一種殼聚糖酶及應(yīng)用該聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種殼聚糖酶及應(yīng)用該聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法。將分離自韓國(guó)慶南南海岸一帶土壤的、能夠制造出高聚合度殼寡糖的芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)AMI09接種到LB培養(yǎng)液內(nèi)，然后通過(guò)振蕩培養(yǎng)得到接種用培養(yǎng)液，對(duì)大量培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離得到上清液，濃縮所述上清液后進(jìn)行洗滌，實(shí)施離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析處理，最后用去離子水透析，由此制造出殼聚糖酶。由本發(fā)明的菌株制成的耐熱性殼聚糖酶，在60℃的反應(yīng)條件下也可以穩(wěn)定地制造出6糖含量高的高聚合度殼寡糖。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種殼聚糖酶及應(yīng)用該聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖酶及應(yīng)用該聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚醣是由D-氨基葡萄糖通過(guò)β_1，4鍵連接而成的多糖類(lèi)，一般通過(guò)甲殼素 (chitin)脫去乙酰基的方法來(lái)制成。這種殼聚糖作為分子量達(dá)到數(shù)十萬(wàn)道爾頓的高分子物 質(zhì)可應(yīng)用于各種生產(chǎn)領(lǐng)域，但由于存在粘性高、不溶于中性或堿性水的問(wèn)題而限制了其在 生產(chǎn)上的應(yīng)用。為了解決該技術(shù)難題，人們嘗試了通過(guò)分解殼聚醣來(lái)制造水溶性殼寡糖的 方法。通過(guò)嘗試得知當(dāng)所制成的殼寡糖具有6糖以上聚合度時(shí)，其具有較大的增強(qiáng)人體免 疫性、抗腫瘤以及抗菌作用等，因此制造高聚合度殼寡糖成為現(xiàn)今該領(lǐng)域的研究趨勢(shì)。
[0003] 作為通過(guò)分解殼聚醣來(lái)生產(chǎn)水溶性殼寡糖的制造方法，已知的有酸分解法和酶分 解法。雖然采用酸分解法的殼寡糖的制造方法比較簡(jiǎn)單，但經(jīng)過(guò)殼聚糖分解而制造出來(lái)的 殼寡糖中含有大量的單糖和二糖等超低分子，而這些超低分子的殼寡糖在增強(qiáng)人體免疫 性、抗腫瘤和抗菌作用等方面較弱。相反，對(duì)于利用酶分解法而制造出來(lái)的殼寡糖的制造方 法，雖然其具有根據(jù)所使用的酶可獲得具有各種聚合度的殼寡糖的優(yōu)點(diǎn)，但在酶分解法中 作為核心部分的分解酶并沒(méi)有得到充分開(kāi)發(fā)，因此必須對(duì)高活性酶進(jìn)行探索性研究。
[0004] 作為分解殼聚糖的酶已知的有殼聚糖酶（Chitosanase)，其大多主要發(fā)現(xiàn)于芽孢 桿菌屬（Bacillus sp.)細(xì)菌內(nèi)。比如韓國(guó)10-0227040號(hào)專(zhuān)利涉及的芽孢桿菌屬GM44、韓 國(guó)10-0396833號(hào)專(zhuān)利涉及的芽孢桿菌屬HSB-21、韓國(guó)10-0541044號(hào)專(zhuān)利涉及的蘇云金芽 孢桿菌（Bacillus thuringiensis)、日本公開(kāi)專(zhuān)利公報(bào)昭61-280277號(hào)所涉及的芽孢桿菌 屬7-M、日本特開(kāi)公報(bào)昭63-94971所涉及的環(huán)狀芽胞桿菌（Bacilluscirculans)LCC-U日 本特開(kāi)公報(bào)平2-79972號(hào)所涉及的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)BN-262等。利用上 述微生物制造殼聚糖酶時(shí)，其酶活性為I. 0?5. 4U/mL，比較低，因此限制了其在生產(chǎn)上的 應(yīng)用。另外，利用由上述方法制造出來(lái)的殼聚糖酶時(shí)，在殼聚糖的分解物中2糖或3糖含量 為13?40%，比較高，相反，分解物中5糖和6糖以上的殼寡糖含量?jī)H為20%以下。而且， 目前在所開(kāi)發(fā)的、用于殼寡糖生產(chǎn)的酶中，大部分殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性較低，只能在50°C以 下的較低溫度下才能保持穩(wěn)定，因此在與高聚合度殼聚糖酶的反應(yīng)條件方面受到了限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種熱穩(wěn)定性高、能夠?qū)?聚糖分解成高度聚合糖的殼聚糖酶
