分泌抗煙草花葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分泌抗煙草花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用純化的煙草花葉病毒（TMV）的病毒粒子為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗TMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3A7，其保藏號(hào)為CGMCC No.9338。該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-8，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。該株單抗與TMV有特異性反應(yīng)。利用3A7單抗建立的檢測(cè)煙草等植物中TMV的dot-ELISA檢測(cè)病毒。該雜交瘤細(xì)胞株3A7及其單抗的獲得和相關(guān)血清學(xué)檢測(cè)方法的建立為該病毒病的診斷、檢測(cè)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。CGMCC No933820140703
【專利說明】分泌抗煙草花葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分泌抗煙草花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus ,TMV)是植病毒中較重要的病毒之一.也是煙草花葉病毒屬的模式種。它是一種RNA病毒,病毒粒體為棒狀,長(zhǎng)度為300?310 nm、直徑18 nm ;TMV基因組為單鏈正義RNA，病毒基因組長(zhǎng)6.3?6.6kb，其基因組5’端含有帽子結(jié)構(gòu)，有70個(gè)核苷酸左右的非編碼區(qū)(UTR) ;3’端的UTR長(zhǎng)200?400nt，能折疊成類似tRNA狀結(jié)構(gòu)。基因組至少編碼4種蛋白，靠5’端的124?132kDa及181?189kDa兩個(gè)蛋白與病毒的復(fù)制有關(guān)，其中181?189kDa蛋白是由124?132kDa蛋白終止子通讀產(chǎn)生。另外兩個(gè)蛋白分別為28?311kDa的移動(dòng)蛋白(MP)和17?18kDa的外殼蛋白(CP)，這兩個(gè)蛋白分別由不同的亞基因組RNA表達(dá)產(chǎn)生。
[0003]TMV的寄主范圍非常廣，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科及莧科等36科150多個(gè)屬350種植物，包括煙草、番茄、茄子、辣椒、菠菜等，導(dǎo)致煙草和番茄等作物的嚴(yán)重危害。全世界每年因TMV而造成的經(jīng)損失就超過I億美元。煙草業(yè)在我國(guó)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著重要的地位，而煙草花葉病嚴(yán)重危害煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，成為影響優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，使煙葉出口所面臨的挑戰(zhàn)，同時(shí)給我國(guó)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。不同條件下同種病毒的癥表現(xiàn)狀有很大差異，而不同病毒在煙葉上表現(xiàn)為相似的癥狀，因此建立煙草花葉病毒病檢測(cè)體系對(duì)于煙葉病毒病的防治有重要意義。
[0004]為了掌握煙草花葉病毒(TMV)病害在我國(guó)的發(fā)病危害狀況，強(qiáng)化我國(guó)煙草花葉病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控，急需建立檢測(cè)煙草花葉病毒病的高通量檢測(cè)方法，而目前沒有這種高通量的檢測(cè)方法，僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法、核酸電泳等方法進(jìn)行小樣本檢測(cè)。本發(fā)明提純的TMV病毒為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了 I株分泌抗TMV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞3A7，以制備的單抗為核心可建立檢測(cè)TMV的高通量的血清學(xué)方法及其試劑盒，從而為我國(guó)煙草花葉病毒病檢測(cè)、早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗煙草花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
[0006]分泌抗煙草花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3A7，它能分泌抗煙草花葉病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株3A7于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9338。
[0007]抗煙草花葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與煙草花葉病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng),該單克隆抗體檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋。
[0008]抗煙草花葉病毒的單克隆抗體僅與煙草花葉病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、黃瓜花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番茄斑萎病毒、建蘭花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0009]抗煙草花葉病毒單克隆抗體在抗煙草花葉病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:1)提供的雜交瘤細(xì)胞株3A7分泌抗煙草花葉病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)煙草花葉病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)煙草花葉病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物中的煙草花葉病毒的檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)TMV的靈敏度分析。

【具體實(shí)施方式】
[0012]分泌抗煙草花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3A7于2014年7月3日保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101，保藏號(hào)為CGMCC N0.9338，它能分泌抗煙草花葉病毒的單克隆抗體。
[0013]抗煙草花葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體能與煙草花葉病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng),該單克隆抗體檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋。
[0014]抗煙草花葉病毒的單克隆抗體僅與煙草花葉病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、黃瓜花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番茄斑萎病毒、建蘭花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
[0015]抗煙草花葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0016]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株3A7能大量分泌抗煙草花葉病毒單抗，且其分泌的單抗特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立的檢測(cè)TMV的高通量的血清學(xué)方法及其檢測(cè)試劑盒可成功應(yīng)用于田間TMV的檢測(cè)，從而為我國(guó)煙草花葉病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、檢測(cè)和科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0018]一、雜交瘤細(xì)胞的獲得及其單克隆抗體的制備 1.免疫原及檢測(cè)抗原的制備用下面的操作步驟提純病毒粒子:
1)將大研缽和組織攪拌器預(yù)冷；
2)稱取500g煙草病葉，每10g病葉中加入pH7.5的0.5M磷酸鹽緩沖液(即PB緩沖液)200ml (含0.0lM Na-EDTA和0.1%巰基乙醇)，勻漿2分鐘后用雙層尼龍紗布過濾，濾液離心(6000r/min, 20min)去植物組織殘洛；
