一種大量樣本同時分型的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種大量樣本同時分型的方法，能夠通用于多種測序平臺的SNP篩查和分型。本發(fā)明選用II B型限制性內(nèi)切酶對提取的基因組DNA進(jìn)行酶切，并在酶切片段的兩端加上接頭，且其中一個接頭從5'至3'端包括有測序平臺的通用測序引物和用于連接的簡并序列；另一個接頭從5'至3'端包括有測序平臺的另一端通用測序引物、用于區(qū)分目標(biāo)樣本的Barcode序列和用于連接的簡并序列。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)一次建庫就能達(dá)到多種高通量測序平臺兼容的目的，同時利用雙Barcode序列的策略可以達(dá)到單測序泳道對多達(dá)576個樣本同時測序分型。
【專利說明】一種大量樣本同時分型的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA遺傳標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種大量樣本同時分型 的方法，能夠通用于多種測序平臺的SNP篩查和分型。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)是指存在于基因組特 定位置上的單個核苷酸的變異。作為第三代分子標(biāo)記，SNP具有數(shù)量大，分布廣及遺傳穩(wěn)定 性高的特點(diǎn)，是進(jìn)行生物進(jìn)化，群體遺傳學(xué)研究以及連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析最為理想的分子 標(biāo)記。隨著高通量測序技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，SNP標(biāo)記開發(fā)的通量和規(guī)模逐漸向高通量全基 因組的方向發(fā)展。針對模式生物，全基因組SNP標(biāo)記開發(fā)的策略主要是根據(jù)已知的基因組 信息，通過重測序的方法進(jìn)行序列比對篩查全基因組范圍內(nèi)的SNP標(biāo)記。
[0003] 隨著材料科學(xué)、計算機(jī)科學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，測序技術(shù)發(fā)生了革命性的進(jìn)步，以 Roche 454、Illumina Solexa和ABI SOLiD為代表的一批新技術(shù)興起，被稱為高通量測序 技術(shù)或新一代測序技術(shù)（Next generation sequencing, NGS)。隨著高通量測序技術(shù)的持 續(xù)發(fā)展和測序平臺的不斷升級，Illumina測序平臺以其多樣的測序讀長（單端36bp、單端 50bp、雙端lOObp、雙端150bp)、靈活的測序通量、較高的測序準(zhǔn)確性、低廉的測序成本等優(yōu) 勢，逐漸成為目前用于SNP分型的主流測序平臺之一。其中HiSeq2000測序平臺以高數(shù)據(jù) 產(chǎn)出、高測序準(zhǔn)確性為優(yōu)勢，HiSeq2500可實(shí)現(xiàn)較長的測序讀長（雙端150bp)和更快的測 序速度，MiSeq測序平臺可對文庫進(jìn)行快速檢測和少量數(shù)據(jù)獲得，研究者可根據(jù)不同研究目 的選擇不同測序平臺。
[0004] 近年來一系列基于高通量測序平臺的簡化基因組方法為非模式生物基因組范圍 SNP規(guī)模開發(fā)以及大樣本的群體遺傳學(xué)研究提供了有力的途徑。目前幾種主流的簡化基因 組測序技術(shù)都是基于酶切的原理將基因組DNA片段化，對獲得的代表性標(biāo)簽進(jìn)行高通量測 序，
[0005] 但目前的方法并不適用于基因組信息相對匱乏的非模式生物或是針對大量群體 樣本的SNP研究，因此，需要在不依賴所研究物種的基因組序列前提下進(jìn)行全基因組范圍 內(nèi)高密度SNP標(biāo)記的開發(fā)和分型的方法，從而能夠兼容多元化的高通量測序平臺、并且可 以實(shí)現(xiàn)大量樣本平行測序分型。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種大量樣本同時分型的方法，能夠通用于多種測序平臺的 SNP篩查和分型。本發(fā)明構(gòu)建所得文庫具備在Illumina HiSeq2000, HiSeq2500和MiSeq等 多種測序平臺的兼容性，并可在一個測序泳道內(nèi)同時對多達(dá)576個樣本測序分型。
[0007] 本發(fā)明的方法，包括有如下的步驟：
[0008] 1)首先提取要進(jìn)行分析的不同目標(biāo)樣本的基因組DNA，
[0009] 2)選用II B型限制性內(nèi)切酶對提取的基因組DNA進(jìn)行酶切，并在酶切片段的兩端 加上接頭，且其中一個接頭從5'至3'端包括有測序平臺的通用測序引物和用于連接的簡 并序列；另一個接頭從5'至3'端包括有測序平臺的另一端通用測序引物、用于區(qū)分目標(biāo)樣 本的Barcode序列和用于連接的簡并序列。
