一種叢枝菌根真菌的分離、菌劑制備及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明一種叢枝菌根真菌的分離、菌劑制備及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；叢枝菌根真菌是發(fā)明人自土壤中分離的叢枝菌根真菌根內(nèi)根生囊霉并命名為叢枝菌根真菌根內(nèi)根生囊霉CD-1(Rhizophagus irregularis CD-1)，鑒定其核糖體28S rDNA的特異序列如SEQ ID NO.1所示，利用該真菌制備獲得的菌劑，可以提高番茄的株高、葉柄數(shù)、地上鮮重、地上干重、根鮮重和根干重，以及可顯著促進(jìn)菌根侵染率>80％的玉米自交系株高、地上部鮮重、地上部干重，并提高玉米對(duì)紋枯病的抗性，具有極高的遺傳性利用價(jià)值。
CCTCC NO：M2014532
20141030
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種叢枝菌根真菌的分離、菌劑制備及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種叢枝菌根真菌的分離、菌劑制備及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提 供了一種從土壤中分離的叢枝菌根真菌根內(nèi)根生囊霉（Rhizophagus irregularis CD-1)、 及其菌劑的制備方法和在玉米和番茄上的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 叢枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF)是屬于 Gtomeromycota 門(mén) 的土壤有益真菌，與約80%的陸生植物根系間形成互惠共生體叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza，AMF)。植物與AMF的共生互作關(guān)系主要表現(xiàn)在：AMF從植物根系中獲得碳水化 合物來(lái)維持自身的生長(zhǎng)和完成生活史，但同時(shí)可促進(jìn)植物吸收水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，并能增強(qiáng) 植物對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性，進(jìn)而促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物耐鹽、耐旱、 耐重金屬和抗病能力。
[0003] 目前AMF的培養(yǎng)方法主要有盆栽培養(yǎng)法、培養(yǎng)基培養(yǎng)法、玻璃珠分室培養(yǎng)法、離體 無(wú)菌純培養(yǎng)、AMF與植物根器官的雙重?zé)o菌培養(yǎng)法、AMF與Ri T-DNA轉(zhuǎn)型根的雙重單胞無(wú)菌 培養(yǎng)法等。盆缽培養(yǎng)法和霧化培養(yǎng)法為用于商業(yè)化生產(chǎn)的主要方法，AMF的離體雙重培養(yǎng) 方法是獲得AMF純凈體和研究AMF遺傳、生理、生化等特性的理想方法，但目前還未獲得商 業(yè)化的生產(chǎn)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種叢枝菌根真菌的分離、菌 劑制備及其應(yīng)用；這種真菌是發(fā)明人自土壤中分離的叢枝菌根真菌根內(nèi)根生囊霉，鑒定其 核糖體28S rDNA的特異序列如SEQ ID NO. 1所示，利用該真菌制備獲得的菌劑，可以提高番 茄的株高、葉柄數(shù)、地上鮮重、地上干重、根鮮重和根干重以及可顯著促進(jìn)菌根侵染率>80% 的玉米自交系株高、地上部鮮重、地上部干重，具有極高的遺傳性利用價(jià)值。
[0005] 發(fā)明人首先提供了 一種土壤中分離的叢枝菌根真菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)和分子生物特 征，將其命名為叢枝菌根真菌根內(nèi)根生囊霉⑶_1 (Rhizophagus irregularis 0)-1)，發(fā)明 人對(duì)其進(jìn)行了生物保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO M2014532,驗(yàn)證結(jié)果為存活；
