一種雜交瘤細胞及其分泌的單克隆抗體與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學生物工程【技術領域】，具體涉及一種編號為CCTCCNO:C2014167的雜交瘤細胞及其分泌的抗前列腺小體蛋白的單克隆抗體LCZ4H3與應用。本發(fā)明以從慢性前列腺炎和前列腺癌患者體內(nèi)分離的前列腺小體外泄蛋白為抗原，制備了單克隆抗體雜交瘤細胞及其分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。該雜交瘤細胞能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗前列腺小體蛋白單克隆抗體，且細胞染色體穩(wěn)定、抗體效價高，完全能夠應用于前列腺小體蛋白的應用的研究中。該抗前列腺小體蛋白的單克隆抗體可應用于檢測前列腺小體蛋白試劑的制備中。CCTCC NO：C20141672014.09.11
【專利說明】-種雜交瘤細胞及其分泌的單克隆抗體與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學生物工程【技術領域】，具體涉及一種抗前列腺小體外泄蛋白單克隆 抗體的雜交瘤細胞，并且由該雜交瘤細胞分泌的抗前列腺小體蛋白的單克隆抗體及其應 用。

【背景技術】
[0002] 慢性前列腺炎（C虹onic prostatitis, CP)因缺乏客觀準確的診斷手段，臨床的 診療效果一直不理想。實驗室檢查在慢性前列腺炎診斷中具有重要作用，目前主要包括尿 常規(guī)、前列腺按摩液（expressed prostatic secretion,EPS)常規(guī)檢查、細菌學培養(yǎng)等。該 些檢查取材需要通過經(jīng)化口前列腺按摩取得前列腺液，再進行病原學培養(yǎng)。其特點為：① 有一定的痛苦；②對人體有侵襲性；③耗時較長；④費用較高。因此，亟需一種無創(chuàng)穩(wěn)定、簡 便快捷，同時又準確可靠的生物標記物和診斷手段，作為慢性前列腺炎檢測方法，為CP的 篩選和診斷提供有效的工具，避免患者的侵入檢查痛苦，提高患者的生活質量。
[0003] 慢性前列腺炎中組織受到炎性細胞的浸潤，從而釋放出各種活性物質和趨化因 子，一種稱為前列腺小體的外泌蛋白通過解剖通道分泌進入男性生殖道。研究提示，前列腺 疾病中可能存在表達前列腺小體蛋白質組的獨特表型，已知的分子功能是多種多樣的，包 括結構膜蛋白、酶、監(jiān)管蛋白和信號轉導分子，如尤013、〔026、〔059、壁(：抑制劑、〔046^及 高濃度的Zn"、Ca"和Mg"等。慢性前列腺炎病程中，多種致病因子啟動Wnt途徑，Wnt信 號通路異常表達，相應下游活性物質增加，與前列腺小體的釋放和表型的變化均有密切的 關系。高濃度的前列腺小體可W在精液、前列腺液中發(fā)現(xiàn)，電鏡下有兩種形態(tài)：小、黑色的， 外面緊包電子致密物；大的，淺色的，不致密的結構，直徑40-500nm。有脂質雙層膜，多層融 合排列，富含膽固醇。相似的結構也可W在前列腺細胞系的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)。前列腺小體的 主要成分是銷磯脂，含有磯酸膽堿和神經(jīng)醜胺。膽固醇和磯脂的比例是二比一，而典型的 哺乳動物細胞膜上的此種比例是一比一。前列腺小體蛋白有多重生理功能，在CD59XD52、 CD55的參與下，通過一系列生化反應，可W保護酸性環(huán)境中的精子，延遲頂體反應，增強精 子的活力。前列腺小體CD42、TF可抑制PMN細胞的NADPH酶的活性使反應性氧核素（ROS) 減少并具有抑制病毒活性及抗菌的作用。佛波醇醋（PM)化學誘導膚-MLP能刺激PMN產(chǎn) 生R0S，前列腺小體能抑制PMA和MLP的作用，抑制NADPH氧化酶的活性。由于前列腺小體 膽固醇/磯脂比例高，銷磯脂含量高，導致脂質成分從前列腺小體向P^1N轉移，使血漿中PMN 細胞膜硬化，抑制P麗中NADPH氧化酶的活性，從而起到抗菌抗氧化作用。有證據(jù)表明，在 精液中存在血液凝固成分和纖維蛋白溶解系統(tǒng)成分。正因為前列腺小體的TF成分，精液的 血液凝固活性可W阻止感染因素，包括HIV。在培養(yǎng)皿實驗條件下，小劑量的前列腺小體呈 現(xiàn)出對肺炎球菌、地衣形桿菌、側抱桿菌、Me gat en i um桿菌的強烈抑制作用，該種抗菌活性 與細胞膜的變性密切相關。在掃描電鏡下，可直接觀察到前列腺小體粘附到光滑的細菌包 膜表面，是其外觀逐漸變粗破裂，引起細菌死亡。
