一種牙鲆精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因過程中保持精子活力的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種牙鲆精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因過程中保持精子活力的方法，是利用脂質(zhì)體將外源DNA包裹起來形成兩者的復(fù)合物，然后將精子12000rpm高速離心15min，去除精清，再將復(fù)合物與精子共同孵育，從而用于精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和生產(chǎn)中。脂質(zhì)體與外源質(zhì)粒形成復(fù)合物的N/P參數(shù)為5，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的時(shí)間為15min，外源質(zhì)粒的濃度為100ng/μl，每10μl精子與10μg外源質(zhì)?；旌希旌系臅r(shí)間在10min至50min。通過與質(zhì)粒直接與精子混合作為比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為，利用脂質(zhì)體將外源質(zhì)粒包裹起來，有效避免外源質(zhì)粒對(duì)精子的損傷，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原理，即脂質(zhì)體和精子質(zhì)膜間的靜電作用，提高外源基因的導(dǎo)入率，操作簡(jiǎn)便，處理時(shí)間的跨度廣，便于實(shí)際操作。
【專利說明】一種牙鲆精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因過程中保持精子活力的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋經(jīng)濟(jì)魚類遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種牙鲆精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因 過程中保持精子活力的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)（sperm mediated gene transfer, SMGT)是近幾十年來應(yīng) 用越來越多的一種轉(zhuǎn)基因的新技術(shù)。它利用精子將外源基因攜帶進(jìn)入動(dòng)物的胚胎中。該操 作過程簡(jiǎn)便，對(duì)胚胎的機(jī)械損傷，化學(xué)損傷等危害程度低，而且動(dòng)物受精是一個(gè)生理過程， 應(yīng)用的范圍廣，克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的局限性。通過少量精子就可以獲得大量后代，轉(zhuǎn)基 因后代的數(shù)量也隨之增加。這些都使得SMGT能夠有效地用于實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中。早在1971年 起，就有利用SMGT方法進(jìn)行的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，如小鼠、豬等。
[0003] SMGT方法最初是利用質(zhì)粒和精子直接共同孵育一段時(shí)間，這樣做雖然簡(jiǎn)便，但是 轉(zhuǎn)基因的效率并不穩(wěn)定。首先精液中的非細(xì)胞成分中有抑制DNA與精子特定部位結(jié)合的因 子，Lanes等證明巴西牙鲆精液中的精清成分，具有DnaseI活性，能夠降解外源DNA，降低了 外源DNA進(jìn)入精子的可能性。而且外源DNA分子結(jié)合到精子的質(zhì)膜上會(huì)發(fā)生一系列的級(jí)聯(lián) 反應(yīng)，引起精子的凋亡。因此，提高外源DNA進(jìn)入精子的可能性，并避免外源質(zhì)粒對(duì)精子造 成損傷，是利用精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵步驟之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種牙鲆精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因過程中保持精子活力的方法，即 利用脂質(zhì)體和外源DNA形成復(fù)合物，可以避免外源DNA分子與精子的直接接觸，避免精子的 凋亡。
[0005] 本發(fā)明的方法，包括如下的步驟：
[0006] 1)外源質(zhì)粒的構(gòu)建
[0007] 利用限制性內(nèi)切酶XhoI和AccI分別切開帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有mCherry紅 色熒光的質(zhì)粒，并回收切開的質(zhì)粒片段；再使用T4連接酶將目的基因片段和帶有mCherry 紅色熒光的質(zhì)粒相連接起來，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因的外源DNA質(zhì)粒；
[0008] 2)高速離心除去精液中的非細(xì)胞成分
[0009] 取新鮮牙鲆精子，離心后棄透明上清，得到去除非細(xì)胞成分的精子；
[0010] 3)制備脂質(zhì)體和外源DNA質(zhì)粒復(fù)合物
[0011] 每1 μ g外源DNA質(zhì)粒溶于150mM Nacl buffer中稀釋至50 μ 1，震蕩并混勻制成 外源DNA質(zhì)粒復(fù)合物；