[0006] 其核糖體28S rDNA的特異序列如SEQ ID NO. 1所示，并利用Rhizophagus irregularis 0)_1與Ri T-DNA胡蘿卜根雙重培養(yǎng)的方法，得到大量Rhizophagus irregularis⑶-1的孢子和菌絲，并以此制備成高純度的AMF菌劑。
[0007] 發(fā)明人進(jìn)一步的將該菌劑應(yīng)用到番茄、玉米上，調(diào)查了該真菌的促生效果。在番茄 上發(fā)現(xiàn)Rhizophagus irregularis CD-1可侵染各種供試番爺品種，番爺根部觀察到叢枝菌 根真菌的各種形態(tài)，包括泡囊、菌絲、孢子和叢枝，根系菌根侵染率都達(dá)到90%以上，并且品 種間侵染率沒(méi)有顯著差異。測(cè)定番茄接種叢枝菌根后各種農(nóng)藝性狀指標(biāo)，結(jié)果表明AM真 菌能顯著提高番茄的株高、葉柄數(shù)、地上鮮重、地上干重、根鮮重和根干重，番茄的菌根依存 度都達(dá)到55%以上。在玉米上發(fā)現(xiàn)八個(gè)玉米自交系同Rhizophagus irregularis 0)_1都 可共生，但菌根侵染率差異很大。Rhizophagus irregularis Q)-l可顯著促進(jìn)菌根侵染率 >80%的玉米自交系株高、地上部鮮重、地上部干重，而對(duì)菌根侵染率< 15%的玉米自交系 的促生效果不顯著。玉米B73接種Rhizophagus irregularis Q)-l后可顯著提高玉米對(duì) 玉米紋枯病菌的抗性。
[0008] 綜上所述，可見(jiàn)該Rhizophagus irregularis 0)_1可促進(jìn)供試番爺苗期的生長(zhǎng)發(fā) 育，促進(jìn)根系侵染率較高玉米的生長(zhǎng)發(fā)育，還可以提高玉米B73對(duì)玉米紋枯病菌的抗性。
[0009] 保藏信息
[0010] 保藏時(shí)間：2014年10月30日
[0011] 保減單位名稱(chēng)：中國(guó)典型培養(yǎng)物保減中心
[0012] 保藏編號(hào)：CCTCC NO :M2014532
[0013] 保藏單位地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)
[0014] 分類(lèi)命名：叢枝菌根真菌根內(nèi)根生囊霉⑶_1 (Rhizophagus irregularis 0)_1)

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為叢枝菌根真菌Rhizophagus irregularis CD-1的形態(tài)圖，
[0016] 圖中為叢枝菌根真菌Rhizophagus irregularis 0)_1孢子和菌絲的形態(tài)圖，
[0017] 其中h為菌絲，s為孢子；
[0018] 圖2為接種和未接種Rhizophagus irregularis 0)_1的番爺根系形態(tài)圖；
[0019] 圖中A為未接種的對(duì)照；B、C、D為菌根化的番茄根系，其中eh為外生菌絲，ih為 內(nèi)生菌絲，ar為叢枝，v為泡囊，s為孢子；
[0020] 結(jié)果表明，在接種AMF的番茄根系中可觀察到AMF的形態(tài)，包括泡囊、菌絲、孢子和 叢枝，可見(jiàn)Rhizophagus irregularis CD-1與番爺形成了良好的共生體系；而不接種在接 種Rhizophagus irregularis 0)_1的番爺根系未見(jiàn)AMF的形態(tài)；
[0021] 圖3為AMF對(duì)不同番茄品種的侵染率柱狀圖；
[0022] 圖中差異顯著性用Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，不同字母表示p < 0. 01水平上差異極 顯著。non-AMF :未接種AMF的番爺品種；五種番爺品種為黃五彩番爺、花玫瑰水果番爺、紫 圣女番茄、黃美人、金黃一點(diǎn)紅，分別用以下編號(hào)表示：Z3、Zll、Z30、Z33、Z34。
[0023] 結(jié)果表明R. irregularis⑶-1對(duì)五種番茄的侵染率都很高，侵染效率在 90. 5% - 98. 5%之間，番茄品種間菌根侵染效率差異不顯著；五種番茄品種間形成泡囊或 產(chǎn)生菌絲（包含叢枝結(jié)構(gòu)）的根段數(shù)各不相同，其中Z3、Zll、Z33、Z34更易形成泡囊，而 Z30的泡囊率和菌絲率差異不大，圖中差異顯著性用Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，不同字母表示p <0.01水平上差異極顯著；
