性幼魚，5-8泳道為暗紋東方飩雌性幼魚，檢測結(jié)果如圖1所示；泳道所有8個個體均擴增出545bp的性別差異基因條帶。
[0030]第二輪PCR結(jié)果顯示:M為分子量標記(從下至上的條帶依次為100bp、250bp、500bp、750bp、100bp和2000bp，750bp條帶亮度最大)；9、10、11、12泳道為暗紋東方飩雄性幼魚，13、14、15、16泳道為暗紋東方飩雌性幼魚，檢測結(jié)果如圖1所示，只有4個暗紋東方飩雄性幼魚個體能夠擴增出341bp的清晰條帶，而4個暗紋東方飩雄性幼魚個體在250bp-500bp范圍內(nèi)無擴增條帶。暗紋東方飩幼魚8個個體在提取基因組DNA前已經(jīng)通過性腺組織切片方法對性別進行了鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果與性腺切片鑒定結(jié)果完全一致。
[0031]本發(fā)明所述單堿基突變位點位于暗紋東方飩BMPR2 (bone morphogeneticprotein receptor type-2)基因上。
[0032]以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的引物，其特征在于:所述引物包括擴增性別差異基因序列的上游引物AWF、下游引物AWR和含有針對單堿基突變位點的錯配堿基的下游引物Inner Reverse: 所述上游引物 AWF:5’ - GGCTACCAGAGAAGCTACAAC -3’ ； 所述下游引物 AWR:5’ - TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC -3’ ； 所述下游引物Inner Reverse:
5’- TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC -3’ 。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的引物，其特征在于:單堿基突變位點位于暗紋東方飩BMPR2基因上。
3.利用權(quán)利要求1所述引物快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的方法，其特征在于它包括以下步驟: 采集待測暗紋東方飩幼魚樣品，提取暗紋東方飩幼魚的全基因組DNA ;采用所述上游引物AWF和下游引物AWR進行第一輪PCR擴增，進行電泳檢測，呈現(xiàn)545bp條帶的為性別差異基因序列；將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋后作為模板，采用所述上游引物AWF和下游引物InnerReverse進行第二輪PCR擴增，進行電泳檢測，擴增出341bp條帶的為暗紋東方飩雄性個體，該位置無擴增條帶的為暗紋東方飩雌性個體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的方法，其特征在于:第一輪PCR擴增體系為25μ?反應(yīng)體系，包括濃度ΙΟμΜ的引物AWF和引物AWR各為 lKL，濃度 2.5mM 的 dNTP Ιμ?,濃度 5U/^L 的 Taq DNA 聚合酶 0.5μ?,含 Mg2+ 15 μΜ 的1XBuffe 2.5μ?, DNA 模板 ?μ?，去離子水 18μ?。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的方法，其特征在于:所述第一輪PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C 5min，變性94°C60s，退火58°C45s，延伸72°C 45s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的方法，其特征在于:第二輪PCR擴增體系為25μ?反應(yīng)體系，包括濃度ΙΟμΜ的引物AWF和引物AWR各為1KL，濃度 2.5mM 的 dNTP ?μ?，濃度 5U/^L 的 Taq DNA 聚合酶 0.5μ?，含 Mg2+ 15 μΜ 的 1XBuffe 2.5μ?,，DNA 模板 ?μ?，去離子水 18μ?。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的方法，其特征在于:所述第二輪PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C lmin，變性94°C60s，退火64°C45s，延伸72°C 45s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測暗紋東方飩幼魚性別差異單堿基突變的方法，其特征在于:第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為第二輪PCR的模板。
【文檔編號】C12N15/11GK104372086SQ201410617802
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】劉濱, 胡鵬, 劉新富, 孟振, 楊志 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所