[0012] 每2 μ 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑溶于150mM Nacl buffer稀釋至50 μ 1，輕輕震蕩并混勻；
[0013] 將稀釋完畢的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋完畢的外源DNA質(zhì)粒復(fù)合物中，然后迅 速顛倒混勻，在室溫下放置15至30min形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物；
[0014] 4)將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物與去除非細(xì)胞成分的精子共同孵育；然后進(jìn)行人工受精。
[0015] 其中步驟1)中的目的基因?yàn)閒ollistatin基因，其質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：
[0016] 在牙鲆follistatin基因設(shè)計(jì)一對(duì)兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的PCR引物，其5'和 3'引物上加入了一個(gè)XhoI和AccI的酶切位點(diǎn)，其引物如下：
[0017] 5' -primer :5' -GAGAGAGACTCGAGGAATGTTTAGATGCTGAAACAC-3，，
[0018] 3， -primer -GAGAGAGAGTCTACTTACTTACAGTTGCAAGATCC-3 ;；
[0019] PCR反應(yīng)程序如下：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 90sec，循環(huán) 30 次，72°C延伸 IOmin ;
[0020] 回收擴(kuò)增的目的基因片段，連接在PMD18 - T載體上，利用氨芐抗性篩選帶有目的 片段的陽(yáng)性菌。
[0021] 步驟2)中的離心條件在12000rpm下離心15min。
[0022] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下：1、方法轉(zhuǎn)基因效率高；2、脂質(zhì)體的化學(xué)性質(zhì)可以有效的保護(hù)攜 帶有目的基因的質(zhì)粒，防止被降解，并且脂質(zhì)體的帶電性可以促進(jìn)其與精子表面結(jié)合；3、月旨 質(zhì)體對(duì)精子的破壞作用小，大部分精子仍然保持較高的活力

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 1.外源質(zhì)粒的構(gòu)建
[0026] 1)根據(jù)NCBI中，牙鲆follistatin基因設(shè)計(jì)一對(duì)兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的PCR 引物，其5'和3'引物上加入了一個(gè)XhoI和AccI的酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR。其引物如下：
[0027] 5' -primer :5' -GAGAGAGACTCGAGGAATGTTTAGATGCTGAAACAC-3'，
[0028] 3' -primer :5' -GAGAGAGAGTCTACTTACTTACAGTTGCAAGATCC-3'
[0029] PCR反應(yīng)程序如下：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 90sec，循環(huán) 30 次，72°C延伸 lOmin。
[0030] 2)利用膠回收試劑盒（TM16090646)回收擴(kuò)增的follistatin目的片段，連接在 PMD18 - T載體上，利用氨芐抗性篩選帶有目的片段的陽(yáng)性菌
[0031] 3)利用限制性內(nèi)切酶XhoI和AccI分別切開帶有follistatin的質(zhì)粒和帶有 mCherry紅色突光的質(zhì)粒，并使用質(zhì)粒回收試劑盒（TM16090646)將切開的質(zhì)粒分別回收
[0032] 4)使用T4連接酶將follistatin片段和帶有mCherry紅色突光的質(zhì)粒相連接起 來，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因的外源DNA質(zhì)粒
[0033] 2.高速離心除去精液中的非細(xì)胞成分
[0034] 取IOOul擠出的新鮮牙鲆精子,放在I. 5mlEP管中，12000rpm高速離心15min，小 心地丟棄透明上清
[0035] 3.制備脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物
[0036] 1)每 IugDNA 溶于 150mM Nacl buffer ( FuGENE? 6Transfection Reagent 試劑 盒，Promega(北京）生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：E2693)稀釋至50ul，輕輕震蕩并混勻
[0037] 2)每2ul轉(zhuǎn)染試劑溶于150mM Nacl buffer稀釋至50ul，輕輕震蕩并混勻
[0038] 3)將稀釋完畢的轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋完畢的DNA中，然后迅速顛倒混勻，此步中 一定是轉(zhuǎn)染試劑加入到DNA中，切記順序不可以顛倒
[0039] 4)將4)中的混合物在室溫下放置15至30min即可形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。從 此時(shí)開始計(jì)算，復(fù)合物在室溫下可以穩(wěn)定存在2小時(shí)，在4°C條件下可以穩(wěn)定存在24小時(shí)
