一株發(fā)根根瘤菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株發(fā)根根瘤菌及其應(yīng)用。該發(fā)根根瘤菌的分類命名為發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)gxas-815，其保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2013326。該發(fā)根根瘤菌可用于以蔗糖為主要原料的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)多糖。本發(fā)明利用發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)gxas-815發(fā)酵生產(chǎn)多糖效率高，成本低，易于工業(yè)化。CCTCCNO:M201332620140710
【專利說(shuō)明】一株發(fā)根根瘤菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一株發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) gxas-815,是從廣西北海潿洲島采集樣品篩選獲得，該菌株可應(yīng)用于以蔗糖為主要原料的 發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)多糖。

【背景技術(shù)】
[0002] 微生物多糖主要指大部分細(xì)菌、少量真菌和藻類產(chǎn)生的多糖，其在細(xì)胞內(nèi)主要有 三種存在形式：胞壁多糖、胞外多糖和胞內(nèi)多糖。其中胞外多糖易于與菌體分離、產(chǎn)量大、 可通過(guò)深層發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而得到廣泛關(guān)注。微生物多糖由于具有安全性高、副作用 小、理化特性獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)而使其在食品和非食品工業(yè)備受關(guān)注，可作為穩(wěn)定劑、膠凝劑、增 稠劑、成膜劑、乳化劑、懸浮劑和潤(rùn)滑劑等廣泛應(yīng)用于石油、化工、食品和制藥等各個(gè)行業(yè)。
[0003] 1936年Shear發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)腫瘤抵抗活性，微生物多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用 潛力。據(jù)研究報(bào)道，微生物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌癥、抗病毒的功效，通過(guò)生物工程手段對(duì) 產(chǎn)多糖微生物的代謝途徑進(jìn)行改造，使這些基因工程菌株能夠合成新的高效廣譜抗病毒、 抗細(xì)菌的多糖，這將是糖工程的重點(diǎn)研究方向之一。因微生物多糖適合產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn) 并且生產(chǎn)成本相對(duì)低廉，與生物化工修飾相結(jié)合來(lái)獲得高效、具有廣譜抗病毒、病菌的多糖 藥物，將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0004] 微生物多糖主要是以淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。能夠 產(chǎn)生微生物胞外多糖的微生物種類較多，但是真正有應(yīng)用價(jià)值并已進(jìn)行或接近工業(yè)化生產(chǎn) 的僅十幾種。隨著對(duì)微生物多糖研究的不斷深入，世界上微生物多糖的產(chǎn)量和年增長(zhǎng)量在 10%以上，而一些新興多糖年增長(zhǎng)量在30%以上。
[0005] 根瘤菌與宿主植物的共生結(jié)瘤過(guò)程，需要各種多糖類物質(zhì)的參與，并能產(chǎn)生胞外 多糖（EPS)、莢膜多糖（KPS)、脂多糖（LPS)和環(huán)狀葡聚糖四種多糖類物質(zhì)。根瘤菌體表的胞 外多糖不僅具有富集環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)元素的功能，還對(duì)于無(wú)定型根瘤的共生固氮過(guò)程具有重要 作用，它可以作為根瘤菌與宿主植物相互作用時(shí)的信號(hào)分子，在協(xié)助根瘤菌吸附宿主根毛、 改變宿主根毛細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、促進(jìn)侵入線形成、決定宿主專一性、保護(hù)自身抵御宿主防御系 統(tǒng)反應(yīng)等共生過(guò)程中具有更為復(fù)雜的作用。根瘤菌除了作為具有固氮功能的微生物材料加 以研究外，對(duì)其產(chǎn)生的胞外多糖也引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。
[0006] 鑒于許多生物活性多糖具有調(diào)節(jié)人體生理功能與增強(qiáng)免疫力的作用，在抗癌與抗 病毒病方面顯示出了極大的潛力，活性多糖的研究已成為國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)課題。根瘤菌胞外 多糖的研究在國(guó)際上有著廣泛、持續(xù)的興趣。首先是由于根瘤菌胞外多糖對(duì)根瘤菌與它們 寄主植物間的專一性起著重要的作用比火根瘤菌的血清學(xué)專一性也依賴于它們的多糖；其 次根瘤菌中的許多菌株能產(chǎn)生大粘度的或具有某些特殊流變學(xué)性能的胞外多糖。韓勇等獲 得一株錦雞兒根瘤菌（Rhizobium Sp.N613)，能產(chǎn)生豐富的胞外多糖（REPS)，試驗(yàn)表明：該 多糖具有良好的增稠性和免疫活性，有望作為食品增稠劑和免疫功能增強(qiáng)劑。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)發(fā)根根瘤菌應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道，只有將發(fā)根根瘤菌制成菌劑用于防 治番茄青枯病，而未見(jiàn)發(fā)根根瘤菌其它用途的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一株發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes)gxas-815及其應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明的發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes)gxas_815的保藏編號(hào)為CCTCC NO. M 2013326,其是從廣西北海潿洲島采集樣品篩選獲得的，其分離篩選步驟如下：