[0004] 前列腺小體（prostasomes)是存在于前列腺液中的直徑約3(T150納米的超微結 構，由前列腺上皮或間質細胞等外吐（exocytosis)或外泄（excretion)形成，與其他組織 中的外吐小體（exosome)結構、大小、成分相似但不相同。雖然目前外吐途徑、信號傳導機 制了解甚少，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，前列腺小體中存在核酸、蛋白、糖類、脂肪和小分子代謝物 等。在精液中前列腺小體比中性粒細胞發(fā)揮更強的抗菌功能。前列腺小體可作為強有力的 抗氧化劑，中和白細胞的ROS作用。前列腺小體的特殊的脂質結構和成分是其抗氧化抗菌 功能的關鍵因素，推測在炎癥的過程中可W檢測到前列腺小體，同時此研究為開發(fā)新類型 的抗菌藥物提供了理論基礎。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于此，本發(fā)明提供了一株抗前列腺小體蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞及其分泌 的抗前列腺小體蛋白的單克隆抗體，并且提供了該抗體在檢測前列腺小體蛋白中的應用， 在慢性前列腺炎的檢測和診斷中具有重要作用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案： 一種雜交瘤細胞（mus mus州Ius hybridoma)，其分類命名雜交瘤細胞株LCZ4冊，保藏 編號為 CCTCC NO ;C2014167。
[0007] 本發(fā)明提供了上述雜交瘤細胞的制備方法；用前列腺小體蛋白蛋白免疫BALB/C 小鼠，然后取BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0細胞在聚己二醇作用下進行融合，融合后進行HAT 培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA檢測，篩選出陽性雜交瘤細胞用有限稀 釋法克隆至能穩(wěn)定分泌抗前列腺小體蛋白單克隆抗體，即獲得抗前列腺小體蛋白單克隆抗 體雜交瘤細胞。
[000引具體地，所述前列腺小體蛋白蛋白免疫BALB/C小鼠具體為；取前列腺小體蛋白 蛋白30 Ug加等質量福氏完全佐劑對BALB/C小鼠進行第一次免疫注射；2周后取前列腺 小體蛋白蛋白50yg加等質量福氏不完全佐劑對BALB/C小鼠進行第二次免疫注射；4周 后取前列腺小體蛋白蛋白50yg對BALB/C小鼠進行第H次免疫注射；6周后取前列腺小 體蛋白蛋白50yg對BALB/C小鼠進行第四次強化注射。
[0009] 具體地，所述HAT培養(yǎng)具體操作為；用含20%胎牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基與雜 交瘤細胞混勻并加入到種有飼養(yǎng)細胞的96孔板中培養(yǎng)2周。
[0010] 具體地，所述化ISA檢測具體操作為；雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液加入到前列腺小體 蛋白包被的酶標板中于37C賠育20min，洗涂后W工作濃度為1:2500的標準加HRP標記 的羊抗鼠IgG于37C賠育20min，然后加鄰苯二胺底物顯色15min后終止反應。
[0011] 經(jīng)過上述方法制備后，最終篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗前列腺小體蛋白的雜交瘤細 胞，命名為LCZ4冊，并于2014年9月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中也，地址為中國武 漢大學。保藏編號為CCTCC N0;C2014167。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種抗前列腺小體蛋白單克隆抗體，由保藏編號為CCTCC NO : C2014167的雜交瘤細胞分泌產(chǎn)生。