[0024] 圖4為番爺植株整體長(zhǎng)勢(shì)圖；
[0025] 圖中五種番爺品種為黃五彩番爺、花玫瑰水果番爺、紫圣女番爺、黃美人、金黃一 點(diǎn)紅，分別用以下編號(hào)表示：Z3、Zll、Z30、Z33、Z34A :Z3;B:Zll;C:Z30 ;D:Z33;E:Z34;-: 未接種AMF ;+ :接種AMF ;
[0026] 結(jié)果表明接種R. irregularis⑶-1后，可顯著促進(jìn)番爺植株的生長(zhǎng)；與未接種 AMF的對(duì)照相比，經(jīng)AMF處理的番茄植株長(zhǎng)勢(shì)更好，株高整體更高；
[0027] 圖5為AMF對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響圖；
[0028] 圖中五種番爺品種為黃五彩番爺、花玫瑰水果番爺、紫圣女番爺、黃美人、金黃一 點(diǎn)紅，分別用以下編號(hào)表示：23、211、230、233、234圖中：*表示顯著水平0.05，**表示極 顯著水平〇. 〇1 ;-AMF :未接種AMF ;+AMF :接種AMF ;
[0029] 結(jié)果表明與未接種AMF相比，接種AMF的番茄的株高、葉柄數(shù)、根冠比、地上鮮 重、地上干重、根鮮重、根干重都有顯著或極顯著性的增加（P〈〇. 05為顯著，P〈0. 01為極顯 著）；
[0030] 圖6為番茄對(duì)菌根的依存度圖；
[0031] 圖中五種番爺品種為黃五彩番爺、花玫瑰水果番爺、紫圣女番爺、黃美人、金黃一 點(diǎn)紅，分別用以下編號(hào)表示：23、211、230、233、234，差異顯著性用0皿(^11新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，不 同字母表示P < 〇. 05水平上差異顯著；
[0032] 結(jié)果表明五種番茄對(duì)R. irregularis的依存度存在差異，但依存度都達(dá)到55%以 上，其中Z33的菌根依存度最高，達(dá)到72. 11 %。5種番茄菌根依存度高低順序?yàn)椋篫33 > Z30 > Z34 > Z3 > Z11，菌根依存度越高，番茄對(duì)AMF的依賴(lài)性越強(qiáng)；
[0033] 圖7為AMF對(duì)不同玉米自交系株高的影響圖；
[0034] 圖中-AMF :未接種AMF ;+AMF :接種AMF, **表示極顯著水平0? 01 ;
[0035] 結(jié)果顯示根系侵染率>80 %的幾個(gè)玉米自交系，如GEMS63、CMBL21、ZZ03、 CMBLUGEMS13,接種叢枝菌根真菌后的株高顯著高于未接種的植株的株高；而接種叢枝菌 根真菌則對(duì)根系侵染效率< 15%的玉米自交系的株高沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用；
[0036] 圖8為AMF對(duì)不同玉米自交系地上部鮮重的影響圖；
[0037] 圖中-AMF :未接種AMF ;+AMF :接種AMF, *表示顯著水平0. 05, **表示極顯著水平 0. 01 ；
[0038] 統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，根系侵染率>80 %的幾個(gè)玉米自交系，接種叢枝菌根真菌的地 上部分鮮重顯著大于未接種的植株的地上部分鮮重；而接種叢枝菌根則對(duì)根系侵染效率 < 15%的玉米自交系的地上部分鮮重沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用；
[0039] 圖9為AMF對(duì)不同玉米自交系根部干重的影響圖；
[0040] 圖中-AMF :未接種AMF ;+AMF :接種AMF, *表示顯著水平0? 05 ;
[0041] 結(jié)果表明根系侵染率>80%的幾個(gè)玉米自交系，接種叢枝菌根真菌的地上部分 干重顯著大于未接種的植株的地上部分干重；而接種叢枝菌根真菌則對(duì)根系侵染效率 < 15%的玉米自交系的地上部分干重沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用；
[0042] 圖10為AMF對(duì)不同玉米自交系根部鮮重的影響圖；
[0043] 圖中-AMF :未接種 AMF ;+AMF :接種 AMF ;
[0044] 結(jié)果表明接種叢枝菌根對(duì)所有供試玉米自交系的根鮮重都沒(méi)有顯著的促進(jìn)作 用；
[0045] 圖11為AMF對(duì)不同玉米自交系根部干重的影響圖；
[0046] 圖中-AMF :未接種 AMF ;+AMF :接種 AMF ;
