一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒。本發(fā)明試劑盒中至少包括SCYLV-P0/F3和SCYLV-P0/R2簡并引物對，試劑盒內(nèi)還有RT反應液、PCR反應液、限制性內(nèi)切酶及其緩沖液、陽性對照RNA模板、陰性對照RNA模板、不含核酸酶的無菌水。本發(fā)明的引物具有特異性，限制性內(nèi)切酶條帶長度多態(tài)性具有唯一性，為甘蔗黃葉病毒檢測和鑒定提供了一種簡便、快速、準確的方法。采用本發(fā)明試劑盒提供的試劑，待檢測的感病植株總RNA樣品經(jīng)過RT-PCR擴增， Bam HI、 Bsa I、 Pvu II和 Kpn I四種限制性內(nèi)切酶酶切反應，4%的低熔點瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，根據(jù)限制性內(nèi)切酶條帶長度多態(tài)性可判定是否感染甘蔗黃葉病毒及其基因型類型。
【專利說明】一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測植物病毒的試劑盒，具體涉及一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒 基因型的試劑盒，屬于植物病毒檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 甘鹿黃葉病毒/ea/ Firw1S, SCYLV)屬于黃癥病毒科 (Zwieoririi/ae)馬鈴薯卷葉病毒屬OcWerorirw 1S)成員，由蛋白質(zhì)外殼及其包裹著的一條 單鏈、正義的RNA (ssRNA)構成，在植株體內(nèi)主要分布于韌皮部組織篩管伴胞細胞質(zhì)中，是 引起甘蔗黃葉病（Yellow leaf)的病原。甘蔗黃葉病最早于1989年在美國夏威夷發(fā)現(xiàn)，該 病害引起甘蔗產(chǎn)量和含糖量下降，是一種嚴重危害甘蔗生產(chǎn)的全球性病毒病害。近年來，甘 蔗黃葉病在中國主要蔗區(qū)普遍發(fā)生，且有逐年加重的趨勢，對甘蔗糖業(yè)發(fā)展構成潛在威脅。
[0003] 目前SCYLV報道的至少有10種基因型（Lin等，2014):巴西基因型（BRA)、古巴基 因型（CUB)、秘魯基因型（PER)、法國R6union島基因型（REU)、夏威夷基因型（HAW)、哥倫比 亞型（C0L)、印度基因型（IND)和中國基因型（CHN1、CHN2、CHN3)。因為BRA與PER、HAW與 PER分別具有高度的序列一致性，因此有的學者將他們稱為BRA-PER和HAW-PER基因型。在 中國，SCYLV 至少存在 7 種基因型，S卩 BRA、HAW、PER、CUB、CHN1、CHN2 和 CHN3 (Xu 等，2010 ; Wang 等，2012 ;Lin 等，2014)。SCYLV 基因組含有 6 個開放閱讀框（Open reading frame), 其中0RR)開放閱讀框編碼的PO蛋白具有抑制RNA沉默的活性，與病毒的致病性有關，而且 PO基因存在遺傳多樣性，是理想的檢測和區(qū)分不同基因型的靶標序列。
[0004] 甘蔗黃葉病的癥狀特征為甘蔗葉片中脈下表皮黃化，接著葉尖開始干枯壞死。該 病的診斷可以初步通過葉片的病害癥狀特征來識別，但是，癥狀表現(xiàn)與甘蔗品系、生長條 件、溫度和病毒株系有關，而且病害癥狀表現(xiàn)需一定的潛伏期，生長早中期沒有癥狀，有些 感病植株沒有表現(xiàn)出明顯的癥狀，這給甘蔗黃葉病田間診斷帶來困難。甘蔗黃葉病病原鑒 定和檢測的技術有電鏡診斷、組織印跡雜交免疫測定（TBIA)、酶聯(lián)免疫測定技術（ELISA)、 常規(guī)RT-PCR和實時熒光RT-PCR法等。但是上述的血清學檢測方法能夠判定是否感染 SCYLV，但是難于區(qū)分出SCYLV具體的基因型。RT-PCR分子檢測方法需要將PCR產(chǎn)物回收、 轉化到大腸桿菌DH5 α，然后通過測序和序列分析，實驗步驟較為繁瑣、耗費時間較長。根據(jù) 本發(fā)明試劑盒提供的試劑，待檢測的感病植株總RNA樣品經(jīng)過RT-PCR擴增、用及? HI I、A^ II和幻μ I限制性內(nèi)切酶酶切反應，用4%的低熔點瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物， 根據(jù)限制性內(nèi)切酶條帶長度多態(tài)性可判定是否感染甘蔗黃葉病毒及其基因型類型。本發(fā)明 的引物具有特異性，限制性內(nèi)切酶條帶長度多態(tài)性具有唯一性，為甘蔗黃葉病毒檢測和鑒 定提供了一種簡便、快速、準確的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下方法實現(xiàn)： 本發(fā)明的一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒，其特征在于試劑盒中至少包 括簡并引物對SCYLV-P0/F3和SCYLV-P0/R2,其序列如下： SCYLV-P0/F3 :5 ' -TGGACCMAGCCTCTGRYT-3 '，其中，M=A 或 M=C, R=A 或 R=G, Y=C 或 Y=T ; SCYLV-P0/R2 :5' - CAATCGWACACAGGATGC-3'，其中，W=A 或 W=T。