制備抗前列腺小體蛋白單克隆抗體可采用本【技術領域】 常規(guī)方法，如用雜交瘤細胞株誘導小鼠腹水，本發(fā)明優(yōu)選為： 將保藏編號為CCTCC NO ;C2014167的雜交瘤細胞傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞計 數(shù)，小鼠腹腔接種1 X IO6個/只，誘導腹水，離也，收集上清，用透析法純化抗前列腺小體蛋 白單克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明所述保藏編號為CCTCC NO ;C2014167的雜交瘤細胞染色體穩(wěn)定，其分泌產(chǎn) 生的抗前列腺小體蛋白單克隆抗體均為IgGl型，效價較高，直接培養(yǎng)的上清可達1:2000， 小鼠腹水可達14mg/ml，效價可達1:10000,完全能夠應用于前列腺小體蛋白應用研究。
[0014] 本發(fā)明還提供了保藏編號為CCTCC NO ;C2014167的雜交瘤細胞在制備抗前列腺 小體蛋白單克隆抗體中的應用。
[0015] 由W上技術方案可知，本發(fā)明提供了一株抗前列腺小體蛋白單克隆抗體雜交瘤細 胞及其分泌產(chǎn)生的抗前列腺小體蛋白單克隆抗體，該雜交瘤細胞能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗前列腺小 體蛋白單克隆抗體，且細胞染色體穩(wěn)定、抗體效價高，完全能夠應用于前列腺小體蛋白的應 用的研究中。主要包括： 所述的單克隆抗體LCZ4H3在制備前列腺小體蛋白檢測試劑盒中的應用，上述試劑盒 包含有保藏編號為CCTCC NO ;C2014167的雜交瘤細胞分泌的抗前列腺小體蛋白的單克隆 抗體。
[0016] 所述的單克隆抗體LCZ4冊在制備檢測前列腺小體蛋白的膠體金快速檢測試紙條 中的應用，上述的試紙條包含有保藏編號為CCTCC NO ;C2014167的雜交瘤細胞分泌的抗前 列腺小體蛋白的單克隆抗體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為前列腺小體蛋白的膠體金快速檢測試紙條示意圖。
[0018] 生物保藏信息說明；本發(fā)明的生物材料，其分類命名為雜交瘤細胞株LCZ4冊，于 2014年9月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中也(簡稱為CCTCC)，地址為：中國.武漢.武 漢大學，保藏編號為CCTCC NO ;C2014167。

【具體實施方式】
[0019] W下對本發(fā)明原理和特征進行舉實例描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用 于限定本發(fā)明的范圍。
[0020] 實施例1、雜交瘤細胞LCZ4H3及其產(chǎn)生的抗前列腺小體蛋白的單克隆抗體的獲 得。
[0021] 1.前列腺小體蛋白的提取 取500毫升慢性前列腺炎病人晨尿中段尿，加入等量肥PES緩沖液（pH7. 3)和蛋白 酶抑制劑（美國Sigma公司），用紗布過濾。于-4CTCW下條件保存?zhèn)溆?。取尿液樣品過 濾液，分別置于10只50毫升離也管，在4C低溫下400g離也10分鐘。去沉淀，取上清液。 在4C低溫下10, OOOg離也20分鐘。去沉淀，取上清液。分別置于200只3毫升超速離也 管，在4°C低溫下100, OOOg離也120分鐘。倒去上清液，取沉淀。加入2. 5毫升TBS緩沖液 (抑7. 8)和蛋白酶抑制劑（美國Sigma公司），混勻。在4°C低溫下100, OOOg離也120分鐘。 倒去上清液，取沉淀。分別溶于2. 5毫升0.5 % NP-40, SOmM化Cl, 0.2% Deowcholate, 50 ml Tris, pH 8.0和蛋白酶抑制劑（美國Sigma公司）。在4°C低溫下100, OOOg離也 20分鐘。取上清液，是為前列腺小體蛋白。-8(TC冷凍保存。
[0022] 2.前列腺小體蛋白鑒定 蛋白標準：用分光光度計法，波長560nm (Img/ml IgG吸光值為1.34)測定，蛋白含量 > SmgZmln
[0023] 3.雜交瘤細胞的制備 3. 1選6只8-12周齡Ba化/C小鼠進行肌肉內(nèi)免疫，初次免疫用50ug/ml前列腺小體 蛋白加弗氏完全佐劑。兩周后，用25ug/ml前列腺小體蛋白加弗氏不完全佐劑強化免疫2 次，每次間隔2周。最后一次用25ug/ml前列腺小體蛋白肌肉注射強化免疫(不含佐劑)，3 天后尾部采血，ELISA檢測血清抗體效價。