3)所得上清液邊攪拌邊滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG(分子量為6000)和0.1 mol/L NaCl, 4°C攪拌4h以上；
4)離心(11000r/min，15min)得沉淀；
5)沉淀用pH7.5的0.5M PB (含0.0lM MgCl2和0.5M脲)充分洗滌，離心(6000r/min, 15min)后吸出上清置于離心管，沉淀再洗滌，離心反復(fù)3次；
6)合并上清液，超速離心(33000r/min,10min)所得沉淀懸浮后離心(8000r/min,15min)；
7)合并上清液再超離心(33000r/min,10min),離心管底部加有20%_30%鹿糖墊；
8)所得沉淀用pH7.5的0.5M PB (含0.0lM MgCl2)懸浮，懸浮液即為病毒提純液；
9)用電子顯微鏡觀察提純樣品，發(fā)現(xiàn)大量高純度的煙草花葉病毒粒子。
[0019]2.免疫動(dòng)物
用TMV提純病毒免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠。即TMV提純病毒粒子35μ?7只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0020]3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按6:1的比例，在無血清的RPM1-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0021]4.雜交瘤細(xì)胞、陽性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-30%時(shí)，以感染TMV病毒的煙草葉片和提純病毒為抗原包被，用常規(guī)間接ELISA方法篩選分泌單抗的陽性孔，共獲130個(gè)陽性孔。選擇15個(gè)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得I株能分泌抗TMV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株3A7。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0022]5.單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、黃瓜花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒、煙草花葉病毒的病葉汁包被ELISA板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對(duì)照，以感染煙草花葉病毒的病葉汁液為陽性對(duì)照，用ACP-ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。ACP-ELISA方法具體為:上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30(w/v, g /mL)力口入ELISA包被液研磨后10ul/孔包被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時(shí)，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉30-60min ;加入適當(dāng)稀釋的單抗10ul/孔，37°C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入10000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)10ul/孔，37°C 1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3A7單抗對(duì)TMV有特異性反應(yīng)，而與番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、黃瓜花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番爺斑萎病毒、建蘭花葉病毒和健康植物均無特異性反應(yīng)。
[0023]6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X 15個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水),室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時(shí)，12000rpm離心20min,收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，_70°C保存。
[0024]7.單克隆抗體的類型及亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3A7單抗亞類為IgGl、kappa鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)達(dá)到10 一8。
[0025]二、病毒免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒
1.以單抗為核心建立抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測(cè)病毒 ACP-ELISA方法的操作步驟:
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)按1:30 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液10ul/孔加入ELISA板，以TMV病葉為陽性對(duì)照，健葉為陰性對(duì)照，37°C 2h，或4°C過夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后10ul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗(Sigma), 10ul/ 孔，37。。，Ih ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物10ul/孔，室溫30min；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽性，或用2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)0D405，以P/N> 2.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0026]檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該單抗建立的上述ACP-ELISA方法能很好地檢測(cè)植物樣品中的TMV病毒。
[0027]ACP-ELISA方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè):
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對(duì)病葉從1:20至40960作倍比稀釋分別以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對(duì)照，進(jìn)行上述ACP-ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對(duì)1:40960倍稀釋的病葉汁液檢測(cè)仍呈陽性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到1:40960，表明ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。
[0028]2.dot-ELISA方法的建立及田間檢測(cè)應(yīng)用
2.1 dot-ELISA檢測(cè)植物中TMV方法的建立及其田間樣品檢測(cè)將病葉稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30 (w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS(ρΗ7.4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ I上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜(NC)上，同時(shí)設(shè)置健康和感病病葉汁分別作為陰性和陽性對(duì)照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3_4次，每次3 min ；NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30-60 min; PBST洗膜4_5次，每次3 min; 66 μ L NBT 和 33 μ L BCIP 底物(Promega)加入到 10 ml 底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCU0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果O