[0010] 優(yōu)選的接頭為Slx-MpAdl和Slx-MpAd2,其中Slx-MpAdl含有樣本區(qū)分所需 Barcode序列；所述酶切片段為BsaXI酶的酶切片段。
[0011] 接頭Slx-MpAdl和Slx_MpAd2的一種具體序列如下：
[0012] Slx-MpAdl ：
[0013] 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXXX(Nx)-3' ；
[0014] 5,-XXXXXXAGATCGGAAGAGC-3，；
[0015] Slx_MpAd2 :
[0016] 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(Nx) -3' ；
[0017] 5, -AGATCGGAAGAGC-3，；
[0018] 其中所述XXXXXX為Barcode序列，Nx中N為兼并堿基，X為簡并堿基的數(shù)目，其與 酶切產(chǎn)生的突出堿基的數(shù)目保持一致。5端的序列為測序平臺的通用測序引物序列。
[0019] 3)PCR擴(kuò)增及目的片段的回收：將步驟2)連接好接頭的酶切片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 所用的引物與接頭的5'的序列結(jié)合；
[0020] 4)以步驟3)擴(kuò)增的目的片段作為底物進(jìn)行再次擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的正向引物為與測 序平臺的正向測序引物序列相匹配的引物，反向引物為含有樣本區(qū)分所需Bar C〇de2序列 的測序平臺的反向向測序引物序列相匹配的引物；
[0021] 5)將步驟4)的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Illumina HiSeq2000進(jìn)行高通量測序。
[0022] 所述步驟3)中，實(shí)施例優(yōu)選所使用的具體引物如下：
[0023] Slx-IST-MpPrimer-I:
[0024] 5' -ACACTCTTTCCCTACACGACGCT-3' ；
[0025] SIx-IST-MpPrimer-2:
[0026] 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3' ；
[0027] 步驟4)中實(shí)施例所使用的具體引物如下：
[0028] Slx-2ND-MpPrimer:
[0029] 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCT-3' ；
[0030] Slx-index-Barcode:
[0031] 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3' 。
[0032] 作為對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟（2)中取目標(biāo)基因組DNA lOOng，按照 15μ 1體系進(jìn)行酶切反應(yīng)：100ng DNA，1.5y I 10XNEBuffer4,2y 1限制性內(nèi)切酶，用CldH2O 補(bǔ)足至15μ 1 ;
[0033] 連接反應(yīng)體系為：體積為22μ 1，10μ 1酶切產(chǎn)物，2μ I IOmM ΑΤΡ，4μ 1 ΙμΜ slx_adl，4yl ΙμΜ slx_ad2,2yl T4DNA ligase。4。。連接 16h。
[0034] 對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（3)中PCR反應(yīng)體系為：7 μ I連接產(chǎn)物，4 μ I 5 X HF Buffer,0.6 μ I IOmM dNTP，0·2 μ I 10 μ M slx-PCRl，0· 2 μ I 10 μ M slx-PCR2, 0·2μ1 DNA聚合酶，7·8μ1 ddH20。
[0035] 對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟⑶中PCR反應(yīng)條件為：98°C 5s，60°C 20s， 72°〇1〇8,22個循環(huán)；721：延伸1〇11^11。
[0036] 對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（4)中反應(yīng)體系為：體積為20μ 1，5μ 1回 收產(chǎn)物，4μ1 5XHF Buffer，0.6yl IOmM (1ΝΤΡ，0·2μ1 ΙΟμΜ slx-PCRl，0.2yl ΙΟμΜ slx-PCR3,0.2yl DNA聚合酶，9·8μ1 ddH20。
