一種飼料用釀酒酵母菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種飼料用釀酒酵母的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用。培養(yǎng)基配方為：淀粉18-22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。其發(fā)酵工藝條件為溫度25℃、pH值6-6.5、通氣量1.2:1的初始條件下發(fā)酵20-24小時，在OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2-3小時開始以v/v計1:10進行補料。補料液的組成如下：淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。通過本發(fā)明的實施，釀酒酵母菌的發(fā)酵密度相對于YPED培養(yǎng)基活菌數(shù)增加7.3倍，菌體濃度達到了1.05×109cfu/ml，菌體干重達到112g/L。減少了蛋白胨和葡萄糖的用量，降低了生產(chǎn)成本，使之更加適合工業(yè)生產(chǎn)。CGMCC No943620140710
【專利說明】一種飼料用釀酒酵母菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種飼料用釀酒酵母菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，動物對蛋白質(zhì)的需求量越來越大，而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的總量是有一定限度的，生長必需的蛋白質(zhì)飼料需求量越來越大。而釀酒酵母菌體蛋白的營養(yǎng)價值很聞，酵母干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量可聞達50%,賴氣酸、精氣酸等含量較聞，接近動物蛋白，色氨酸含量比大豆高7倍以上，此外釀酒酵母菌中還含有豐富的核苷酸、B族維生素、礦物質(zhì)以及其它生理活性物質(zhì)，適合用于添加作為高蛋白活性酵母飼料。隨著微生物工程和發(fā)酵工程的發(fā)展，釀酒酵母越來越被廣泛用于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的生產(chǎn)。
[0003]同時隨著酵母菌在飼料中的廣泛應(yīng)用，在容積有限的發(fā)酵罐空間內(nèi)實現(xiàn)酵母菌的高密度發(fā)酵，是維持酵母制品生產(chǎn)規(guī)模和控制成本的關(guān)鍵，因此對酵母各方面的特征尤其是發(fā)酵特征的研究顯得十分必要。
[0004]普通的發(fā)酵方法通過優(yōu)化溶氧、pH值、溫度、培養(yǎng)基等實現(xiàn)釀酒酵母的高密度發(fā)酵，將眾多因素及其相互影響整合優(yōu)化形成一套完整的發(fā)酵工藝，這項工藝是一項程序復(fù)雜、綜合性高的工作。在基礎(chǔ)的研究工作和一些工業(yè)化生產(chǎn)中，釀酒酵母多采用酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Extract Peptone Dextrose, YEPD)培養(yǎng)基,其培養(yǎng)基成分未能針對特定的釀酒酵母菌株進行優(yōu)化。因此，有必要根據(jù)釀酒酵母的碳源利用的模式，采用原料來源廣泛，價格低廉的營養(yǎng)成分，開發(fā)適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)且能有效提高活菌數(shù)的培養(yǎng)基。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種飼料用釀酒酵母cerevisiae NDFJ12中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號=CGMCC N0.9436高密度發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成，以及提供該培養(yǎng)基在釀酒酵母高密度發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明能保證釀酒酵母的旺盛生長，又能降低發(fā)酵成本，解決目前酵母發(fā)酵菌體濃度不高的問題。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明用于高密度培養(yǎng)釀酒酵母的培養(yǎng)基組成為:按每升的配比，淀粉18-22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L，其余為水。本發(fā)明培養(yǎng)基配制方法如下:
按照培養(yǎng)基組成分別稱取各組分，使用蒸餾水溶解；將配置好的培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，121°C滅菌15分鐘；
為達到培養(yǎng)基的最佳效果，使用本培養(yǎng)基發(fā)酵釀酒酵母時，發(fā)酵過程如下:
1、菌種活化，將冷凍保存的釀酒酵母菌在YEH)瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于本培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計，將1%本酵母菌液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接于本培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基； 2、按照培養(yǎng)基配方配制釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基4500ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25°C ;以v/v計，按5%的接種量將得到的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中；
3、發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1。在此條件下發(fā)酵20-24小時，當pH降低時則自動加入堿性中和劑NaOH，泡沫過多時自動加入消泡劑吐溫80 ；
4、當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2_4小時開始補料500ml。補料液的組成如下:淀粉150g/L、蔗糖50g/L、牛肉膏100g/L、尿素100g/L、酵母提取物50g/L ；
5、繼續(xù)發(fā)酵48小時，收取菌體。
[0006]本發(fā)明所用的酵母提取物為市場購得。
[0007]本發(fā)明提供的用于釀酒酵母高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基，所用材料和工藝均以大規(guī)模產(chǎn)生酵母菌體為目的。采用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母，有利于釀酒酵母的快速生長，同時酵母中蛋白含量較高。本發(fā)明中培養(yǎng)基采用淀粉和蔗糖作為碳源，降低了發(fā)酵成本，另外補充的尿素可以有效地提升菌體中的蛋白含量。采用此技術(shù)發(fā)酵活菌數(shù)達到1.05X 19 cfu/ml，菌體干重達到112 g/L，這是目前技術(shù)較難達到的發(fā)酵標準，較普通的YEH)培養(yǎng)基活菌數(shù)提高7.3倍，實現(xiàn)了釀酒酵母的高密度發(fā)酵。
[0008]本發(fā)明的釀酒酵母cerevisiae NDFJ12,已于 2014 年 07 月 10日交由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏單位的地址位于北京中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.9436，釀酒酵母feccAaro耶cmcerevisiae NDFJ12 的分類命名為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae')。

【具體實施方式】
[0009]通過以下實施案例進一步對本發(fā)明進行描述:
實施例1發(fā)酵培養(yǎng)基的配置和發(fā)酵結(jié)果對比
釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組成:按每升的比例，淀粉20g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏1g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。
[0010]培養(yǎng)基配制方法如下:
按照培養(yǎng)基組成分別稱取各組分，使用蒸餾水溶解；
將配置好的培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，121°C滅菌15分鐘；
為達到培養(yǎng)基的最佳效果，使用本培養(yǎng)基發(fā)酵釀酒酵母時，發(fā)酵過程如下:
高密度發(fā)酵主要步驟如下:
O將冷凍保存的釀酒酵母菌(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏號=CGMCC N0.9436)在YETO瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于本培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計，按1%的比例，轉(zhuǎn)接于本培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基；
2)按照培養(yǎng)基配方，配制釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基4500ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25 °C ；
3)以v/v計，按5%的比例的接種量將得到的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中；
4)發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1。在此條件下發(fā)酵10-14小時，當pH降低時則自動加入堿性中和劑NaOH，pH值6-6.5，泡沫過多時加入5-8克消泡劑吐溫80 ；
5)當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2小時補料500ml。補料液的組成如下:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。
[0011 ] 將發(fā)酵完成后的菌體進行收集與干燥，所各為酵母蛋白。
[0012]本方法與現(xiàn)有技術(shù)的比較:對照試驗培養(yǎng)基和發(fā)酵過程
1)對照試驗采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastExtract Peptone Dextrose,YEF1D)培養(yǎng)基組成:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L ；
2)將冷凍保存的釀酒酵母菌在YEH)瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于YEH)培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計1%轉(zhuǎn)接于YEH)培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基；
3)配置YEro培養(yǎng)基4500ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25°C ；
4)以v/v計5%的接種量將得到的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中；
5)發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1。在此條件下發(fā)酵20-24小時，當pH降低時則自動加入堿性中和劑NaOH，泡沫過多時自動加入消泡劑吐溫80 ；
6)當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2小時補料500ml。補料液的組成如下:酵母膏50g/L,蛋白胨100g/L,葡萄糖100g/L。
[0013]7)繼續(xù)發(fā)酵48小時，收取菌體。
[0014]應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到釀酒酵母活菌數(shù)達1.05X 109 cfu/ml，菌體干重達到112 g/L。而對照組采用YEH)培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，得到的釀酒酵母活菌數(shù)僅為1.26X 18 cfu/mL.試驗證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的釀酒酵母活菌數(shù)比現(xiàn)有技術(shù)提高了約7.3倍，實現(xiàn)了釀酒酵母菌的高密度發(fā)酵。
[0015]實施例2發(fā)酵培養(yǎng)基的配置和發(fā)酵結(jié)果對比
釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組成:按每升的比例，淀粉22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏1g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。
[0016]培養(yǎng)基配制方法如下:
按照培養(yǎng)基組成分別稱取各組分，使用蒸餾水溶解；
將配置好的培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，121°C滅菌15分鐘；
為達到培養(yǎng)基的最佳效果，使用本培養(yǎng)基發(fā)酵釀酒酵母時，發(fā)酵過程如下:
高密度發(fā)酵主要步驟如下:
1)將冷凍保存的釀酒酵母菌在YEro瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于本培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計，1%轉(zhuǎn)接于本培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基；
2)按照培養(yǎng)基配方配制釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基4500ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25 °C ；
3)以v/v計，按5%的接種量將得到的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中；
4)發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1。在此條件下發(fā)酵10-14小時，當pH降低時則自動加入堿性中和劑NaOH，泡沫過多時自動加入消泡劑吐溫80 ；
5)當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2小時補料500ml。補料液的組成如下:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。
[0017]本方法與現(xiàn)有技術(shù)的比較:對照試驗培養(yǎng)基和發(fā)酵過程
1)對照試驗采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastExtract Peptone Dextrose,YEF1D)培養(yǎng)基組成:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L ；
2)將冷凍保存的釀酒酵母菌在YEH)瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于YEH)培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計1%轉(zhuǎn)接于YEH)培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基；
3)配置YEro培養(yǎng)基4500ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25°C ；
4)以v/v計5%的接種量將得到的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中；