[0029]用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)病葉的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明3A7單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)TMV的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)煙草葉片稀釋到1:20480倍(w/v, g/mL)時(shí)，以3A7單抗建立的dot-ELISA檢測(cè)仍呈現(xiàn)紫色的陽性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:20480倍稀釋(圖1)。
[0030]用建立的dot-ELISA方法對(duì)2014年采自浙江溫嶺田間疑似發(fā)病樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，89個(gè)檢測(cè)樣品中有51個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽性斑點(diǎn)，陽性樣品進(jìn)一步用PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽性樣品均檢測(cè)到TMV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽性樣品感染TMV。說明該dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于植物樣品中煙草花葉病毒的檢測(cè)。
[0031]3.檢測(cè)TMV的TAS-ELISA檢測(cè)方法 TAS-ELISA方法的操作流程:
1)1:5000倍稀釋的抗TSWV的兔抗血清(由純化的TSWV粒子免疫兔子制備)10ul/孔包被聚苯乙烯板，37°c，2-4h或4°C，過夜；
2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉200ul/孔于 37°C 封閉 30-60min
3)加入檢測(cè)樣品10ul/孔。以TMV病葉為陽性對(duì)照，以相應(yīng)的健康樣品為陰性對(duì)照，370C l-2h ；
4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水10ul/孔，37°Cl_2h
5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(Sigma) 10ul/孔，37°C
l-2h
6)PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色50min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽性，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)405nm的OD值，以P/N>2.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。。
[0032]TAS-ELISA檢測(cè)方法最適條件的確定:
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向分別加用包被緩沖液從1: 100至1: 102400倍比稀釋的兔抗TMV血清；加入TMV病葉汁；縱向分別加用封閉液從1: 5至1: 2048000倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說明書稀釋，I: 10000倍；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果為TMV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1:5000、I: 8000。
[0033]TAS-ELISA方法檢測(cè)靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將TMV病葉汁用PBS倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測(cè)定，結(jié)果為:TAS-ELISA檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋(w/v，g /mL)，說明本方法具有很好的靈敏度。
[0034]4.煙草花葉病毒dot-ELISA檢測(cè)試劑盒
1)試劑盒主要成分:
TMV單克隆抗體I管0.2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
NBT/BCIP底物各I瓶分別為2 ml和Iml
陽性對(duì)照I (含TMV葉片汁液)I管2 ml
陰性對(duì)照I (健康煙草葉片汁液)I管2 ml
抗體稀釋液(1X) I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)檢測(cè)的操作步驟:
a.將植物葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30(w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7.4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ I上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病煙草葉汁分別作為陰性和陽性對(duì)照，室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1:2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；
f.用PBST洗膜3-4次，每次3min; NC膜放入1:3000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30-60 min;
g.PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽性對(duì)照顯色明顯(紫色)，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0035]3)保存及有效期于2?8°C避光保存，有效期12個(gè)月。
[0036]4)緩沖液配方:
磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L, ρΗ7.4):NaCl8 g
KCl0.2 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO412H203g
疊氮化鈉0.2 g
加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7.4，定容至1000 mlELISA 洗滌液(0.01 mol/L PBST):
1000 ml 0.01mol/L PBS 中加 0.5 ml Tween-20ELISA封閉液:
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
【權(quán)利要求】
1.一種分泌抗煙草花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3A7，其特征在于能分泌抗煙草花葉病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株3A7于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9338。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株3A7分泌的抗煙草花葉病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)1(Γ8,抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與煙草花葉病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，該單克隆抗體檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋。
3.如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株3A7分泌的抗煙草花葉病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體僅與煙草花葉病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與番茄花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、黃瓜花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番茄斑萎病毒、建蘭花葉病毒均不發(fā)生免疫反應(yīng)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗煙草花葉病毒單克隆抗體在煙草花葉病毒檢測(cè)上的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104404000SQ201410627312
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】吳建祥, 周雪平, 謝艷 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)