一種牡丹PseIF5A基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牡丹PseIF5A基因及其應(yīng)用，所述牡丹PseIF5A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明將所述PseIF5A基因轉(zhuǎn)入煙草中表達，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草在-10℃/3h冷脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因煙草植株未發(fā)生明顯的形態(tài)變化，而野生型煙草出現(xiàn)嚴重萎蔫，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草具有更強的耐冷性，表明本發(fā)明的牡丹PseIF5A基因在煙草中異源表達能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草對冷脅迫的耐性。
【專利說明】-種牡丹Pse IF5A基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，具體涉及一種牡丹PseIF5A 基因及其應(yīng)用，特別涉及一種在牡丹中表達的PseIF5A(牡丹真核生物翻譯起始因子： Paeonia suffruticosa Andr.，PseIF5A)的克隆，轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，煙草的轉(zhuǎn)化，以及所 述牡丹PseIF5A基因在提高轉(zhuǎn)基因植物的冷脅迫抗性中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 真核生物起始因子5A(eIF5A)是真核生物中目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種含有特殊氨基 酸殘基-賴氨酸殘基（hypusine)的高度保守性蛋白質(zhì)。該賴氨酸殘基是通過翻譯后的兩步 修飾而成，參與這兩步修飾的酶分別是脫氧羧腐胺賴氨酸合酶（deoxyhypusine synthase, DHS) (EC 2·5· 1.46)和脫氧輕腐胺賴氨酸輕化酶（deoxyhypusine hydroxylase, DHH) (EC1. 14. 99. 29)。成熟的eIF5A是經(jīng)過賴氨酸殘基翻譯后修飾才起作用。
[0003] eIF5A是最早在哺乳動物的血紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，因其能在體外實驗中促進翻譯起 始階段第一個肽鍵的形成，因而被命名為翻譯起始因子。然而，近期的研究發(fā)現(xiàn)eIF5A在 細胞內(nèi)其實主要參與翻譯的延伸過程。eIF5A雖然在真核細胞中高度保守且組成型表達， 然而，有研究表明敲除eIF5A基因的細胞的蛋白合成量仍能占同類正常細胞蛋白合成量的 70%，這說明eIF5A并非所有蛋白合成過程所必需的因子，而可能只是在某些特殊代謝途 徑中合成蛋白所需。此外，還發(fā)現(xiàn)eIF5A作為一種核質(zhì)穿梭蛋白，從核內(nèi)向胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運某些 特殊mRNAs并參與其翻譯過程。
[0004] 在植物中，已經(jīng)克隆出eIF5A基因的物種有紫花苜蓿、煙草、玉米、番茄、水稻和擬 南芥。Wang等人（Wang T W等，Plant Mol Biol，2003)發(fā)現(xiàn)抑制擬南芥和番茄的DHS基因 的表達能延緩植物的衰老，這意味著eIF5A有可能參與了植物細胞的程序性死亡途徑。擬 南芥中已知有三個eIF5A同源基因，其中，AteIF5A-l被證明參與植物木質(zhì)部的發(fā)育過程， AteIF5A-2則在細胞的生長發(fā)育及程序性死亡過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，雖然eIF5A已 經(jīng)被證明參與翻譯延伸，mRNA轉(zhuǎn)運以及細胞的生長發(fā)育和程序性死亡，但在高等植物中，對 其生理生化功能的研究報道仍然甚少。
[0005] 牡丹（paeonia suffructicosa)是我國特有的木本名貴花舟，是中國國花，有數(shù)千 年的自然生長和兩千多年的人工栽培歷史。牡丹素有〃國色天香〃、〃花中之王〃的美稱， 是重要的園林觀賞花卉之一。隨著生活水平的提高，園林觀賞植物越來越受到人們關(guān)注，研 究觀賞植物對溫度逆境抗性的遺傳機制有廣泛的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹PseIF5A基因及其應(yīng)用，將該牡丹PseIF5A基因 轉(zhuǎn)化煙草，可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的冷脅迫抗性。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種牡丹PseIF5A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，長度為480bp。
[0009] 所述的牡丹PseIF5A基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，由 159個氨基酸殘基組成，分子量為17335. 92道爾頓，pi為6. 122。
[0010] 一種牡丹PseIF5A基因在提高轉(zhuǎn)基因煙草的冷脅迫抗性中的應(yīng)用。將本發(fā)明 所述牡丹PseIF5A基因的開放閱讀框連接于載體pCAMBIA11300中，獲得重組表達載體 pCAMBIA11300-PseIF5A，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，以農(nóng)桿菌浸染法（葉盤法）轉(zhuǎn)化煙草葉片， 得到轉(zhuǎn)基因煙草。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草（pCAMBIA1300-PseIF5A)比野生型煙草（CK)具有 更強的冷脅迫抗性。
[0011] 在本發(fā)明中，術(shù)語"牡丹PseIF5A基因的開放閱讀框"指編碼完整的牡丹PseIF5A 蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-477位的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 1、本發(fā)明首次從牡丹中克隆出如SEQ ID NO. 1所示的PseIF5A基因，在核苷酸 水平上，PseIF5A基因與葡萄真核生物翻譯起始因子基因2(eukaryotic translation initiation factor5A_2_like)基因的mRNA編碼序列有80%的同源性。在氨基酸水平上， PseIF5A基因與葡萄真核生物翻譯起始因子基因2蛋白質(zhì)的氨基酸殘基有86%的相似性。