5)發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1。在此條件下發(fā)酵20-24小時，當pH降低時則自動加入堿性中和劑NaOH，泡沫過多時自動加入消泡劑吐溫80 ；
6)當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2.5小時補料500ml。補料液的組成如下:酵母膏50g/L,蛋白胨100g/L,葡萄糖100g/L。
[0018]7)繼續(xù)發(fā)酵48小時，收取菌體。
[0019]應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到釀酒酵母活菌數(shù)達9.81 X 18 cfu/ml，菌體干重達到105 g/L。而對照組采用YEH)培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，得到的釀酒酵母活菌數(shù)僅為1.26X 18 cfu/mL.試驗證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的釀酒酵母活菌數(shù)比現(xiàn)有技術(shù)提高了約6.8倍，實現(xiàn)了釀酒酵母菌的高密度發(fā)酵。
[0020]實施例3 發(fā)酵培養(yǎng)基的配置和發(fā)酵結(jié)果對比
1.釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組成:按每升的比例，淀粉18g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L。
[0021]2.培養(yǎng)基配制方法如下:
O按照培養(yǎng)基組成分別稱取各組分，使用蒸餾水溶解；
2)將配置好的培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，121°C滅菌15分鐘；
為達到培養(yǎng)基的最佳效果，使用本培養(yǎng)基發(fā)酵釀酒酵母時，發(fā)酵過程如下:
1.高密度發(fā)酵主要步驟如下:
I)將冷凍保存的釀酒酵母菌在YEro瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于本培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計1%轉(zhuǎn)接于本培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基；
2 )按照培養(yǎng)基配方配制釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基4500 ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25 °C ；
3)以v/v計5%的接種量將得到的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中；
4)發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1。在此條件下發(fā)酵10-14小時，當pH降低時則自動加入堿性中和劑NaOH，泡沫過多時自動加入消泡劑吐溫80 ；
5)當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后4小時補料500ml。補料液的組成如下:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L。
[0022]1.對照試驗培養(yǎng)基和發(fā)酵過程
1)對照試驗采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastExtract Peptone Dextrose,YEF1D)培養(yǎng)基組成:酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L ；
2)將冷凍保存的釀酒酵母菌在YEH)瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于YEH)培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計1%轉(zhuǎn)接于YEH)培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基；
3)配置YEro培養(yǎng)基4500ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25°C ；
4)以v/v計5%的接種量將得到的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中；
5)發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1。在此條件下發(fā)酵20-24小時，當pH降低時則自動加入堿性中和劑NaOH，泡沫過多時自動加入消泡劑吐溫80 ；
6)當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2小時補料500ml。補料液的組成如下:酵母膏50g/L,蛋白胨100g/L,葡萄糖100g/L。
[0023]7)繼續(xù)發(fā)酵48小時，收取菌體。
[0024]應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到釀酒酵母活菌數(shù)達9.95X 18 cfu/ml，菌體干重達到106 g/L。而對照組采用YEH)培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，得到的釀酒酵母活菌數(shù)僅為1.26X 18 cfu/ml。試驗證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的釀酒酵母活菌數(shù)比現(xiàn)有技術(shù)提高了約6.9倍，實現(xiàn)了釀酒酵母菌的高密度發(fā)酵。
【權(quán)利要求】
1.一種飼料用釀酒酵母的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其特征在于:培養(yǎng)基的主要成分和含量為:按每升計，淀粉18-22g/L、蔗糖5g/L、牛肉膏10g/L、尿素10g/L、酵母提取物5g/L，其余為水；發(fā)酵過程中的補料液主要成分和含量為:淀粉100g/L、蔗糖25g/L、牛肉膏50g/L、尿素50g/L、酵母提取物25g/L，其余為水。
2.一種飼料用釀酒酵母的高密度發(fā)酵方法，其特征在于:高密度發(fā)酵過程如下: 1)菌種活化:將冷凍保存的釀酒酵母菌cerevisiaeNDFJl2保藏編號CGMCC N0.9436，在YETO瓊脂平板上活化，挑取單菌接種于如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基液體試管，25°C培養(yǎng)12小時后，以v/v計1%轉(zhuǎn)接于如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基液體試管，培養(yǎng)12小時后作為種子培養(yǎng)基； 2)菌種培養(yǎng):將活化的菌種接種于培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基配方配制釀酒酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基4500 ml裝入發(fā)酵罐中，滅菌后將溫度降至25°C ；以v/v計5%的接種量將種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵罐中； 3)發(fā)酵條件設(shè)定為:溫度25°C，轉(zhuǎn)速300rpm，pH值6-6.5，通氣量1.2:1，在此條件下發(fā)酵20-24小時，當pH降低時則加入堿性中和劑NaOH調(diào)節(jié)，泡沫過多時加入5_8克消泡劑吐溫80 ； 4)當發(fā)酵液OD值在600nm波長下吸收值達到1.4之后2_4小時補料500ml ； 5)繼續(xù)發(fā)酵48小時，收取菌體。
3.—種飼料用釀酒酵母菌種，其特征在于:該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC N0.9436。
【文檔編號】C12N1/16GK104403953SQ201410621690
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】方俊, 符晨星, 盧向陽 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學