[0037] 對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟⑷中PCR反應(yīng)條件為：98°C 5s，60°C 20s， 72°〇1〇8,5-7個循環(huán)；721：延伸1〇11^11。
[0038] 本發(fā)明利用獨(dú)特的接頭和引物，能夠?qū)崿F(xiàn)一次建庫就能達(dá)到多種高通量測序平臺 兼容的目的，同時利用雙Barcode序列的策略可以達(dá)到單測序泳道對多達(dá)576個樣本同時 測序分型。構(gòu)建所得測序文庫不僅可直接在MiSeq平臺上進(jìn)行文庫測試或少量數(shù)據(jù)獲得， 而且可以在HiSeq2000和HiSeq2500平臺上進(jìn)行較大數(shù)據(jù)量的測序。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 對于本發(fā)明中所涉及的名詞定義如下：
[0040] 1、內(nèi)切酶，又稱為核酸內(nèi)切酶（endonuclease)在核酸水解酶中，為可水解分子鏈 內(nèi)部磷酸二酯鍵生成寡核苷酸的酶；本發(fā)明所用到的II B型限制性內(nèi)切酶為BsaXI酶，但 還可選用其它的II B型限制性內(nèi)切酶。
[0041] 2、接頭：（adaptor DNA)，是一段短的含酶切位點(diǎn)并能與鈍性末端或粘性末端匹配 的人工合成DNA片段，接頭DNA常用于一鈍性末端DNA與一粘性末端DNA的連接。有時連 接到粘性末端的接頭DNA是為了給未知DNA片段提供一段已知的序列，根據(jù)其設(shè)計引物，擴(kuò) 增未知的DNA片段。
[0042] 3、其中N(兼并堿基）為堿基A、T、G、C中的任一個；其中A、T、G、C代表組成DNA 分子的四種脫氧核苷。
[0043] 4、Barcode即一段短的特征序列，對多個樣本同時進(jìn)行高通量測序時，對每條 reads上帶有的一段特定短序列（即barcode)測序能夠準(zhǔn)確識別樣本來源。
[0044] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 下面以120個扇貝個體為例通過實(shí)驗(yàn)的實(shí)施詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0047] 1、扇貝基因組DNA的提取
[0048] 利用酚-氯仿抽提法提取扇貝高純度基因組DNA，具體步驟如下：
[0049] 取扇貝閉殼肌約0· lg，加入500 μ I STE裂解緩沖液（NaCl : IOOmM ;EDTA : ImM，PH =8.0;1^8-(：1，101111，？!1 = 8.0)，剪碎，再加入5(^110%的505(10%)，以及5 4 12011^/ ml的蛋白酶K，56°C處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚（250μ1)、氯仿/異戊醇 (24:1) (250 μ 1)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇（500 μ 1)抽提1次。取 上清液，加入50 μ I NaAc (3M，pH5. 2)，Iml冰無水乙醇，緩慢搖勻，12, OOOrpm離心IOmin,將 核酸沉淀于管底。70%乙醇（Iml)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100 μ I ddH20 和少量RNase A，37°C消化30min，紫外分光光度計定量到lOOng/μ 1備用。
[0050] 2、II B型限制性內(nèi)切酶酶切及接頭的連接
[0051] 取每個樣本的DNA lOOng，按照以下體系（15μ1)進(jìn)行酶切反應(yīng)：100ng DNA， 1·5μ1 10XNEBuffer4,2yl BsaXI，用 CldH2O 補(bǔ)足至 15μ1。37? 酶切 3 小時。取 5μ1 酶 切產(chǎn)物，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全。
[0052] 將設(shè)計的特異性接頭（Slx-MpAdl和Slx_MpAd2)連于上述酶切產(chǎn)物，其中 Slx-MpAdl含有Barcodel序列（表1)，用于區(qū)分每個樣本；本實(shí)施例中，兩個接頭3'端的 兼并堿基為3個隨機(jī)堿基，與BsaXI酶切產(chǎn)生的酶切標(biāo)簽粘性末端互補(bǔ)。
[0053] 反應(yīng)體系（22μ 1)為：10μ 1 酶切產(chǎn)物，2μ I IOmM ΑΤΡ，4μ 1 ΙμΜ Slx-MpAdl， 4μ1 ΙμΜ Slx-MpAd2,2yl T4DNA 連接酶。4°C 連接 16h。
[0054] 接頭：
[0055] Slx-MpAdl ：
[0056] 5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXXXNNN 3'
[0057] 5,XXXXXXAGATCGGAAGAGC 3，