[0010] (1)采樣：從廣西北海潿洲島采集土壤樣品；
[0011] (2)富集：每個(gè)樣品各稱取Ig分別置于富集培養(yǎng)基中，于30°C搖床、220轉(zhuǎn)/分培 養(yǎng)72小時(shí)，挑選發(fā)酵醪粘度較高進(jìn)行初篩；
[0012] (3)初篩：將發(fā)酵醪粘度較高的樣品稀釋涂布初篩平板培養(yǎng)基上，將涂布好樣品 的初篩平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑選菌落較大、表面隆起、乳白色或半透明，邊 緣整齊，具光澤的菌落進(jìn)行復(fù)篩；
[0013] (4)復(fù)篩：從初篩培養(yǎng)基平板上挑選單菌落接種于蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，將已接種 好單菌落的發(fā)酵三角瓶置于30°C搖床、220轉(zhuǎn)/分發(fā)酵72小時(shí)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心、沉淀、 烘干、稱量、分析，最終選定一株利用蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)多糖產(chǎn)量較高的菌株；
[0014] (5)鑒定：該菌株經(jīng)16S rRNA鑒定為發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes)。
[0015] 其中，富集培養(yǎng)基（g/L)為：鹿糖30g，蛋白胨5g，酵母膏3g，氯化鈉5g，用蒸饋水 定容到IOOOmL,調(diào)pH至7.0 ;初篩平板培養(yǎng)基（g/L)為：蔗糖30g，蛋白胨5g，酵母膏3g，氯 化鈉5g，瓊脂20g，用蒸餾水定容到IOOOmL,調(diào)pH至7. 0 ;蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)為：蔗糖 30g，硫酸銨3g，磷酸氫二鈉2. 5g，硫酸鉀2. 0g，無(wú)水硫酸鎂3g，用蒸餾水定容到lOOOmL，調(diào) pH 至 7. 0。
[0016] 另外，本發(fā)明也提供的該發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) gxas-815在用于發(fā) 酵生產(chǎn)多糖中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes)gxas-815可用于以鹿糖為主要原 料的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)多糖，每升發(fā)酵液多糖產(chǎn)量可達(dá)14. 09g。
[0018] 本發(fā)明的有益效果
[0019] 1、本發(fā)明從自然界中分離篩選出一種能利用蔗糖為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)多糖的新 菌株，進(jìn)一步拓寬了利用微生物生產(chǎn)微生物多糖的菌種。
[0020] 2、本發(fā)明利用發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) gxas-815發(fā)酵生產(chǎn)多糖的效 率高，且成本低，易于工業(yè)化。
[0021] 保藏信息說(shuō)明
[0022] 發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) gxas-815,其保藏編號(hào)為 CCTCC NO. M 2013326,保藏日期為2013年7月10日，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為 中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下列實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0024] 實(shí)施例1 :發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes) gxas-815的分離、篩選與鑒定
[0025] 富集培養(yǎng)基（g/L):鹿糖30g，蛋白胨5g，酵母膏3g，氯化鈉5g，用蒸饋水定容到 IOOOmL,調(diào) pH 至 7. 0。
[0026] 初篩平板培養(yǎng)基（g/L):鹿糖30g，蛋白胨5g，酵母膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸饋 水 IOOOmL,調(diào) pH 至 7. 0。
[0027] 蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):蔗糖30g，硫酸銨3g，磷酸氫二鈉2. 5g，硫酸鉀2. Og，無(wú)水 硫酸鎂3g，用蒸餾水定容到IOOOmL,調(diào)pH至7. 0。
[0028] 本發(fā)明提供的發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) gxas-815的分離、篩選與鑒 定，其具體步驟如下：
[0029] (1)采集：采集自廣西北海潿洲島的土壤樣品10份。
[0030] (2)富集：每個(gè)樣品各稱取Ig分別接種到裝有富集培養(yǎng)基的三角瓶中，將以上成 份混合均勻，分裝于250mL容積的三角瓶中，每瓶裝50mL，115°C高壓滅菌20分鐘。將已接 種好的三角瓶置于溫度30°C的搖床、轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)72小時(shí)，挑選發(fā)酵醪粘度較高的 進(jìn)行初篩。
[0031] (3)初篩：將發(fā)酵醪粘度較高的樣品稀釋涂布初篩平板培養(yǎng)基上，115°C高壓滅菌 20分鐘。將涂布好樣品的初篩平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑選菌落較大、表面隆 起、乳白色或半透明，邊緣整齊，具光澤的菌落進(jìn)行復(fù)篩。
