一株產(chǎn)甲殼素酶菌株及其利用蟹殼發(fā)酵產(chǎn)甲殼素酶的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株產(chǎn)甲殼素酶菌株及其利用蟹殼發(fā)酵產(chǎn)甲殼素酶的應(yīng)用，該菌株為類芽孢桿菌(Paenibacillus pasadenensis)CS0611，已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2014458，保藏日期為2014年10月8日。以該菌為出發(fā)菌種，利用蟹殼為碳源和氮源，通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素酶，不僅具有發(fā)酵技術(shù)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，發(fā)酵上清液酶活可達(dá)211.3mU/mL，而且能夠高效水解蝦蟹殼廢棄物，降低其對(duì)環(huán)境造成的污染。
CCTCC NO: M2014458
20141008
【專利說(shuō)明】一株產(chǎn)甲殼素酶菌株及其利用蟹殼發(fā)酵產(chǎn)甲殼素酶的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一株產(chǎn)甲殼素酶菌株及利用蟹殼發(fā)酵產(chǎn)甲殼素酶的方法，屬于生物

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲殼素酶是一類可高效降解甲殼素中0_1，4糖苷鍵的水解酶，主要存在于動(dòng)物、 植物以及真菌、細(xì)菌、放線菌中，在生物防治、衛(wèi)生醫(yī)療和甲殼素的資源化利用領(lǐng)域具有廣 闊的應(yīng)用前景。甲殼寡糖是甲殼素經(jīng)甲殼素酶水解得到的低聚糖，在醫(yī)藥、食品保健和植物 防御等方面的應(yīng)用已經(jīng)被發(fā)掘，并已成為甲殼素研宄的一個(gè)熱點(diǎn)。研宄發(fā)現(xiàn)，聚合度為2-8 的甲殼寡糖在降血脂血糖、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)、抗腫瘤及抗感染方面具有重要作用。同時(shí)也 能夠延長(zhǎng)農(nóng)產(chǎn)品的保質(zhì)期并促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)。N-乙酰氨基葡萄糖是一類顯著的抗炎藥，可 用于治療潰爛性腸炎及其他胃腸紊亂。因此關(guān)于甲殼素酶的研宄具有重要意義。
[0003] 目前，甲殼素酶主要通過(guò)微生物發(fā)酵的方法制備，其關(guān)鍵點(diǎn)在于產(chǎn)酶活性高、發(fā)酵 周期短的微生物菌株以及廉價(jià)的培養(yǎng)基原料。蝦蟹殼中含有的大量甲殼素、蛋白質(zhì)和礦物 質(zhì)鹽，可以為微生物生長(zhǎng)提供碳源、氮源及生長(zhǎng)因子。另外，每年生物合成的甲殼素約有100 億噸，海產(chǎn)品加工產(chǎn)生的蟹殼、蟹殼處理不當(dāng)就會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。利用蝦蟹殼作為培養(yǎng) 基質(zhì)，不僅保護(hù)了環(huán)境，還可以得到具有高附加值的產(chǎn)品，拓展了對(duì)海洋生物資源高值化利 用。
[0004] 由于甲殼素酶具有很高的經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，有關(guān)產(chǎn)甲殼素酶微生 物的報(bào)道很多，但仍存在酶制劑生產(chǎn)成本偏高、活性不足以滿足工業(yè)化需求，這也就限制了 甲殼素酶在工業(yè)上的大規(guī)模使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種利用篩選的類芽孢桿菌 Paenibacillus pasadenensis，在含蟹殼粉末培養(yǎng)基質(zhì)中發(fā)酵產(chǎn)甲殼素酶的方法。利用該 方法可以高效生物轉(zhuǎn)化蝦蟹殼粉末，并得到具有高活性的甲殼素酶。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -株產(chǎn)甲殼素酶菌株，該菌株為類芽抱桿菌菌株（Paenibacillus pasadenensis) CS0611，是從山東某生物制品廠殼聚糖生產(chǎn)廢棄物土壤中分離出來(lái)的，已于2014年10月8 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2014458，保藏地址為 中國(guó)武漢武漢大學(xué)（郵編為430072)。
[0008] 類芽抱桿菌（Paenibacillus pasadenensis) CS0611，在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37°C培 養(yǎng)24h觀察，細(xì)胞為短桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性。在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24h后， 菌落為乳白色，光滑，邊緣整齊。
[0009] 類芽抱桿菌（Paenibacillus pasadenensis)CS0611可用普通的細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)， 如LB培養(yǎng)基，pH7. 0,需氧，培養(yǎng)溫度為37°C ;可采用斜面、液體石蠟、甘油保藏法，保藏用的 培養(yǎng)基為膠體甲殼素（5-20) g/L，磷酸氫二鉀（0.5-1. 0)g/L，磷酸二氫鉀（0.5-1. 0)g/L，硫 酸鎂（0. 3-0. 7)g/L，氯化鈉（0. 08-0. 12)g/L，蛋白胨（l-4)g/L，pH7. 0。