[0058] Slx-MpAd2 ：
[0059] 5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNN 3'
[0060] 5, AGATCGGAAGAGC 3,。
[0061] 3、PCR擴(kuò)增及目的片段的回收
[0062] PCR 擴(kuò)增使用高保真 DNA 聚合酶（Phusion DNA polymerase, NEB)和 Solexa 特異性引物（slx-PCRl和slx-PCR2)，反應(yīng)體系（20 μ 1)為：7 μ 1連接產(chǎn)物，4 μ 1 5X HF Buffer,0. 6 μ I IOmM dNTP，0· 2 μ I 10 μ M Slx-lST-MpPrimer-1,0. 2 μ I 10 μ M Slx-lST-MpPrimer-2,0.2yl Phusion DNA 聚合酶，7·8μ1 ddH20。
[0063] 引物：
[0064] Six-1ST-MpPrimer-1:
[0065] 5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 3' ；
[0066] Slx-lST-MpPrimer-2:
[0067] 5'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT 3'；
[0068] ?0?反應(yīng)條件為：981：58,6〇1：2〇8,721：1〇8,22個循環(huán)；721：延伸1〇1^11。對每個 樣本平行進(jìn)行3個擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物合成I管用于目的片段的回收。
[0069] 將60 μ I PCR產(chǎn)物上于8%聚丙烯酰胺凝膠，300V電泳40min。將目的片段（96bp) 從膠上切下，置于I. 5ml離心管中搗碎，加入50 μ I ddH20,4°C放置12h，離心后上清液的濃 度大約在5-10ng/y 1。
[0070] 4、接頭延伸
[0071] 對上述回收產(chǎn)物，用另一對引物Slx-2ND_MpPrimer和Slx-index-Barcode進(jìn) 行再次擴(kuò)增，其中Slx-index-Barcode含有Barcode2序列（表2)反應(yīng)體系（20 μ 1) 為：5μ1 回收產(chǎn)物（5ng/yl)，4yl 5XHFBuffer，0.6yl 10mMdNTP，0.2yl ΙΟμΜ Slx_2ND-MpPrimer,0· 2 μ I 10 μ M Slx-index-Barcode,0. 2 μ I Phusion DNA polymerase, 9· 8 μ I ddH20。
[0072] 引物：
[0073] Slx-2ND-MpPrimer:
[0074] 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCT 3' ；
[0075] Slx-index-Barcode:
[0076] 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT 3'
[0077] PCR 反應(yīng)條件為：98°C 5s，60°C 20s，72°C 10s，5-7 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。對每 個樣本平行進(jìn)行3個擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物合成I管用于用于純化。
[0078] PCR產(chǎn)物的純化使用 Qiagen's QIAquick PCR purification kit,純化步驟按照說 明書進(jìn)行，最后改用35 μ I CldH2O洗脫。
[0079] 5、高通量測序
[0080] 將每120個樣本的純化產(chǎn)物等量混合成1個待測樣品（IOOng)，占用一個lane，進(jìn) 行 HiSeq2000 測序。
[0081] 表 1 :含有 Barcodel 的 Slx-MpAdl 序列
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一種大量樣本同時分型的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步驟： 1) 首先提取要進(jìn)行分析的不同目標(biāo)樣本的基因組DNA ; 2) 選用II B型限制性內(nèi)切酶對提取的基因組DNA進(jìn)行酶切，并在酶切片段的兩端加上 接頭，其中一個接頭從5'至3'端依次包括有測序平臺的通用測序引物和用于連接的簡并 序列；另一個接頭從5'至3'端依次包括有測序平臺的另一端通用測序引物、用于區(qū)分目標(biāo) 樣本的Barcode序列和用于連接的簡并序列； 3. PCR擴(kuò)增及目的片段的回收：將步驟2)連接好接頭的酶切片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用 的引物與接頭的5'的序列結(jié)合； 4) 以步驟3)擴(kuò)增的目的片段作為底物進(jìn)行再次擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的正向引物為與測序平 臺的正向測序引物序列相匹配的引物，反向引物為含有樣本區(qū)分所需Bar C〇de2序列的測 序平臺的反向向測序引物序列相匹配的引物； 5) 將步驟4)的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Illumina HiSeq2000進(jìn)行高通量測序。