[0007] 本發(fā)明的一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒，由下列試劑組成： (1) RT反應液：每個反轉錄反應液包括5 X RT緩沖液2.0 μ UAMV反轉錄酶液0.5 μ L、 10 μ mol/L SCYLV-P0/R2 引物 2. 5 μ L，共 5. 0 μ?，50 個反應體系共計 250 μ?，-20 °C保 存?zhèn)溆茫?(2) PCR反應液：每個PCR反應液包括10XPCR緩沖液5.0 μ?、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 KL，以及濃度為 10 Mmol/L 的簡并引物 SCYLV-P0/F3 和 SCYLV-P0/R2 各 2. 0 μ?，共 11.0 μ?， 50個反應體系共計550 μ?，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(3) 限制性內(nèi)切酶緩沖液：每個酶切反應液包括IOX酶切緩沖液4. 0 μ?，50個反應體 系共計200 μ?，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(4) Ex Taq酶：每個PCR反應體系包括5 U/μ? Ex Taq酶0.25 μ?，50個反應體系共計 12. 5 μ?，-20 °C 保存?zhèn)溆茫?(5) fe? HI內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 U/^L HI內(nèi)切酶I. 0 μ?， 50個反應體系共計50 μ?，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(6) fca I內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 υ/μ? fca I內(nèi)切酶I. 0 μ?，50 個反應體系共計50 μ?，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(7II內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 υ/μ? II內(nèi)切酶I. 0 μ?， 50個反應體系共計50 μ?，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(8) 幻7/7 I內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 υ/μ?幻7/7 I內(nèi)切酶I. 0 μ?，50 個反應體系共計50 μ?，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(9) 陽性樣品RNA :采用T7 RNA聚合酶體外轉錄合成含有不同SCYLV基因型靶片段的 RNA作為標準樣品，I X IOltl拷貝/>L，50 μ?7瓶，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(10) 陰性樣品RNA :采用無甘蔗黃葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性 對照，100 ng/^L，50 μ?7 瓶，-20 °C保存?zhèn)溆茫?(11) 無核酸酶無菌水：2XlO mL/瓶。 本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明的優(yōu)點是通過限制性內(nèi)酶將RT-PCR產(chǎn)物酶切，然后電泳檢測限 制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性，就可以快速鑒定出甘蔗黃葉病毒不同的基因型，這種鑒定方 法克服常規(guī)分子檢測和鑒定方法的不足之處，省略了常規(guī)分子檢測方法中PCR產(chǎn)物回收直 至測序和序列分析的步驟，大大縮短了 RT-PCR的檢測時間，并且降低檢測成本，更符合實 際的需求，應用前景廣闊。本發(fā)明的引物具有特異性，限制性內(nèi)切酶條帶長度多態(tài)性具有唯 一性，為甘蔗黃葉病毒檢測和鑒定提供了一種簡便、快速、準確的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1是甘蔗黃葉病毒不同基因型的RT-PCR產(chǎn)物酶切電泳檢測圖，其中，1為DL 100 bp DNA標準相對分子質(zhì)量，2為BRA基因型，3為PER基因型，4為HAW基因型，5和6為CHN3 基因型，7為CHNl基因型。

【具體實施方式】
[0009] 為了進一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結合實施例加以說明。下述實施 例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所述試劑和生物材料如無特殊說明均可 從商業(yè)途徑獲得。
[0010] 1、甘蔗葉片總RNA提取 1)從我國各省（區(qū)）的蔗區(qū)收集了 332份田間甘蔗葉片樣品，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0011] 2)稱取0. I g甘蔗葉片，并用液氮研磨成粉末。
[0012] 3)向I. 5 mL離心管中加入粉末，在液氮剛揮發(fā)完時立即加入I mL TRIZOL試劑， 蓋上管蓋，震蕩混勻，于4 °C、12000 rpm離心10 min。
[0013] 4)吸取上清液至另一新的離心管中，加入0.2 mL氯仿，蓋住管蓋，振蕩混勻，室溫 靜置 3 min 后，于 4 °C、12000 rpm 離心 15 min。
[0014] 5)吸取上清液至另一新的離心管中，加入0. 5 mL預冷的異丙醇（_20°C)，顛倒混 勻，室溫靜置10 min后，于4 °C、12000 rpm離心15 min (離心管開口保持朝離心機轉軸方 向放置)。
[0015] 6)倒出離心管中上清液，加入I mL體積比為75%的預冷乙醇（_20°C )洗滌，顛倒 離心管2?3次，7500 rpm離心5 min (離心管開口保持朝離心機轉軸方向放置)。重復洗 滌沉淀1次。