[0047] 結(jié)果表明接種叢枝菌根對(duì)所有供試玉米自交系的根干重都沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明 作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0049] 實(shí)施例1 :叢枝菌根真菌R. irregularis 0)_1的分離鑒定
[0050] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，從山東省泰安市山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田 采集玉米地的土樣，陰干后采用濕篩傾注法（郭秀珍，畢國(guó)昌.林木菌根及應(yīng)用技術(shù).北 京：中國(guó)林業(yè)出版社，1989. 216-220)從土樣中分離到叢枝菌根真菌的孢子，然后在解剖鏡 下用解剖針挑選孢子。以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和PCR為基礎(chǔ)的現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，對(duì)AMF孢子進(jìn)行 分類(lèi)鑒定。在體視顯微鏡下根據(jù)孢子的形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi)，挑選出具備叢枝菌根真菌特征 的孢子。
[0051] 對(duì)挑選出的具備叢枝菌根真菌特征的孢子提取基因組DNA，以之為模板進(jìn)行PCR， 擴(kuò)增28S rDNA的序列，PCR采用AMF特異性引物L(fēng)R15-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3,其核苷 酸序列如 SEQ ID N0. 2 所示，和 8. 225-AACTCCTCACGCTCCACAGA-3,其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3所示。
[0052] 反應(yīng)程序如下：預(yù)變性93°C 3min，變性93°C lmin，退火62°C lmin，延伸72°C lmin, 反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，后延伸72°C 10min(鄭世學(xué)，董秀麗，喻子牛，趙斌.以新鮮根段進(jìn)行AMF 的分子檢測(cè)及競(jìng)爭(zhēng)性侵染研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2004, 23(1) :126-132.);結(jié)束后，用1XTAE 緩沖液制作1 %瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物；用康為公司的DNA回收試劑盒回收PCR的產(chǎn)物 并純化擴(kuò)增片段，然后將純化的DNA片段直接由華大基因測(cè)序完成，序列為SEQ ID N0. 1。 隨后在http://www. ncbi. nlm. gov/BLAST/上進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)目的片段與Rhizophagus irregularis DA0M181602 的 28s rRNA 的 DNA 序列（HF968923)相似度最高，達(dá)到 99%，兩 者之間有3個(gè)堿基的差異，最終確定分離物為叢枝菌根真菌Rhizophagus irregularis, 我們對(duì)這一叢枝菌根分離物命名為叢枝菌根真菌根內(nèi)根生囊霉⑶-1 (Rhizophagus irregularis CD-I)，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了生物保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO M2014532,驗(yàn)證為 存活。
[0053] 實(shí)施例2 :叢枝菌根真菌與Ri T-DNA胡蘿卜根的雙重培養(yǎng)和AMF菌劑的制備
