表達(dá)四種抗性蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速獲得多種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠方法，在構(gòu)建pInsulator4X-CAG-PHBN載體后，將pInsulator4X-CAG-PHBN載體與pInsulator4X-CAG載體分別用限制性內(nèi)切酶SwaI線性化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀之后進(jìn)行HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，再將pInsulator4X-CAG-PHBN載體原核注射，得到同時(shí)具有四種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用一次打靶獲得具有四種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)該方法得到的小鼠只需要維持這一個(gè)小鼠品系既可以獲得四種抗性的MEF，應(yīng)用2A肽創(chuàng)造了獲得多種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠新方法。
【專利說(shuō)明】表達(dá)四種抗性蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速獲得多種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠及多種抗性的腿？。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003]自1980年第一只轉(zhuǎn)基因小鼠誕生以來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因小鼠模型目前已經(jīng)成為基因功能研究的一個(gè)最重要工具?；虼虬屑夹g(shù)作為諸多轉(zhuǎn)基因小鼠制備方法中的一種，倍受研究者的青睞。它是基于同源重組的原理，定點(diǎn)敲除、敲入或者進(jìn)行基因的突變而對(duì)小鼠的內(nèi)源基因進(jìn)行改造?；虼虬械氖荏w細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)通常需要小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(101186 ￡111131-701110腿？)來(lái)作為滋養(yǎng)層細(xì)胞?；虼虬兄笮枰剐运幬锏暮Y選才能獲得陽(yáng)性克隆，尤其是近來(lái)研究者熱衷于一株干細(xì)胞的多基因連續(xù)打靶，這就需要兩種或者多種抗性的12？來(lái)滿足實(shí)驗(yàn)需求。目前商品化的4種抗性的腿？是從了％匕011實(shí)驗(yàn)室0卜4小鼠中分離的。0卜4小鼠是將4個(gè)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)全部配成純和來(lái)維系的，且抗性表達(dá)不高。因此，傳統(tǒng)獲得多種抗性轉(zhuǎn)基因小鼠的方法已經(jīng)不能滿足研究的要求。
[0004]轉(zhuǎn)基因動(dòng)物￡11111118118 )是通過(guò)人工的方法，將外源基因?qū)雱?dòng)物基因組內(nèi)使之與動(dòng)物基因組整合穩(wěn)定表達(dá)并遺傳給后代的動(dòng)物⑴。目前已經(jīng)成功制備了很多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，比如:牛、羊、雞、豬、魚(yú)、兔、鼠、果蠅等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)首先是在小鼠上建立起來(lái)的，也因此小鼠成為生命科學(xué)發(fā)展的一個(gè)很得力的動(dòng)物模型。自1980年第一只轉(zhuǎn)基因小鼠誕生以來(lái)，很多研究者紛紛開(kāi)展轉(zhuǎn)基因小鼠研究工作，轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法由最開(kāi)始的原核注射到如今已經(jīng)產(chǎn)生了很多種制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。但是目前制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型主要有兩種基本方法:一種是轉(zhuǎn)基因，另一種是基因打靶。
[0005]轉(zhuǎn)基因是將外源基因引入小鼠基因組內(nèi)。主要有原核注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染法(慢病毒侵染法)以及胚胎干細(xì)胞法。這3種方法可以實(shí)現(xiàn)將外源基因轉(zhuǎn)移到小鼠基因組內(nèi)。原核注射法是直接將克隆的載體通過(guò)顯微注射的方法注射到小鼠的受精卵原核中，實(shí)現(xiàn)克隆基因的整合表達(dá)。這是非常經(jīng)典的一種轉(zhuǎn)基因方法。它的優(yōu)點(diǎn)是可以有效的注射大小可達(dá)幾個(gè)1?到幾百個(gè)1?的外源0嫩片段，而且可以有效的整合到小鼠的基因組中。當(dāng)然，它的缺點(diǎn)毋庸置疑就是原核注射法它的效率不高，一般需注射500-600個(gè)受精卵才能得到3-4個(gè)首建鼠，甚至得不到。即使有了首建鼠，即外源基因已經(jīng)整合到小鼠的基因組內(nèi)，但是往往就會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠在后期不表達(dá)。另一種是逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染法，它可以通過(guò)侵染小鼠著床前胚胎細(xì)胞或者著床后胚胎細(xì)胞，將外援的0嫩轉(zhuǎn)移到小鼠基因組中。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，很多通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染法得到的轉(zhuǎn)基因小鼠的轉(zhuǎn)基因片段因發(fā)生甲基化而不表達(dá)。