[0016] 7)倒出離心管中上清液，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不 要碰到有沉淀的一面，室溫干燥10?15 min。
[0017] 8)加入50 μ L無核酸酶無菌水，混勻，溶解管壁上的RNA，2 000 g離心5 s，冰上 保存?zhèn)溆?。提取的RNA應在2 h內(nèi)進行RT-PCR擴增；若需長期保存，應放置-80 °C冰箱。
[0018] 9)在核酸蛋白分析儀上測定RNA的光吸收值，計算提取的RNA濃度。
[0019] 2、簡并引物設計 本發(fā)明的擴增引物應用相關的引物設計軟件對根據(jù)甘蔗黃葉病毒基因組5'端序列設 計，再從獲得的幾十對引物中選擇評分較高的引物對，再將設計好的引物序列發(fā)送至生工 生物工程（上海）股份有限公司進行合成得到。最終確定簡并引物序列SCYLV-P0/F3和 SCYLV-P0/R2,擴增的目的核酸帶大小為968 bp，簡并引物序列如下： SCYLV-P0/F3 :5 ' -TGGACCMAGCCTCTGRYT-3 '，其中，M=A 或 M=C, R=A 或 R=G, Y=C 或 Y=T ; SCYLV-P0/R2 :5' - CAATCGWACACAGGATGC-3'，其中，W=A 或 W=T。
[0020] 3、RT-PCR 擴增 應用本試劑盒提供的RT反應液進行反轉錄反應，在PCR管中加入以下試劑：

【權利要求】
1. 一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒，其特征在于試劑盒中至少包括簡并 引物對 SCYLV-P0/F3 和 SCYLV-P0/R2，SCYLV-P0/F3 的序列為 5'-TGGACCMAGCCTCTGRYT-3'， 其中，M=A 或 M=C, R=A 或 R=G, Y=C 或 Y=T ;SCYLV-P0/R2 的序列為 5' -CAATCGWACACAGGATGC-3'，其中，W=A 或 W=T。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種檢測和鑒定甘蔗黃葉病毒基因型的試劑盒，其特征在于 該試劑盒由下列試劑組成： (I) RT反應液：每個反轉錄反應液包括5XRT緩沖液2.0 ii UAMV反轉錄酶液0.5 yL、 10 iimol/L SCYLV-P0/R2 引物 2.5 iiL，共 5.0 ML，50 個反應體系共計 250 ML，-20 °C保 存?zhèn)溆茫? (2妒0?反應液：每個？0?反應液包括10\?0?緩沖液5.0虬、2.5臟〇1/1(1階1 38 4.0 ML，以及濃度為 10 Mmol/L 的簡并引物 SCYLV-P0/F3 和 SCYLV-P0/R2 各 2. 0 ML，共 11.0 ML， 50個反應體系共計550 ML，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (3)限制性內(nèi)切酶緩沖液：每個酶切反應液包括IOX酶切緩沖液4. 0 ML，50個反應體 系共計200 ML，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (4) Ex Taq酶：每個PCR反應體系包括5 U/ML Ex Taq酶0.25 ML，50個反應體系共計 12. 5 ML，-20 °C 保存?zhèn)溆茫? (5) fe? HI內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 U/ML HI內(nèi)切酶1. 0 ML， 50個反應體系共計50 ML，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (6) fcal內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 U/ML fcal內(nèi)切酶I. 0 ML，50個 反應體系共計50 ML，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (7II內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 U/ML II內(nèi)切酶1. 0 ML， 50個反應體系共計50 ML，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (8) 幻7/7 I內(nèi)切酶：每個限制性內(nèi)切酶反應體系包括10 U/ML幻7/7 I內(nèi)切酶1. 0 ML，50 個反應體系共計50 ML，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (9) 陽性樣品RNA :采用17 RNA聚合酶體外轉錄合成含有不同SCYLV基因型靶片段的 RNA作為標準樣品，I X IOltl拷貝/ML，50 ML/瓶，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (10)陰性樣品RNA :采用無甘蔗黃葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性 對照，100 ng/ML，50 ML/瓶，-20 °C保存?zhèn)溆茫? (II) 無核酸酶無菌水：2XlO mL/瓶。
【文檔編號】C12Q1/70GK104313188SQ201410639123
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權日:2014年11月13日
【發(fā)明者】高三基, 林藝華, 陳建生, 趙春慧, 吳小斌, 傅華英, 陳如凱, 劉營航 申請人:福建農(nóng)林大學