腈水合酶及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腈水合酶及其編碼基因和應用，該腈水合酶由α亞基和β亞基組成，所述α亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，β亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本發(fā)明從產(chǎn)酸克雷伯菌KCTC 1686中克隆到腈水合酶基因，該基因表達后成功獲得具有高表達量和高活性而且底物譜廣、具手性選擇性的腈水合酶。
【專利說明】腈水合酶及其編碼基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一種腈水合酶及其編碼基因和應用。

【背景技術】
[0002] 腈是一類重要的化合物，它的水解反應被廣泛應用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生 物的合成，在有機合成中占有及其重要的地位。腈水解的方法主要有化學水解法和生物轉 化法，與化學水解法相比生物轉化法具有條件溫和、環(huán)境污染小、并能實現(xiàn)化學、區(qū)域和對 映體選擇性等優(yōu)點。生物轉化法主要涉及腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中腈水合酶可 以催化腈水合生成酰胺，酰胺酶進一步將酰胺催化水解生成羧酸化合物，而腈水解酶可以 直接催化腈生成酰胺化合物。
[0003] 產(chǎn)腈水合酶微生物的分布是相當廣泛的，如紅球菌、假單胞菌、諾卡氏菌、假諾卡 氏菌、產(chǎn)堿桿菌、棒狀桿菌等。其中一些微生物已經(jīng)用于丙烯酰胺、煙酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)中， 如專利號為US007405064B2的專利公開了一種野生睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D ;專利號 ZL88106735的專利公開了一種野生玫瑰色紅球菌J-1 ;專利號為ZL86100062的專利公開了 一種紅球菌S-6、氧化節(jié)桿菌和黃色微桿菌；專利號為ZL99106291. 4的專利公開了一種野 生嗜熱假諾卡氏菌JCM3095 ;專利號為ZL03115536. 7的專利公開了一種野生丙酸棒桿菌。
[0004] 目前，利用微生物法生產(chǎn)丙烯酰胺、煙酰胺的方法主要從菌株的篩選和馴化以及 生產(chǎn)工藝的建立和改造等方面開展工作。但是，其中普遍存在野生菌種的酶活穩(wěn)定性差、對 底物和產(chǎn)物的耐受性不高、產(chǎn)品質量不夠穩(wěn)定等問題，同時在野生菌株中除腈水合酶外，還 存在酰胺酶和腈水解酶，其可以造成副產(chǎn)物煙酸和丙烯酸的生成，從而嚴重影響煙酰胺和 丙烯酰胺的產(chǎn)量和質量，同時增加分離純化的難度和生產(chǎn)成本。
[0005] 隨著生物技術的迅速發(fā)展，人們認識到用基因工程技術手段來構造具有腈水合酶 活性的基因工程菌株可以用來解決上述的難題。用基因工程菌來表達腈水合酶有許多野生 菌所不具有的優(yōu)點，如可以單獨克隆表達腈水合酶，阻斷催化反應過程中副反應的發(fā)生，不 會使酰胺在產(chǎn)生的同時又有部分被降解，從而提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質量；另外基因工程菌的 適應性強、發(fā)酵周期短，有利于實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)。當前，重組腈水合酶的研究 已經(jīng)引起人們廣泛的重視，經(jīng)過眾多科研工作者的多年努力也取得了相當多的成就，但是 還存在著諸多問題，如酶的表達水平低、熱穩(wěn)定性不高、對底物和產(chǎn)物的耐受性差，這嚴重 制約了腈水合酶的工業(yè)化應用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種高表達量、高活性且底物譜廣、具手性選擇性的腈水合酶。
[0007] 一種腈水合酶，由a亞基和0亞基組成，所述a亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，0亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。該腈水合酶的命名為NHaseK。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種編碼所述的腈水合酶的基因。
[0009] 優(yōu)選的，所述的基因包含喊基序列如SEQIDNO. 1所不的編碼a亞基的基因 和如SEQ ID N0.2所示的編碼0亞基的基因。該堿基序列來源于產(chǎn)酸克雷伯菌KCTC 1686 (Klebsiella oxytoca KCTC 1686)，由 1278 個堿基組成。自 5' 端第 1 位到 609 位堿 基編碼腈水合酶a亞基；自5'端第625位到1278位堿基編碼腈水合酶3亞基。進一步， 堿基序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0010] 所述的基因還包含編碼腈水合酶激活子的堿基序列。所述腈水合酶激活子的堿 基序列如SEQ ID N0. 3所示。為提高表達活性，所述基因經(jīng)過修飾后連接有激活子的基因 (SEQ ID N0. 3)。進一步地，堿基序列如SEQ ID N0. 8所示。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種腈水合酶激活子，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0012] 本發(fā)明還公開了一種任一所述基因的表達盒、重組載體和轉化子。
[0013] 本發(fā)明又公開了一種所述的腈水合酶在制備酰胺化合物中的應用。
[0014] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0. 4、SEQ ID N0. 5、SEQ ID N0. 6所 示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸 序列同源性在90%以上，且具有相同的酶活力，均可實現(xiàn)本發(fā)明目的，屬于本發(fā)明保護范圍 之列。
[0015] 由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 3所 示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均可實現(xiàn)本發(fā)明目的，屬于 本發(fā)明保護范圍之列。
[0016] 本發(fā)明提供了一種包含所述腈水合酶基因的重組載體和轉化子。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種所述重組載體和轉化子轉化得到的基因工程菌。
[0018] 本發(fā)明又提供了一種所述的腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的應用。
[0019] 所述的腈化合物為式（I)和（II)所示腈化合物生成對應酰胺中的應用：
[0020]

【權利要求】
1. 一種腈水合酶，由a亞基和0亞基組成，其特征在于，所述a亞基的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 4所示，0亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2. -種編碼權利要求1所述的腈水合酶的基因。
3. 如權利要求2所述的基因，其特征在于，包含堿基序列如SEQ ID NO. 1所示的編碼 a亞基的序列和如SEQ ID NO. 2所示的編碼0亞基的序列。
4. 如權利要求3所述的基因，其特征在于，堿基序列如SEQ ID NO. 7所示。
5. 如權利要求2所述的基因，其特征在于，還包含編碼腈水合酶激活子的序列。
6. 如權利要求5所述的基因，其特征在于，所述腈水合酶激活子的堿基序列如SEQ ID NO. 3所示。
7. 如權利要求6所述的基因，其特征在于，堿基序列如SEQ ID NO. 8所示。
8. -種腈水合酶激活子，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 一種包含權利要求2?7任一所述基因的表達盒、重組載體和轉化子。
10. 如權利要求1所述的腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的應用。
【文檔編號】C12N15/60GK104450657SQ201410621651
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權日:2014年11月6日
【發(fā)明者】楊立榮, 郭法謀, 王麗燕, 吳堅平, 徐剛 申請人:浙江大學