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的II B型限制性內(nèi)切酶為BsaXI酶。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中的接頭為Slx-MpAdl和 Slx_MpAd2,其中Slx-MpAdl含有樣本區(qū)分所需Barcode序列；每個接頭的序列分別如下： Slx-MpAdl ： 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXXX(Nx) -3' ； 5,-XXXXXXAGATCGGAAGAGC-3，； Slx-MpAd2 ： 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(Nx) -3' ； 5, -AGATCGGAAGAGC-3，； 其中所述XXXXXX為Barcode序列，Nx中N為兼并堿基，x為簡并堿基的數(shù)目，其與酶切 產(chǎn)生的突出堿基的數(shù)目保持一致；5端的序列為測序平臺的通用測序引物序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中所使用的引物的序列信息 如下： Slx-IST-MpPrimer-I:
5. -ACACTCTTTCCCTACACGACGCT-3，； Slx-lST-MpPrimer-2: 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3' 。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中所使用的引物的序列信息 如下： Slx-2ND-MpPrimer: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCT-3' ； Slx-index-Barcode: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3' 。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中酶切的一種具體操 作如下：取目標(biāo)基因組DNA lOOng，按照15iil體系進(jìn)行酶切反應(yīng)：100ng DNA，1.5iil 10XNEBuffer4,2iil限制性內(nèi)切酶，用ddH20補(bǔ)足至15iU ; 所述的在酶切片段的兩端加上接頭，一種具體的連接反應(yīng)體系為：體積為22 yl， 1〇111酶切產(chǎn)物，21111〇1111六??？，4111111]\181叉-&(11，4111111]\181叉-&(12,2111丁40嫩 ligase，4°C 連接 16h。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（3)中PCR反應(yīng)體系一種具體 組成為：7111連接產(chǎn)物，41115\冊811打61'，0.6111101111(1階1 3,0.21111011]\181叉-?〇?1， 0.2 ill IOiiM slx-PCR2,0.2 ii I DNA 聚合酶，7.8 ii I CldH2O ;PCR 反應(yīng)條件為：98°C 5s， 60°〇2〇8,721：1〇8,22個循環(huán)；721：延伸1〇111111。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中反應(yīng)體系為：體積為 20iil，5iil 回收產(chǎn)物，4iil 5XHF Buffer，0.6iil IOmM dNTP，0.2iil IOiiM slx-PCRl， 0. 2u I IOiiM slx-PCR3,0. 2ii I DNA 聚合酶，9. 8ii I ddH20 ;PCR 反應(yīng)條件為：98°C 5s， 60°〇2〇8,721：1〇8,5-7個循環(huán)；721：延伸1〇111111。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313172SQ201410624588
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】王師, 焦文倩, 包振民, 呂佳, 付曉騰, 張玲玲, 胡曉麗 申請人:中國海洋大學(xué)