[0054] 本發(fā)明使用將分離得到Rhizophagus irregularis 0)_1的孢子經(jīng)表面消毒后 與發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出細(xì)胞中整合有Ri T-DNA胡蘿卜根放到M培養(yǎng)基上（BfiCARD, G.，and J. A.FORTIN. Early events of vesiculararbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytologist, 1988, 108:211218 ；St-Arnaud M, Hamel C,Vimard B,Caron M, Fortin JA. Enhanced hyphal growth and spore production of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices in an in vitro system in the absence of host roots. Mycol Res, 1996, 100:328332 ;畢銀_ ,李曉林，汪洪鋼.VA 菌根真菌對(duì)轉(zhuǎn)移Ri T-DNA胡蘿卜根器官的侵染[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，1999, 5(1): 76-80;畢銀麗，汪洪鋼，李曉林.叢枝菌根的雙重培養(yǎng)方法及其菌絲際的建立.菌物系 統(tǒng)，2000,19(4) :517-521)，待培養(yǎng)基上看到菌絲、孢子時(shí)將胡蘿卜菌根用雙重?zé)o菌培養(yǎng)法 培養(yǎng) Rhizophagus irregularis CD-1 的抱子和菌絲，
[0055] 制備AMF菌劑，具體方法如下：
[0056] (1)配制含蔗糖和不含蔗糖的M培養(yǎng)基，121°C高壓蒸汽滅菌8min，待培養(yǎng)基溫度 降至約50°C時(shí)，在無(wú)菌條件下，將含有蔗糖的M培養(yǎng)基倒入有隔板的培養(yǎng)皿的一側(cè)，厚度不 要超過(guò)隔板，而不含蔗糖的M培養(yǎng)基倒入另一側(cè)，厚度基本與隔板持平。
[0057] (2)將Rhizophagus irregularis 0)_1與胡蘿卜的共生體轉(zhuǎn)入有鹿糖的M培養(yǎng)基 的一側(cè)，18°C黑暗培養(yǎng)。
[0058] (3)隨著胡蘿卜根的生長(zhǎng)，部分根會(huì)越過(guò)隔板，在無(wú)蔗糖側(cè)AMF的菌絲、孢子得以 大量繁殖。大約2-3個(gè)月在無(wú)糖側(cè)出現(xiàn)大量的菌絲和孢子，待孢子顏色變暗后，將無(wú)糖側(cè)培 養(yǎng)皿中的胡蘿卜根用鑷子去除，收集無(wú)糖側(cè)的孢子和菌絲，以約l〇〇mL滅菌的蒸餾水/皿的 比例，用榨汁機(jī)充分破碎，以制備孢子懸浮液。將所有孢子懸浮液收集到一起，用抽樣調(diào)查 法計(jì)算孢子懸浮液中孢子的濃度。
[0059] AM菌劑制備完成，主要的侵染物包含孢子、菌絲，一個(gè)直徑為9厘米的培養(yǎng)皿大約 可以產(chǎn)出20000個(gè)孢子。常用的AM菌劑為含供試菌種孢子、被侵染根段及根外菌絲的土壤 混合物，不方便測(cè)定孢子的數(shù)量，而我們制備的AM菌劑為純的Rhizophagus irregularis CD-I的孢子和菌絲，孢子的數(shù)量可以簡(jiǎn)單測(cè)定。
[0060] 實(shí)施例3 :叢枝菌根真菌對(duì)五種番茄生長(zhǎng)發(fā)育的影響
[0061] 為了測(cè)定叢枝菌根真菌Rhizophagus irregularis 0)_1對(duì)番爺?shù)纳L(zhǎng)發(fā)育有何 種影響，我們以五種不同番爺品種為材料，通過(guò)盆栽試驗(yàn)接種Rhizophagus irregularis CD-1，研究不同番茄品種與AMF的共生效率，以及AMF對(duì)五種番茄品種的促生作用。
[0062] (1)育苗基質(zhì)的準(zhǔn)備
[0063] 育苗基質(zhì)為蛭石、草炭、珍珠巖以3:4:4的體積比混合所得，育苗基質(zhì)于121°C滅 菌30min，自然冷卻至室溫時(shí)，裝入體積為600cm3的缽子中，在缽子的3/4處接種含900個(gè) 孢子的AMF菌劑，之后用育苗基質(zhì)填滿缽子；同時(shí)以育苗基質(zhì)中接種等量水為對(duì)照。
[0064] (2)供試植物的處理
[0065] 番茄種子用70%酒精浸泡1分鐘后用蒸餾水洗凈，28°C催芽。將催芽的番茄種子 種于缽子中，每個(gè)缽子2粒種子，最后每個(gè)缽子留一棵長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄，每個(gè)處理重復(fù)8次。 每個(gè)番爺品種的對(duì)照與處理放于不同的托盤(pán)中。植株于日光溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，3天燒一次 水。