[0010] 類芽抱桿菌（Paenibacillus pasadenensis)CS0611 特性說(shuō)明如下：
[0011] 1、分子生物學(xué)鑒定：
[0012] 類芽抱桿菌（Paenibacillus pasadenensis)CS061116S rDNA 測(cè)序由上海生工生 工工程有限公司完成，DNA序列如Seq ID No: 1所示。
[0013] 對(duì)所得的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1。從圖中的聚類結(jié)果 可以看出，CS0611 的 16S rDNA的核苷酸序列與Paenibacillus pasadenensis strain NBRC 101214有較高的同源性（99% )，與其他幾種菌株有98%的同源性，可以認(rèn)為CS0611屬于 Paenibacillus pasadenensis，或是其亞種。
[0014] 2、生理生化鑒定：
[0015] 菌株CS0611可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖和木糖生長(zhǎng)并發(fā) 酵產(chǎn)酸，不能利用甘露醇、棉籽醇生長(zhǎng)?？稍?% (w/v)NaCl，45°C條件下生長(zhǎng)。部分生理生 化特性如表1所示，能液化明膠，水解淀粉，卵磷脂酶、接觸酶陽(yáng)性，M-R陽(yáng)性，產(chǎn)吲哚，V-P陰 性。
[0016] 根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特征，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可鑒定該菌株為 類芽孢桿菌屬，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定類芽孢桿菌CS0611為Paenibacillus pasadenensis 或其亞種。
[0017] 表1類芽孢桿菌CS0611生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一株產(chǎn)甲殼素酶菌株，其特征在于，該菌株為類芽孢桿菌（Paenibacillus pasadenensis)CS0611，已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2014458,保藏日期為2014年10月8日。
2. 權(quán)利要求1所述的菌株利用蟹殼發(fā)酵產(chǎn)甲殼素酶的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的菌株接種至發(fā)酵培 養(yǎng)基中，在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5. 0-8. 5,溫度為28-40 °C條件下，搖床發(fā)酵培養(yǎng)48-96h ; 離心去除菌體及蟹殼粉末，發(fā)酵上清即為甲殼素酶粗酶液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：蟹殼粉末 0. 5-20g/L，磷酸氫二鉀 0. 5-1. Og/L，磷酸二氫鉀 0. 2-0. 5g/L，硫酸鎂 0. 3-0. 7g/L，氯化鈉 0. 8-1. 2g/L〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，還包括種子液的培養(yǎng)，將權(quán)利要求1所述的 菌株首先接種至種子培養(yǎng)基中，在28-40°C，搖床培養(yǎng)12-30h，然后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，所 述種子培養(yǎng)基米用LB培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述種子液的培養(yǎng)中搖床的轉(zhuǎn)速為 150-250rpm〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為4% -8%，pH為 6. 0-7. 0,溫度 35-40 °C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)中搖床的轉(zhuǎn)速為150-300rpm。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3或4或5或6或7所述應(yīng)用，其特征在于，所述離心的條件為：轉(zhuǎn)速 6000-12000rpm，溫度 4-KTC。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3或4或5或6或7所述應(yīng)用，其特征在于，所述蟹殼粉末的直徑為 75-250 u m〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述蟹殼粉末濃度為10-30g/L ;直徑為 75-150 u m〇
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104450561SQ201410635361
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】婁文勇, 徐培, 宗敏華, 程建華 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)