[0024] 3. 2雜交瘤細胞融合篩選：融合前4天將陽性小鼠強化免疫，小鼠脾細胞與骨髓 瘤細胞SP2/0比例為10 : 1，陽G(分子量1500)融合，選擇培養(yǎng)基為含HAT的RPMI640培 養(yǎng)基。10天后，ELISA篩選雜交瘤細胞上清，用有限稀釋法對抗體分泌陽性雜交瘤細胞進 行克隆，經(jīng)過4次篩選最終確定5株細胞為陽性細胞。
[002引 3. 3間接ELISA法用2ug/ml的抗原(前列腺小體蛋白巧Oul/孔包被96孔板，1小 時，用洗液洗涂3次，加IOOW/孔封閉液在37°C封閉化，洗涂3次，拍干。加入待測樣品(血 清)，第一孔1 : 800稀釋，往下1 : 2的梯度倍比稀釋，37C賠育30min，洗板4次，拍干。 取辣根酶標記的羊抗鼠IgG按照1 : 2500倍稀釋，IOOul/孔加入板子，37C賠育30min，洗 涂4次，拍干。最后加入TMB IOOul/孔，37。顯色15-30min。然后加入終止液（2M H2SO4) 50W/孔。W 450皿單波長測定各孔OD值，并用陽性對照孔OD值（1: 800)，作為判斷陽性 或者確定效價的臨界點。結果為血清效價為1 : 128000的陽性小鼠，可W用于細胞融合。
[0026] 3. 4間接ELISA法檢測所有陽性5株細胞是否能夠特異識別前列腺小體蛋白，W 前列腺小體蛋白為抗原，可W看出，一株命名為LCZ4H3的陽性細胞可W與前列腺小體蛋白 特異結合，說明LCZ4H3可W特異識別前列腺小體蛋白。經(jīng)篩選得到能穩(wěn)定分泌抗人前列腺 小體蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株LCZ4H3,該雜交瘤細胞株LCZ4H3的分類命名為小 鼠雜交瘤細胞mus mus州lushybridoma，已于2014年9月11日保藏于保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中也，地址為中國武漢大學，保藏號為CCTCC NO: C2014167。
[0027] 4.單克隆抗體LCZ4冊的生產(chǎn)及純化 4. 1同系小鼠單克隆抗體腹水的制備；采用動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法。每只Ba化/C 小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟0. 5ml，7天后，每只小鼠腹腔注射1 X IO6個小鼠雜交瘤細胞 (mus mus州Ius hybridoma) LCZ4冊。7天后觀察小鼠腹水生產(chǎn)情況，如腹部明顯膨大，即可 抽取腹水。腹水采集后13000RPM離也IOmin除去油脂和沉淀，收集上清液，即為腹水單克 隆抗體。
[0028] 4. 2純化采用硫酸饋沉淀和透析法，純化腹水單克隆抗體。
[0029] 5.單克隆抗體特性鑒定 5. 1采用Sigma分型試劑盒鑒定單克隆抗體的亞類，雜交瘤細胞株LCZ4冊分泌的單 克隆抗體的重鏈為IgGl,輕鏈為Kappa型。
[0030] 5. 2 ELISA效價的測定采用間接ELISA測定純化的腹水單克隆抗體，2帖Zml的 抗原IOOMl/孔包被96孔板做化ISA，結果顯示純化后效價為1: 25600。
[0031] 5. 3抗體的分子質量鑒定：采用SDS-PAGE進行測定單克隆抗體，顯示單克隆抗體 的重鏈約為46邸，輕鏈約為25邸。
[0032] 5. 4單抗?jié)舛葴y定：紫外分光法測定單克隆抗體在280nm和260nm處的吸光度值 A280和A260。結果為蛋白質含量為14 mg/ml。
[0033] 蛋白含量按照下列公式計算： 蛋白質含量（g/L) =1.45XA280-0. 74XA260。
[0034] 實施例2、單克隆抗體LCZ4H3在制備前列腺小體蛋白檢測試劑盒中的應用。
[0035] 本試劑盒采用酶聯(lián)免疫法定量檢測人體前列腺小體外泄蛋白前列腺小體蛋白（間 接化ISA方法）； 1.將稀釋為一定比例的前列腺小體蛋白包被在96孔板中炬I-Fl孔），其余孔加尿液 標本，37C恒溫箱賠育1小時，洗板機洗板后，加BSA封閉，每孔100微升，37C恒溫箱賠育 40分鐘，洗板5次。加入單克隆檢測抗體LCZ4H3, 37C恒溫箱賠育40分鐘，洗板后，加入 HRP標記的羊抗鼠IgG, 37C恒溫箱賠育20分鐘，洗板后避光顯色，然后加入終止液，終止 反應。用酶標儀測定各反應孔在雙波450, 630 nm處的OD值。根據(jù)不同濃度的標準品OD 值繪出標準曲線，將病人的數(shù)值與陽性標準孔數(shù)值比較，從而得出被測試者尿樣本的實際 前列腺小體蛋白濃度。