[0040] 4.將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物與去除精清的精子共同孵育一段時(shí)間
[0041] 5.將處理后的精子分成兩部分，一部分利用2. 5%的戊二醛固定，利用掃描電鏡 進(jìn)行觀察；另一部分進(jìn)行人工受精
[0042] N/P系數(shù)和脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物與精子共同孵育的時(shí)間，與脂質(zhì)體對(duì)精子的保護(hù)能 力，對(duì)精子功能的影響以及外源目的基因?qū)刖觾?nèi)效率等有關(guān)。因此采用單因子變量法， 獲得最優(yōu)的N/P系數(shù)和孵育時(shí)間。
[0043] 1)N/P參數(shù)的獲得
[0044] N/P系數(shù)的計(jì)算，根據(jù)脂質(zhì)體試劑盒
[0045] FuGENE? 6Transfection Reagent ( FuGENE? 6 轉(zhuǎn)染試齊[J )提供的計(jì)算公式
[0046] 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原理，脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物要帶有正電荷，才能與精 子質(zhì)膜表面的負(fù)電荷相互吸附，因此N/P系數(shù)應(yīng)大于3。在精子與復(fù)合物共同孵育的時(shí)間相 同的情況下，分別設(shè)計(jì)了以下N/P系數(shù)，然后統(tǒng)計(jì)其受精率。結(jié)果如下表1 :
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種牙鲆精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因過程中保持精子活力的方法，其特征在于，所述的方法包 括有如下的步驟： 1) 外源質(zhì)粒的構(gòu)建： 利用限制性內(nèi)切酶Xhol和AccI分別切開帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有mCherry紅色熒 光的質(zhì)粒，并回收切開的質(zhì)粒片段；再使用T4連接酶將目的基因片段和帶有mCherry紅色 熒光的質(zhì)粒相連接起來，構(gòu)成轉(zhuǎn)基因的外源DNA質(zhì)粒； 2) 高速離心除去精液中的非細(xì)胞成分 取新鮮牙鲆精子，離心后棄透明上清，得到去除非細(xì)胞成分的精子； 3) 制備脂質(zhì)體和外源DNA質(zhì)粒復(fù)合物 每lug外源DNA質(zhì)粒溶于150mM Nacl buffer中稀釋至50iil，震蕩并混勻制成外源 DNA質(zhì)粒復(fù)合物； 每1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑溶于150mM Nacl buffer稀釋至50ii 1，輕輕震蕩并混勻； 將稀釋完畢的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋完畢的外源DNA質(zhì)粒復(fù)合物中，然后迅速顛 倒混勻，在室溫下放置15至30min形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物； 4) 將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物與去除非細(xì)胞成分的精子共同孵育；然后進(jìn)行人工受精。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中的目的基因?yàn)?follistatin 基因。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中轉(zhuǎn)基因的外源DNA質(zhì)粒的 構(gòu)建方法如下： 在牙鲆follistatin基因設(shè)計(jì)一對(duì)兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的PCR引物，其5'和3' 引物上加入了一個(gè)Xhol和AccI的酶切位點(diǎn)，其引物如下： 5' -primer^' -GAGAGAGACTCGAGGAATGTTTAGATGCTGAAACAC-3', 3' -primer^' -GAGAGAGAGTCTACTTACTT ACAGTTGCA AGATCC-3/ ； PCR反應(yīng)程序如下：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 90sec，循環(huán) 30 次，72°C延伸 lOmin ; 回收擴(kuò)增的目的基因片段，連接在PMD18 - T載體上，利用氨芐抗性篩選帶有目的片段 的陽(yáng)性菌。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中的離心條件是在12000rpm 下離心15min。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104372022SQ201410624598
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】齊潔, 王振偉, 辛念, 張全啟, 王志剛, 王旭波, 于海洋, 賀艷 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)