慢病毒因克服了基因沉默而優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄病毒，但慢病毒載體侵染法對(duì)外源0嫩片段的大小有限制而且整合的外源基因不是集中分布的，所以我們不能通過(guò)慢病毒載體侵染法在基因組的某個(gè)部位插入多個(gè)拷貝的外源基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因的高表達(dá)。還有一種方法是胚胎干細(xì)胞法，也被稱為是￡3細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因。這一技術(shù)是建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)之上的。胚胎干細(xì)胞法有很多優(yōu)點(diǎn)，如它可以在載體構(gòu)建的時(shí)候引入一個(gè)正篩選標(biāo)記基因，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后可以在培養(yǎng)皿中篩選得到外源基因表達(dá)量高的細(xì)胞株。而且￡3細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因傾向于單拷貝整合，那么可以在幾百個(gè)克隆中選出單拷貝、普遍高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因￡8細(xì)胞系。將這些細(xì)胞株注射到小鼠囊胚中，得到嵌合體再傳代極有可能是外源基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因小鼠。一定程度上減少了通過(guò)原核注射得到的轉(zhuǎn)基因小鼠，在后期對(duì)首建鼠(^(161-)轉(zhuǎn)基因表達(dá)高低篩選的工作量。胚胎干細(xì)胞法在載體的構(gòu)建上還可以引入報(bào)告基因、1似？等位點(diǎn)，使得￡3細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因可以在時(shí)空表達(dá)上受到一定的控制。胚胎干細(xì)胞法也有缺點(diǎn)，它在技術(shù)上要求更高。比如通過(guò)這種方法制備的轉(zhuǎn)基因一定是在￡3細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)上相當(dāng)熟練，因?yàn)椤?細(xì)胞在培養(yǎng)的過(guò)程中很容易因細(xì)胞分化而失去了全能性。
[0006]基因打靶是利用同源重組的方法改變小鼠的內(nèi)源基因⑽。基因打靶也被稱為“基因敲除”。小鼠細(xì)胞基因組中的一段0嫩序列被稱為“靶子”，與要引入的外源基因0嫩序列被稱為“彈頭”進(jìn)行準(zhǔn)確的定點(diǎn)整合。因而就需要在彈頭的兩端設(shè)計(jì)與靶子兩側(cè)一樣的0嫩序列，稱為同源臂。打靶載體含有一段同源區(qū)段、外源基因、陽(yáng)性篩選基因(一般是新霉素抗性基因?、一段同源區(qū)段以及負(fù)選擇標(biāo)志(一般是單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶-讓)基因序列這些是一個(gè)經(jīng)典的基因打靶載體所需元件。在1989年，(?%⑶卜丨⑽等利用類似設(shè)計(jì)的打靶載體通過(guò)￡3細(xì)胞基因打靶得到了一個(gè)基因敲除鼠?；虼虬械氖荏w細(xì)胞一般是￡3細(xì)胞?！?細(xì)胞是從129^小鼠見(jiàn)栓3.5天囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離而來(lái)的?！?細(xì)胞很容易分化，所以￡3細(xì)胞的培養(yǎng)在基因打靶的整個(gè)事件中是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。同時(shí)這也成為了基因打靶的一個(gè)難點(diǎn)?！?細(xì)胞的培養(yǎng)需要提供白血病抑制因子(匕業(yè)咖匕1111111311:01~71117)以及作為滋養(yǎng)層細(xì)胞(^66(161 0611)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞
(101186 ￡111131-701110 ^1131-0)31881:,)。
[0007]目前科學(xué)家們已經(jīng)獲得了潮霉素88 )抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠，新霉素(86011170111)抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠，嘌呤抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠和6-硫代鳥(niǎo)嘌呤(6-111108皿111116，6X6)抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。這四種單一抗性的腿？轉(zhuǎn)基因小鼠為基因打靶在選擇陽(yáng)性篩選基因時(shí)提供了很大的便利，但是事實(shí)上，分離單一抗性的12？很浪費(fèi)時(shí)間和精力，同時(shí)還得維持這幾種小鼠品系。而且很多基因打靶實(shí)驗(yàn)需要的是連續(xù)的多種抗性的腿？篩選，鑒于這樣實(shí)驗(yàn)的要求，把48011實(shí)驗(yàn)室利用新霉素抗性和嘌呤抗性的小鼠、潮霉素抗性的小鼠以及6X6抗性的小鼠兩種兩種雜交，直至純合之后再雜交，純合之后就是如今我們?cè)谑袌?chǎng)上買(mǎi)到的08-4小鼠。08-4小鼠能表達(dá)四種抗性蛋白用來(lái)分離含有四種抗性的腿?，供胚胎干細(xì)胞基因打靶后陽(yáng)性克隆的篩選所用。這是一個(gè)非常實(shí)用的想法。但是該方法在操作起來(lái)很耗時(shí)間而且需要投入很多精力。在很長(zhǎng)的一段時(shí)間需要維持這三種小鼠的品系。然后再兩種兩種去配小鼠，做基因型鑒定。比如說(shuō)兩種小鼠純合之后還要進(jìn)行下一輪的配小鼠做鑒定。