[0066] (3)測(cè)量指標(biāo)
[0067] 番茄種植2個(gè)月后處理番茄植株。用常規(guī)方法測(cè)定番茄的株高、葉柄數(shù)、地 上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重、地下部干重等。番茄根系剪成約lcm根段，用臺(tái) 盼藍(lán)染色(Phillips J M, Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection [J]. Transactions of the British mycological Society, 1970, 55(1) : 158-161)后隨機(jī)選取50段根段，在光學(xué)顯微鏡下觀察叢枝菌根 真菌的結(jié)構(gòu)。鏡檢后通過(guò)頻率標(biāo)準(zhǔn)法（Kormanik P P，McGraw A C. Quantification of vesicular-arbuscular mycorrhizae in plant roots[J]. In Methods and Principles of Mycorrhizal Research(Ed. by N C Schenck). AMFerican Phytopathological Society,St Paul，MirmeS〇ta，1982:37-45)計(jì)算根系侵染率，根系侵染率（％ )=被侵染的根段數(shù)/檢 測(cè)根段數(shù)X100%，泡囊侵染率（％)=含泡囊的根段數(shù)/檢測(cè)根段數(shù)X100%，菌絲侵染率 (%)=含菌絲或叢枝的根段數(shù)/檢測(cè)根段數(shù)X 100%。菌根依存度按下式計(jì)算：菌根依存 度（％ )=(接種處理干重一不接種處理干重）/接種干重X 100 (Takacs T, Voros L Effect of metal non-adapted arbuscular mycorrhizal fungi on Cd, Ni and Zn uptake by ryegrass[J] ? Acta Agronomica Hungarica, 2003, 51(3):347-354)〇 [0068] 分析結(jié)果表明，接種兩個(gè)月后，五種番茄都能與供試真菌建立共生關(guān)系，在番茄根 部觀察到叢枝菌根真菌的各種形態(tài)，包括泡囊、菌絲、孢子和叢枝，根系菌根侵染率都達(dá)到 90%以上，并且品種間侵染率沒(méi)有顯著差異（如圖2、3所示）。
[0069] 接種Rhizophagus irregularis CD-1后，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該真菌能顯著促進(jìn)番爺植株的 生長(zhǎng)（如圖4所不）。與未接種AMF的對(duì)照相比，經(jīng)AMF處理的番爺植株長(zhǎng)勢(shì)更好，株商整 體更高。
[0070] 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與未接種AMF相比，接種AMF的番茄的株高、葉柄數(shù)、根冠比、地上鮮 重、地上干重、根鮮重、根干重都有顯著或極顯著性的增加（P〈〇. 05為顯著，P〈0. 01為極顯 著，如圖5所示）。經(jīng)AMF處理的不同番茄品種的植株高度提高0. 70倍一 1. 05倍，其中Z34 受AMF的影響最為明顯，提高到2. 05倍，但這五個(gè)番茄品種之間提高的倍數(shù)差異不大。AMF 極顯著性增加了番茄的葉柄數(shù)，經(jīng)AMF處理的番茄植株葉柄數(shù)比對(duì)照組多出2- 4個(gè)。
[0071] AMF極顯著性增加了番茄的地上鮮重，與對(duì)照組相比，經(jīng)AMF處理的番茄植株地上 鮮重提高1. 56倍一2. 12倍，Z30、Z34這兩個(gè)品種受AMF的影響尤為明顯，地上鮮重都提高 了 2倍以上。AMF極顯著性增加了番茄的地上干重，而經(jīng)AMF處理的番茄植株地上干重提高 1. 33倍一2. 22倍，其中Z34提高到2. 99倍，Z30提高到3. 22倍，這兩個(gè)品種受到AMF的影 響尤為明顯。AMF極顯著性增加了番茄的根鮮重，與對(duì)照組相比，經(jīng)AMF處理的番茄植株根 鮮重提高〇. 98倍一3. 80倍，其中Z33提高到4. 80倍，受到AMF的影響尤為明顯。AMF極顯 著性增加了 Z3、Z30、Z33的根干重，而顯著性增加了 Zll、Z34的根干重，與對(duì)照組相比，經(jīng) AMF處理的番茄植株根干重提高1. 28倍一9倍，其中Z33提高9倍，受到AMF的影響最為明 顯。