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種殼聚糖酶，該聚糖酶分離自土壤芽孢桿菌屬 AMI09菌株。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種應(yīng)用上述方案中聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，所述 聚糖酶為上述方案中所述的聚糖酶，包括如下步驟：
[0008] SI :從土壤試料中分離芽孢桿菌屬AMI09菌株；
[0009] S2 :培養(yǎng)芽孢桿菌屬的AMI09菌株；
[0010] S3 :從培養(yǎng)液中分離殼聚糖酶；
[0011] S4 :制備殼寡糖的干燥粉末。
[0012] 上述方案中優(yōu)選的是，所述步驟Sl中包括如下步驟：
[0013] al:用滅菌蒸餾水稀釋取自韓國(guó)慶南南海岸一帶的土壤試料；
[0014] a2:將步驟al中的土壤稀釋液涂抹在MS瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；
[0015] a3:將步驟a2中培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行純化；
[0016] a4:測(cè)定各菌落的殼聚糖酶活性、分離得到符合條件的殼聚糖酶的AMI09菌株。
[0017] 上述任一方案中優(yōu)選的是，，所述a2步驟中MS瓊脂培養(yǎng)基為含有0. 5%殼聚糖、 0· 5%酵母提取物、0· 2% Κ2ΗΡ04、0· 1% Κ2ΗΡ04、0· 07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、 0· 01% CaCl2的培養(yǎng)基。
[0018] 上述任一方案中優(yōu)選的是，所述a2步驟中MS瓊脂培養(yǎng)基為含有0. 5%殼聚糖、 0· 5%酵母提取物、0· 2% Κ2ΗΡ04、0· 1% Κ2ΗΡ04、0· 07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、 0· 01% CaCl2的培養(yǎng)基。
[0019] 上述任一方案中優(yōu)選的是，所述步驟S2中包括如下步驟：
[0020] bl:利用LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)所述Sl步驟得到的芽孢桿菌屬AMI09菌株；
[0021] b2:將芽孢桿菌屬AMI09菌株接種到LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；
[0022] b3:種子培養(yǎng)液接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行主培養(yǎng)，形成主培養(yǎng)液。
[0023] 上述任一方案中優(yōu)選的是,所述LB瓊脂培養(yǎng)基含有I. 0%細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白 胨、0. 5 %細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物和I. 0% NaCl，PH值為7. 0。
[0024] 上述任一方案中優(yōu)選的是，所述步驟S3中包括如下步驟：
[0025] Cl :取所述主培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行濃縮、洗滌得到初步溶液；
[0026] c2 :離子交換層處理cl步驟中的初步溶液，得到殼聚糖酶；
[0027] c3 :凝膠過(guò)濾層析處理；
[0028] c4 :離子水透析、冷凍干燥。
[0029] 上述任一方案中優(yōu)選的是，采用分子量為cut-off :10000道爾頓的超濾器對(duì)主培 養(yǎng)液進(jìn)行濃縮，采用PH值為5. 0的乙酸鈉緩沖溶液進(jìn)行洗滌。
[0030] 上述任一方案中優(yōu)選的是，所述步驟S3中包括如下步驟：
[0031] dl :將步驟S3中的殼聚糖酶粉末溶解于含有殼聚糖的基質(zhì)水溶液，形成酶反應(yīng) 液；
[0032] d2 :第一次過(guò)濾酶反應(yīng)液，濃縮酶反應(yīng)液；
[0033] d3 :第二次過(guò)濾酶反應(yīng)液，對(duì)酶反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥。
[0034] 本發(fā)明的有益效果為：由本發(fā)明提供的聚糖酶殼聚糖酶具有較高的耐熱性，在 60°C的反應(yīng)條件下也可以穩(wěn)定地制造出6糖含量高的高聚合度殼寡糖，且應(yīng)用該殼聚糖酶 生產(chǎn)的殼寡糖具有較高含量的高聚合度殼寡糖。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 為了更好地理解按照本發(fā)明方案的一種殼聚糖酶及應(yīng)用該聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的 方法，下面對(duì)本發(fā)明的魷魚(yú)魚(yú)塊分級(jí)裝置的一優(yōu)選實(shí)施例作進(jìn)一步闡述說(shuō)明。