要使的三對(duì)基因純合需要很長(zhǎng)的時(shí)間。而且任何時(shí)候只要有一只小鼠在配的時(shí)候出現(xiàn)問(wèn)題，可能會(huì)導(dǎo)致以前純合的小鼠會(huì)發(fā)生性狀的分離。而且0卜4小鼠四種抗性基因表達(dá)量沒(méi)有保障。08-4小鼠遠(yuǎn)在美國(guó)，我們想做基因打靶、想做兩次基因打靶、想用四種抗性的小鼠只能花錢(qián)拿到0卜4小鼠的腿？或者已經(jīng)處理過(guò)的￡66(161^而腿？傳代有限。迄今為止，國(guó)內(nèi)尚未出現(xiàn)同時(shí)表達(dá)4種抗性基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0008]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是為了解決多種抗性轉(zhuǎn)基因小鼠難以獲得的問(wèn)題，而提出一種快速構(gòu)建表達(dá)四種抗性蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，成功構(gòu)建了表達(dá)四種抗性蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0010]本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
構(gòu)建完圖1中所示的剛載體后，將剛載體與載體分別用限制性內(nèi)切酶線性化、酹氯仿抽提、乙醇沉淀之后進(jìn)行冊(cè)1(293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，最終獲得圖3所示的結(jié)果，結(jié)果顯示？1118111社014^-0^-？！1剛載體在真核細(xì)胞中高表達(dá)四種抗生素。然后將1)1118111社載體原核注射，得到轉(zhuǎn)基因小鼠，并且通過(guò)基因型鑒定結(jié)果圖4，確認(rèn)最終獲得6只同時(shí)具有四種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0011]此外，將圖1中所示的剛質(zhì)粒通過(guò)核轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染到胚胎干細(xì)胞中，用新霉素篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性克隆，再將克隆消化進(jìn)行囊胚注射，移植到代孕鼠體內(nèi)，17天之后發(fā)現(xiàn)有高嵌合體小鼠，經(jīng)基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)基因都有整合(圖4所示將嵌合體小鼠與86小鼠合攏，發(fā)現(xiàn)嵌合體小鼠可以傳代，得到了一只(:57/816顏色的小鼠。經(jīng)基因型鑒定是4八轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0012]有益效果
本發(fā)明對(duì)比已有技術(shù)具有以下創(chuàng)新點(diǎn):
1、將2八肽應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建
2、成功構(gòu)建了同時(shí)具有嘌呤霉素、潮霉素、殺稻瘟菌素3滅瘟素和新霉素四種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0013]本發(fā)明對(duì)比已有技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
1、利用一次打靶即可獲得具有四種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠
2、通過(guò)該轉(zhuǎn)基因方法得到的轉(zhuǎn)基因小鼠只需要維持這一個(gè)小鼠品系既可以獲得四種抗性的腿？
3、2八肽是一種多順?lè)醋虞d體，即在一個(gè)載體上實(shí)現(xiàn)多種基因的共表達(dá)，本發(fā)明將2八肽應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明方法中剛載體的示意圖；
？！！剛代表四種抗生素分別是:嘌呤霉素潮霉素殺稻痕菌素3滅瘟素3)以及新霉素(他嘯丫七!!)。？2八、12八、￡2八是一類2八肽分別是口蹄疫病毒0186886 71^11868，[107) ( ？2八)、馬鼻炎八病毒(2叫11161^11111:18八^11-118, 2狀乂)(￡2八)以及昆蟲(chóng)病毒(12八)。1118111511:01'是一種阻隔子，可以保護(hù)表達(dá)元件的表達(dá)免受周圍其他元件的干擾。代表啟動(dòng)子。
[0015]圖2為本發(fā)明方法中技術(shù)路線的示意圖；
圖3為本發(fā)明實(shí)施例的示意圖；
圖4為本發(fā)明實(shí)施例的示意圖；
以四種抗性其中的兩種抗性做小鼠的基因型鑒定。上面的條帶是以潮霉素(078^011170111)作為引物做基因型鑒定，條帶大小約為200如；下面的條帶是以殺稻痕菌素3滅痕素3)作為引物做基因型鑒定，條帶大小約為420如。1虹1^61~為￠111811。
[0016]圖5為本發(fā)明實(shí)施例的示意圖。
[0017]圖5表示嵌合體小鼠的誕生以及基因型的鑒定。這兩只嵌合體小鼠的基因型鑒定，從上往下依次是嘌呤霉素、潮霉素、殺稻瘟菌素3滅瘟素以及新霉素。最左面的兩條帶是以這兩只嵌合體小鼠基因組0嫩為模板做的？0？，后兩條帶是以4八質(zhì)粒以及4八胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克隆的基因組0嫩為模板作為陽(yáng)性對(duì)照做的，最右側(cè)條帶是陰性對(duì)照。
[0018]

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0020]本發(fā)明的基本思想是利用2八肽原理通過(guò)一次打靶即獲得具有四種抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0021]實(shí)施例1:
1、已知 1^0嫩01~1？111~0、^61？2? 嫩6-1^ 以及沾451 中分別含有11781~011170111 ? 131881:101(1111以及^601117(3111序列，以這些質(zhì)粒為模板通過(guò)？(?的方法得到這四種基因片段，并且在？(?的時(shí)候引入不同的酶切位點(diǎn)。然后將這些序列克隆到12、￡2八合成質(zhì)粒中。每一次的克隆都需要嚴(yán)格的測(cè)序最終得到即70111-^2^-117^011170111-12^-81881:101(1111-22^-^6011170111 這一載體。將這個(gè)載體用?01:1 和取1 II雙酶切回收作為片段克隆到用價(jià)和恥11雙酶切的1)1118111社載體中得到III8111載體。
[0022]2、檢測(cè)￠1118111社剛載體是否表達(dá)這四種抗生素:￠1118111社01~4^-0^-？！1剛載體與￠111811181:01~4^~0^6載體分別用限制性內(nèi)切酶3冊(cè)I線性化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀之后進(jìn)行冊(cè)1(293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。48小時(shí)之后將細(xì)胞按30%的密度鋪到24孔板，貼壁后進(jìn)行抗生素的篩選，7天后我們可以看到同樣操作的情況下，在四種不同抗生素濃度下，冊(cè)1(293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染0118111社剛線性化載體與冊(cè)1(293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染沒(méi)有抗性的線性化載體間細(xì)胞的數(shù)目變化情況，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)得到如下數(shù)據(jù)(圖3)0結(jié)果顯示載體在真核細(xì)胞中高表達(dá)四種抗生素。同時(shí)我們還進(jìn)行了多個(gè)抗生素一起篩選轉(zhuǎn)染0118111社剛的冊(cè)1(293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍然生長(zhǎng)的很好，說(shuō)明轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞這四種抗生素都有表達(dá)。
[0023]3、載體原核注射:將載體用3冊(cè)I線性化、凝膠分離以及最終用811打61'稀釋載體0嫩到2118八11。用這個(gè)濃度的0嫩進(jìn)行原核注射。我們注射了 800個(gè)卵，在出生的小鼠中經(jīng)過(guò)基因型鑒定最終得到有6只小鼠是轉(zhuǎn)基因小鼠首建鼠(圖4)0
[0024]實(shí)施例2:
1、分離胚胎干細(xì)胞，測(cè)得其新霉素抗性臨界值在700118加1。
[0025]2、將0118111社剛質(zhì)粒通過(guò)核轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染到胚胎干細(xì)胞中，在新霉素1000118加1的濃度下篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性克隆，3天之后我們可以看到克隆的出現(xiàn)，將克隆消化進(jìn)行囊胚注射，移植到代孕鼠。
[0026]3、17天之后發(fā)現(xiàn)有高嵌合體小鼠。經(jīng)基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)基因都有整合(圖5?0將嵌合體小鼠與86小鼠合攏，發(fā)現(xiàn)嵌合體小鼠可以傳代，得到了一只057/816顏色的小鼠。經(jīng)基因型鑒定是4八轉(zhuǎn)基因小鼠。
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)四種抗性蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征是:構(gòu)建PI n su I at or 4X-CAG-PHBN 載體后，將 pInsulator4X-CAG_PHBN 載體與 pInsulator4X_CAG 載體分別用限制性內(nèi)切酶SwaI線性化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀之后進(jìn)行HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，最終獲得結(jié)果顯示pInsulator4X-CAG-PHBN載體在真核細(xì)胞中高表達(dá)四種抗生素，然后將pInsulator4X-CAG-PHBN載體原核注射，得到轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)基因型鑒定結(jié)果確認(rèn)最終獲得同時(shí)具有四種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。
2.表達(dá)四種抗性蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征是:將PI n su I at or 4X-CAG-PHBN質(zhì)粒通過(guò)核轉(zhuǎn)染的方法,轉(zhuǎn)染到胚胎干細(xì)胞中，用新霉素篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性克隆，再將克隆消化進(jìn)行囊胚注射，移植到代孕鼠體內(nèi)，17天之后發(fā)現(xiàn)有高嵌合體小鼠，經(jīng)基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)基因都有整合，將嵌合體小鼠與B6小鼠合攏，發(fā)現(xiàn)嵌合體小鼠可以傳代，得到了 C57/BL6顏色的小鼠，經(jīng)基因型鑒定為4A轉(zhuǎn)基因小鼠。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104404081SQ201410618785
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】張祿卿, 鄭耀武, 班路瑩 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)