[0072] 以上結(jié)果說(shuō)明叢枝真菌Rhizophagus irregularis 0)_1可以與不同的番爺品種 都能形成良好的共生關(guān)系，且顯著促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)和發(fā)育，具有良好的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)有技 術(shù)中，接種叢枝菌根真菌促生效果最好的為番爺品種中雜9接種G. intraradices后，同對(duì) 照相比植株生物量提高45. 1% (賀忠群，李煥秀，湯浩茹.不同AMF對(duì)番茄養(yǎng)分吸收及果 實(shí)品質(zhì)的影響[J].北方園藝，2010(9) :8-10.)，而本試驗(yàn)中接種AMF后，所測(cè)試番茄品種地 上部分干重提高了 1. 33倍一2. 22倍，可見(jiàn)顯著優(yōu)于前人分離的叢枝菌根真菌對(duì)番茄的促 生效果。
[0073] 實(shí)施例4 :叢枝菌根真菌對(duì)八種玉米自交系生長(zhǎng)發(fā)育的影響
[0074] 為了測(cè)定叢枝菌根真菌Rhizophagus irregularis 0)_1對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影 響，我們以8種不同玉米自交系品種為材料，通過(guò)盆栽試驗(yàn)接種Rhizophagus irregularis ⑶-1，研究不同玉米品種與AMF的共生效率，以及AMF對(duì)玉米自交系的促生作用。
[0075] 培養(yǎng)基質(zhì)為育苗基質(zhì)與土以1 :1比例混合后，121°C高壓蒸汽滅菌30min，自然冷 卻至室溫時(shí)，裝入體積為1000cm3的缽子中，在缽子的3/4處接種含1000個(gè)孢子的AMF菌 齊U，之后用育苗基質(zhì)填滿缽子。同時(shí)以育苗基質(zhì)中接種等量水為對(duì)照。
[0076] 玉米種子用70%酒精浸泡1分鐘后用蒸餾水洗凈，28°C催芽。將催芽的番茄種子 種于缽子中，每個(gè)缽子5粒種子，最后每個(gè)缽子留3棵長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米，每個(gè)處理重復(fù)9次。 對(duì)照與處理放于不同的位置。植株于日光溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，3天澆一次水。
[0077] 玉米種植2個(gè)月后用常規(guī)方法測(cè)定番茄的株高、葉柄數(shù)、地上部鮮重、地上部干 重、地下部鮮重、地下部干重等。玉米根系剪成約lcm根段，用臺(tái)盼藍(lán)染色后隨機(jī)選取50段 根段，在光學(xué)顯微鏡下測(cè)定叢枝菌根真菌的侵染率。
[0078] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rhizophagus irregularis 0)_1可侵染八種玉米自交系，根系菌根侵染 率各不相同（如表1)。
[0079] 表1 AMF對(duì)不同玉米自交系的侵染率
[0080]

【權(quán)利要求】
1. 一種叢枝菌根真菌，其保藏號(hào)為CCTCC N0:M2014532。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌，其特征在于：其核糖體28S rDNA的特異序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
3. -種菌劑，其特征在于含有權(quán)利要求1所述叢枝菌根真菌。
4. 權(quán)利要求3所述菌劑在番茄和玉米上促生中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求3所述菌劑在玉米抗病中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104450536SQ201410637970
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】丁新華, 儲(chǔ)昭輝, 張霞 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)