[0036] 為了利用酶法生產(chǎn)出6糖以上寡糖含量較高的殼寡糖，本發(fā)明的
【發(fā)明者】經(jīng)過(guò)努力 研究發(fā)現(xiàn)，從韓國(guó)慶南南海岸一帶的土壤分離出的芽孢桿菌屬AMI09菌株內(nèi)存在耐熱性殼 聚糖酶，利用該耐熱性殼聚糖酶在高溫最適反應(yīng)條件下能夠高產(chǎn)6糖含量高的殼寡糖，從 而完成本發(fā)明。由此，本發(fā)明的目的在于，提供一種利用分離自芽孢桿菌屬AMI09菌株的耐 熱性殼聚糖酶生產(chǎn)出6糖含量高的高聚合度殼寡糖的制造方法。
[0037] 從土壤試料中分離芽孢桿菌屬AMI09菌株。為了分離出可生產(chǎn)高聚合度殼寡糖 的菌株，將取自韓國(guó)慶南南海岸一帶的土壤試料用滅菌蒸餾水稀釋?zhuān)缓髮⑵渫磕ㄔ贛S瓊 脂培養(yǎng)基（〇.5%殼聚糖、0.5%酵母提取物、0.2%1( 2冊(cè)04、0.1%1(2冊(cè)04、0.07%]\^0 47!120、 0. 05% NaCl、0. 05% KC1、0. 01% CaCl2)上。經(jīng)1?2日后，對(duì)所得到的菌落進(jìn)行分離純化 后，測(cè)定各菌落的殼聚糖酶活性并分析殼聚糖分解產(chǎn)物殼寡糖的組成情況，由此選出可得 到殼聚糖酶活性高、聚合度高的寡糖的菌株。對(duì)所選出的菌株進(jìn)行16S rDNA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 上述菌株屬于新芽孢桿菌屬（Bacillus)，因此被命名為芽孢桿菌屬（Bacillus sp. )AMI09。
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)一步闡述。從取自韓國(guó)慶南南海岸一帶的每 個(gè)土壤試料中，各取約lg，用滅菌蒸餾水IOml制成懸浮液后稀釋?zhuān)?. ImL的稀釋液涂 抹在15瓊脂培養(yǎng)基（0.5%殼聚糖、0.5%酵母提取物、0.2%1(2即04、0.1%腿 2?04、0.07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、0. 01% CaCl2、2% Agar、pH6. 8)上后，在 30°C溫度下靜 置培養(yǎng)一個(gè)星期，然后通過(guò)常用方法分離純化出300多種菌株。將這些分離純化的菌株接 種到5mLMS培養(yǎng)液中，并在溫度30°C、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)5日后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分 離，回收上清液。接著，對(duì)上清液的殼聚糖酶活性以及由此而生成的殼聚糖分解產(chǎn)物進(jìn)行分 析。殼聚糖酶的活力通過(guò)3, 5-二硝基水楊酸法、即定量測(cè)定生成自殼聚糖溶液的還原糖的 方法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。朝向溶解于IOmM乙酸鈉緩沖溶液（PH5. 0)的1 %殼聚糖溶液0. 3mL中添 加酶液〇. 3mL后，在50°C溫度下使其反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，添加 ION NaOH 0. 02mL進(jìn) 行攪拌，12000rpm條件下進(jìn)行5分鐘的離心分離，由此分離出殘留基質(zhì)與反應(yīng)上清液。此 時(shí)，將所得到的上清液〇.3mL添加到ImL DNS溶液中，并在沸水中加熱5分鐘。加熱結(jié)束后 使其充分冷卻，然后測(cè)定其在550nm下的吸光度，并根據(jù)用D-氨基葡萄糖檢測(cè)而得到的標(biāo) 準(zhǔn)曲線，定量測(cè)定出還原糖量。殼聚糖酶的活力單位（U)被定義為，在特定條件下，一分鐘 內(nèi)生成Iumole的D-氨基葡萄糖的酶量。通過(guò)與上述相同的方法，從300多種分離純化的菌 株中最終選出了殼聚糖酶活性高、且生產(chǎn)出高聚合度殼寡糖的菌株。將最終選出的菌株放 至Ij 5mL的MS培養(yǎng)液內(nèi)，在溫度30°C、180rpm條件下，振蕩培養(yǎng)3天后，采用Sambrook等方法 提取染色體遺傳基因。為了進(jìn)行種類(lèi)分析，將以上述提取的染色體遺傳基因?yàn)橹饕N型，利 用16s rDNA分析用通用引物27F和1492R實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)。PCR產(chǎn)物pBluescript II SK(+) (Stratagene，USA)的EcoRV限制性內(nèi)切位點(diǎn)實(shí)施亞克隆后測(cè)序。對(duì)于每個(gè)分離菌株 的16s rDNA堿基序列，通過(guò)NCBI的BLASTn程序進(jìn)行分析。每個(gè)分離菌株與解淀粉芽孢桿 菌具有99. 9%的相同性而極其相似，因此將其命名為芽孢桿菌屬AMI09 (Bacillus sp. AMI 09)。下表為分離自土壤的芽孢桿菌屬AMI09菌株與其他芽孢桿菌屬之間的對(duì)比。