[0036] 2.自配清洗液，顯色劑，終止液：清洗液為含0. 05%吐溫-20的PBS溶液；顯色劑 A含巧樣酸，己酸軸，過氧化脈；顯色劑B含巧樣酸，邸TA, TMB鹽酸鹽，硫代硫酸軸溶液；終 止液為2mol/L肥S04。
[0037] 3.分析精密度；批內(nèi)變異：用兩個濃度水平的樣本(炎癥和正常人)各重復檢測10 次，計算10次測量濃度結果的平均值M和標準差SD，得出變異系數(shù)CV。批間差：用3個批 號的試劑盒分別檢測同樣兩份標本，各重復10次，計算30次結果的平均值M和標準差SD， 求出變異系數(shù)CV。
[003引 4.樣本檢測：用間接ELISA方法檢測前列腺炎癥和正常人尿樣本。根據(jù)臨床樣 本檢測真陽性a,假陽性b，假陰性C，真陰性d，求出檢測靈敏度，特異度，陽性預期值，陰性 預期值并計算化toff值。
[0039] 表1患者和正常人群中前列腺小體蛋白含量比較（ng/ml)

【權利要求】
1. 一種雜交瘤細胞，其特征在于，其分類命名雜交瘤細胞株LCZ4H3,保藏編號為CCTCC NO: C2014167。
2. 根據(jù)權利要求1所述的雜交瘤細胞，其特征在于，所述雜交瘤細胞由以下方法制備 獲得：前列腺小體蛋白蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0細胞 在聚乙二醇作用下進行融合，融合后進行HAT培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液進行 ELISA檢測，篩選出陽性雜交瘤細胞用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定分泌抗前列腺小體蛋白單 克隆抗體，即獲得抗前列腺小體蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞。
3. 根據(jù)權利要求2所述的雜交瘤細胞，其特征在于，所述前列腺小體蛋白蛋白免疫 BALB/C小鼠具體為：取前列腺小體蛋白蛋白30iig加等質量福氏完全佐劑對BALB/C小 鼠進行第一次免疫注射；2周后取前列腺小體蛋白蛋白50 yg加等質量福氏不完全佐劑 對BALB/C小鼠進行第二次免疫注射；4周后取前列腺小體蛋白蛋白50iig對BALB/C小 鼠進行第三次免疫注射；6周后取前列腺小體蛋白蛋白50 yg對BALB/C小鼠進行第四次 強化注射。
4. 根據(jù)權利要求2所述的雜交瘤細胞，其特征在于，所述HAT培養(yǎng)具體操作為：用含 20%胎牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基與雜交瘤細胞混勻并加入到種有飼養(yǎng)細胞的96孔板中 培養(yǎng)2周；所述ELISA檢測具體操作為：雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液加入到前列腺小體蛋白包 被的酶標板中于37°C孵育20min，洗滌后以工作濃度為1:2500的標準加 HRP標記的羊抗 鼠 IgG于37°C孵育20min，然后加鄰苯二胺底物顯色15min后終止反應。
5. 權利要求1所述的雜交瘤細胞在制備抗前列腺小體蛋白單克隆抗體中的應用。
6. -種抗前列腺小體蛋白單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號為CCTCC NO: C2014167的雜交瘤細胞分泌產(chǎn)生。
7. 權利要求6所述的單克隆抗體在制備前列腺小體蛋白檢測試劑盒中的應用。
8. 權利要求6所述的單克隆抗體在制備檢測前列腺小體蛋白的膠體金快速檢測試紙 條中的應用。
9. 一種檢測前列腺小體蛋白的試劑盒，其特征在于，包含權利要求6所述的單克隆抗 體。
10. -種檢測前列腺小體蛋白的膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，包含權利要求6 所述的單克隆抗體。
【文檔編號】C12N5/20GK104357404SQ201410626105
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權日:2014年11月10日
【發(fā)明者】張嬌, 曾燕, 錢澤 申請人:昂科生物醫(yī)學技術(蘇州)有限公司