[0014] 2、本發(fā)明將所述PseIF5A基因轉(zhuǎn)化煙草得到轉(zhuǎn)基因（pCAMBIA1300-PseIF5A) 煙草，對該轉(zhuǎn)基因（pCAMBIA1300-PseIF5A)煙草進行-10°C/3h冷脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因 煙草植株的形態(tài)未發(fā)生明顯變化，而野生型煙草出現(xiàn)嚴重萎蔫，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草 (pCAMBIA1300-PseIF5A)比野生型煙草具有更強的耐冷性，表明本發(fā)明的牡丹PseIF5A基 因在煙草中異源表達能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草對冷脅迫的抗性，可見該基因與植物的耐冷性 相關(guān)。
[0015] 3、將本發(fā)明的牡丹PseIF5A基因轉(zhuǎn)入不耐冷的牡丹品種或其它植物，可以提高轉(zhuǎn) 基因宿主對冷脅迫抗性，從而為獲得耐冷植物新品種或改良品質(zhì)提供有用基因。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明的牡丹PseIF5A基因在煙草中異源表達提高轉(zhuǎn)基因煙草的冷脅迫耐 性實驗結(jié)果，其中，CK為野生型煙草，pCAMBIA1300-PseIF5A為轉(zhuǎn)基因煙草。

【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克隆：實驗手冊（New York :Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所敘述的 條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0019] 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。
[0020] 實施例1牡丹PseIF5A基因的克隆
[0021] 根據(jù)葡萄eIF5A基因（登錄號：XM_002285469)與沙冬青eIF5A基因（登錄號： JN885967)的同源序列設(shè)計一對兼并引物：5'端兼并引物：5'-atgtcggaYgaRgaRcaYca_3'， 3'端兼并引物：5'-YtacttgggRccaatRtcctt_3'。將耐冷牡丹品種'鳳丹白'的盆栽苗（五年 嫁接苗）進行41：/311低溫脅迫處理，取其嫩葉提取1?隱（"？1 &拉1?隱〇1^"試劑盒，11&11〇2， 中國），逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄的試劑盒為PrimeScript? RT Reagent Kit(TaKaRa，中國大 連））。采用RT-PCR在鳳丹白中擴增出480bp條帶。小量膠回收法將PCR產(chǎn)物進行割膠回 收，連接到pGEM T-Vector上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM T-PseIF5A。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，測序， 將測序結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索。BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種 中相應(yīng)的eIF5A的序列高度保守。
[0022] 實施例2牡丹PseIF5A基因的序列信息與同源性分析
[0023] 對上述獲得的480bp條帶進行測定，其序列如SEQ ID NO. 1所示，即為本發(fā)明的牡 丹PseIF5A基因的核苷酸序列。該牡丹PseIF5A基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列由159個氨 基酸殘基組成，分子量17335. 92道爾頓，pi為6. 122,序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0024] 將上述牡丹PseIF5A基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列用BLAST 程序在 Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GeneBank CDS tra nslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與葡萄 eukaryotic translation initiation factor 5A_2_like (真核生物 翻譯起始因子基因2) (L0C100247352)存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與葡萄 eukaryotic translation initiation factor 5A_2_like基因的mRNA編石馬序列（GeneBank 八(^688丨〇1^〇.乂]\1_002285469.2)有80%的同源性（參看表1)，在氨基酸水平上，它與葡 萄 eukaryotic translation initiation factor 5A_2_like 蛋白質(zhì)的氨基酸殘基有 86%的相似性（參看表2)。因此，該牡丹PseIF5A基因與葡萄eukaryotic translation initiation factor 5A_2_like基因存在較高的同源性。
[0025] 表 1 為牡丹 PseIF5A 基因與葡萄 eukaryotic translation initiation factor 5A-2-like的核苷酸序列的同源性比較表
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種牡丹PseIF5A基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的牡丹PseIF5A基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的牡丹PseIF5A基因在提高轉(zhuǎn)基因煙草的冷脅迫抗性中的應(yīng) 用。
【文檔編號】C12N15/84GK104372012SQ201410620635
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】蔣昌華, 高燕, 葉康, 宋垚, 張亞利, 秦俊, 奉樹成 申請人:上海植物園