[0032] (4)復(fù)篩：從初篩培養(yǎng)基平板上挑選單菌落接種于蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，將已接種 好單菌落的發(fā)酵三角瓶置于溫度30°C的搖床、轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分發(fā)酵72小時(shí)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行 離心去菌體后乙醇沉淀、烘干用分析天平稱量分析，最終選定一株利用蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)多糖 產(chǎn)量較高的菌株命名為gxas-815。
[0033] (5)鑒定：通過(guò)對(duì)菌株gxas-815測(cè)序得到菌株的序列為SEQ ID NO. 1所示，對(duì)菌 株 gxas-815 的 16S rRNA 序列分析，菌株 gxas-815 與發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) 的16S rRNA基因的相似性為99%，因而確定gxas-815菌株為發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes)〇
[0034] 實(shí)施例2 :發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes) gxas-815發(fā)酵生產(chǎn)多糖
[0035] 平板培養(yǎng)基（g/L):鹿糖30g，蛋白胨5g，酵母膏3g，氯化鈉5g，用蒸饋水定容到 IOOOmL,調(diào) pH 至 7. 0。
[0036] 種子培養(yǎng)基（g/L):鹿糖30g，蛋白胨5g，酵母膏3g，氯化鈉5g，用蒸饋水定容到 IOOOmL,調(diào) ρΗ7· 0。
[0037] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):蔗糖30g，硫酸銨3g，磷酸氫二鈉2. 5g，硫酸鉀2. 0g，無(wú)水硫酸 鎂3g，用蒸餾水定容到IOOOmL,調(diào)pH至7. 0。
[0038] 本發(fā)明的發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) gxas-815發(fā)酵生產(chǎn)多糖的方法如 下：取甘油保藏的發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes) gxas-815涂布到平板培養(yǎng)基上，置 于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)20小時(shí)。挑單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，于溫度30°C的搖床、轉(zhuǎn)速220 轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至〇D_為1. 0,然后按照體積百分含量為10 %的接種量接種到裝50mL發(fā)酵培 養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度30°C的搖床、轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分發(fā)酵72小時(shí)。
[0039] 實(shí)施例3 :發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes) gxas-815發(fā)酵生產(chǎn)多糖的產(chǎn)量分 析
[0040] 將發(fā)酵液在溫度為80°C的水浴加熱30分鐘、轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分離心，取上清液， 加入2倍體積的溫度為4°C的冰冷乙醇，靜置30分鐘、轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)離心、收集沉淀，將沉 淀物烘干，用水溶解，獲得粗制的凝膠狀多糖水溶液。將其再用2倍體積的冰冷乙醇進(jìn)行沉 淀，沉淀物經(jīng)干燥，即得精制的凝膠狀多糖。經(jīng)稱重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每升發(fā)酵液多糖產(chǎn)量最高可 達(dá) 14. 09g。
[0041] 通過(guò)以上實(shí)例可以看出，該發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes)gxas_815具有良 好的發(fā)酵性能，該菌種生產(chǎn)多糖效率高，具有良好的發(fā)酵優(yōu)化和遺傳改造前景，具有重要的 工業(yè)應(yīng)用價(jià)值
[0042] 前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和例證的目的。這些描述 并非想將本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變 和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng) 用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及 各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一株發(fā)根根瘤菌，其分類命名為發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes)gxas-815,保 藏編號(hào)為 CCTCC NO. M 2013326。
2. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)根根瘤菌在發(fā)酵生產(chǎn)多糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104403966SQ201410620034
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】杜麗琴, 閉海, 裴建新, 龐浩, 江民華, 唐婷婷, 林厚民, 韋宇拓 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)