一種雞腸道上皮γδT細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮γδT細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明首先采用物理研磨配合化學(xué)酶法離散雞腸道上皮細(xì)胞，提高了腸道細(xì)胞離散程度，縮短了細(xì)胞處理時間，保證了細(xì)胞的高活性；最佳密度細(xì)胞分離液的使用，保證了腸道上皮淋巴細(xì)胞的純化；磁珠二抗分選法的使用，確保了目標(biāo)細(xì)胞較高的純凈度；并經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明分離培養(yǎng)所得的目標(biāo)細(xì)胞純度高達(dá)90％。本發(fā)明解決了分離培養(yǎng)雞腸道上皮γδT細(xì)胞過程中種種弊端，從而為雞腸道上皮γδT細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)和免疫學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】-種雞腸道上皮Y 6 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] Y 5 T細(xì)胞是近20年人們新認(rèn)識的1種T細(xì)胞亞群，其在機(jī)體出現(xiàn)異常變化時 做出的反應(yīng)比a目T細(xì)胞更為迅速。與人和其他哺乳動物外周血中只有很少比例（3%? 5%)，Y S T細(xì)胞不同，家禽外周血中Y S T細(xì)胞占到約50%左右。在受到病原體入侵時，家 禽黏膜上皮和外周血中的Y 5T細(xì)胞在機(jī)體初期防御中發(fā)揮重要作用。但是長期W來雞腸 道上皮Y 5T細(xì)胞的分離培養(yǎng)一直較為困難。傳統(tǒng)研究多集中于體外擴(kuò)增淋己細(xì)胞并選擇 性計數(shù)Y 5 T細(xì)胞（董思源.Y 5 T細(xì)胞體外擴(kuò)增，i-IELs分離和免疫英光技術(shù)的建立.天 津：南開大學(xué)，2011)，該種方法并未將Y 5T細(xì)胞與其他淋己細(xì)胞分離開。由于Y 5T細(xì) 胞的增殖受到多種淋己細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響，而且體外擴(kuò)增過程已將Y 5T細(xì)胞活 化，故傳統(tǒng)方法并不能完全獨立研究其靜息態(tài)下的生物、免疫活性及其激活機(jī)制。利用分離 自21?35日齡肉仔雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)試驗，與之相比，具有明顯的 優(yōu)點。該方法分離出的腸道上皮Y 5 T細(xì)胞，不受機(jī)體腸道其他淋己細(xì)胞的影響，不受腸道 食糜中某些活性成分的刺激，并能保持較靜息態(tài)和一定程度的特異性和免疫性，本方法的 建立有利于肉仔雞腸道中該細(xì)胞進(jìn)一步研究。因此，雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞分離培養(yǎng)方法 的建立，為研究雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)奠定了基礎(chǔ)。
[0003] 雞腸道上皮細(xì)胞的離散是本方法的重要環(huán)節(jié)。常用方法為剪碎腸道壁后，消化酶 消化，但消化酶價格昂貴，然其種類和用量均難確定，處理時間也難W把握。該為腸道上皮 淋己細(xì)胞的分離帶來了很大的困難。
[0004] 雞腸道上皮淋己細(xì)胞的分離是本方法的又一重要環(huán)節(jié)。由于淋己細(xì)胞分離液密度 不合適，往往造成分離細(xì)胞純度不高，腸道上皮細(xì)胞大量混雜其中。進(jìn)而大大浪費了下一步 操作中抗體和磁珠的用量，增加操作成本。
[0005] 此外，對雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞研究，常用方法為混合淋己細(xì)胞培養(yǎng)，給予目標(biāo)刺 激后，研究其增殖情況及生物免疫活性。但Y 5T細(xì)胞增殖活化與其他淋己細(xì)胞分泌的細(xì) 胞因子及其接觸的腸道上皮細(xì)胞都有密切關(guān)系?；旌吓囵B(yǎng)，并不能清晰反映目標(biāo)刺激對 Y 5 T細(xì)胞的直接作用，為Y 5 T細(xì)胞研究帶來較大問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞的 分離培養(yǎng)方法，降低細(xì)胞分離過程中的污染風(fēng)險和成本，減少因分離時間過長帶來的諸多 弊端，同時，能夠提高目標(biāo)細(xì)胞的純度。
[0007] 本發(fā)明解決的上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
[0008] 1. -種雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括W下步 驟：
[0009] 步驟I ;由經(jīng)過禁食采用靜脈放血處死的試驗雞，無菌手術(shù)取2?3cm腸段置于含 1 %雙抗的PBS中；
[0010] 步驟2 ;制備腸壁組織漿液經(jīng)離也去上清液后，于沉淀中加入0. 05 %膠原酶混合 酶進(jìn)行消化；
[0011] 步驟3 ;向細(xì)胞液加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，離也；去上清，無血清培 養(yǎng)液重息細(xì)胞，離也洗涂細(xì)胞；再次重息細(xì)胞，分別經(jīng)過不同目數(shù)自制細(xì)胞篩過濾細(xì)胞，離 也去上清；