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種殼聚糖酶，其特征在于，該聚糖酶分離自土壤芽孢桿菌屬AMI09菌株。
2. -種應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述聚糖酶為權(quán)利要求1所述的 聚糖酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，包括如下步驟： 51 :從土壤試料中分離芽孢桿菌屬AMI09菌株； 52 :培養(yǎng)芽孢桿菌屬的AMI09菌株； 53 :從培養(yǎng)液中分離殼聚糖酶； 54 :制備殼寡糖的干燥粉末。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述步驟S1中包 括如下步驟： al:用滅菌蒸餾水稀釋取自韓國(guó)慶南南海岸一帶的土壤試料； a2:將步驟al中的土壤稀釋液涂抹在MS瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)； a3:將步驟a2中培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行純化； a4:測(cè)定各菌落的殼聚糖酶活性、分離得到符合條件的殼聚糖酶的AMI09菌株。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述a2步驟中 13瓊脂培養(yǎng)基為含有0.5%殼聚糖、0.5%酵母提取物、0.2%1(2即04、0.1%1( 2即04、0.07% MgS047H20、0. 05% NaCl、0. 05% KC1、0. 01% CaC 12 的培養(yǎng)基。
6. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述步驟S2中包 括如下步驟： bl:利用LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)所述S1步驟得到的芽孢桿菌屬AMI09菌株； b2:將芽孢桿菌屬AMI09菌株接種到LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液； b3:種子培養(yǎng)液接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行主培養(yǎng)，形成主培養(yǎng)液。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述LB瓊脂培養(yǎng) 基含有1. 0%細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨、0. 5%細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物和1. 0% NaCl，PH 值為7.0。
8. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述步驟S3中包 括如下步驟： cl :取所述主培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行濃縮、洗滌得到初步溶液； c2 :離子交換層處理cl步驟中的初步溶液，得到殼聚糖酶； c3 :凝膠過(guò)濾層析處理； c4 :離子水透析、冷凍干燥。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，采用分子量為 cut-off :10000道爾頓的超濾器對(duì)主培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮，采用PH值為5. 0的乙酸鈉緩沖溶液 進(jìn)行洗漆。
10. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述步驟S3中包 括如下步驟： dl :將步驟S3中的殼聚糖酶粉末溶解于含有殼聚糖的基質(zhì)水溶液，形成酶反應(yīng)液； d2 :第一次過(guò)濾酶反應(yīng)液，濃縮酶反應(yīng)液； d3 :第二次過(guò)濾酶反應(yīng)液，對(duì)酶反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK104371989SQ201410643961
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】李煒, 樸哲 申請(qǐng)人:中泰和（北京）科技發(fā)展有限公司, 艾美科健生物科技株式會(huì)社