[0012] 步驟4 ;將細(xì)胞重息于密度為1.058g/mL淋己細(xì)胞分離液中；于離也管底部加入 4mL密度為1. 098g/mL淋己細(xì)胞分離液；將細(xì)胞息液鋪于之上，離也；取兩個不同密度的淋 己細(xì)胞分離液界面黃白色細(xì)胞層；
[001引步驟5 ;在濃度為IX IOVmL細(xì)胞息液中，先后加入一定量的TCRl抗體和磁珠，進(jìn) 行磁珠二抗分選，并用PBS適當(dāng)重息稀釋，保證二者與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合；將細(xì)胞息液置于細(xì)胞 分選儀進(jìn)樣口，得到陽性細(xì)胞；
[0014] 步驟6;將細(xì)胞息浮于10%胎牛血清1?^1-1640培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞 數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X lOVmL，于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4她后，測定其細(xì)胞存活情況。
[0015] 2.如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 步驟1中的雙抗為青霉素和鏈霉素，濃度為1% (V/V)。
[0016] 3.如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟 1所述的腸段為空腸中段。
[0017] 4.如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟 2中所述的混合消化酶為膠原酶I和膠原酶IV混合酶制劑其質(zhì)量比為為2:1。
[0018] 5.如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟3中無血清1?^1-1640培養(yǎng)液為1?^1-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中加入（￥/^)0.5%雙抗、1% k谷氨醜胺和1 %輕己基脈嗦己賴酸，pH 7. 2?7. 4。
[0019] 6.如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟4不同密度淋己細(xì)胞分離液，經(jīng)過密度為1. lOlg/mL的淋己細(xì)胞分離液原液與PBS 一定比例配制而得。
[0020] 7.如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟5中的磁珠二抗分選法，具體為先加入一定量TCRl抗體，保證其濃度可達(dá)每IO 7個 細(xì)胞息液中含有20 y L抗體；賠化后，離也去上清；再加入磁珠，使其濃度達(dá)到每IO7個細(xì)胞 息液中含有5 y L磁珠，賠化離也去上清；PBS重息細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分選儀分選。
[0021] 8.如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟1中的禁食時間，24?36h為最佳禁食時間。
[0022] 本發(fā)明的詳細(xì)描述：
[0023] 雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法包括W下步驟：
[0024] 步驟1 ;對21?35日齡肉仔雞禁食24?36h，靜脈放血處死，75%酒精浸泡10? 15min ;0. 1%新潔爾滅浸泡5?lOmin。取出肉仔雞綁定，75%酒精消毒仔雞腹腿部，破開 腹腔；雙抗溶液噴于腹部各器官表面，手術(shù)綴找到空腸中段，取2?3cm腸段于1 %雙抗PBS 溶液中（V/V)。
[00巧]步驟2 ;將溶液移入超凈臺，縱向剪開腸壁，1%雙抗PBS溶液中沖洗，移入無雙抗 PBS溶液沖洗，手術(shù)剪剝離腸壁脂肪和結(jié)締組織，移入無雙抗PBS溶液，手術(shù)剪將腸壁剪為 漿糊狀，玻璃研磨器小也研磨；將組織勻漿液移入離也管，離也；去除上清，加入膠原酶I 和膠原酶IV混合酶制劑佑IBCO公司）（質(zhì)量比為2:1)，37°C，5% C〇2,搖床震蕩15min。
[0026] 步驟3 ;向細(xì)胞液加入無血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液（其中按體積比加入了 0. 5% 雙抗、1 % k谷氨醜胺和1 %輕己基脈嗦己賴酸，抑調(diào)至7. 2?7. 4)終止消化，離也；去上 清，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重息細(xì)胞，離也洗涂細(xì)胞；再次重息細(xì)胞，分別經(jīng)過100目，200 目自制細(xì)胞篩（自制細(xì)胞篩為經(jīng)100目和200目網(wǎng)布緊固于燒杯而成），離也去上清。
[0027] 步驟4 ;將細(xì)胞重息于密度為1.058g/mL淋己細(xì)胞分離液中；在離也管底部加入 4mL密度為1.098g/mL的淋己細(xì)胞分離液（不同密度淋己細(xì)胞分離液，經(jīng)過密度為1. IOlg/ 血淋己細(xì)胞分離液原液訂抓Science公司）與PBS-定比例配制而得）；將細(xì)胞息液鋪于 之上，離也；取兩個不同密度的淋己細(xì)胞分離液界面黃白色細(xì)胞層，無血清RPMI-1640培養(yǎng) 液重息細(xì)胞，離也去上清，洗涂，即為腸道上皮淋己細(xì)胞；顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞，約為1 X IOV 血，細(xì)胞活率95% W上。
[002引 步驟5 ;在濃度為1 X IOVmL細(xì)胞息液中加入鼠抗雞TCRl抗體（Souther Biotech 公司），輕輕混勻，賠化lOmin，離也去上清；PBS重息細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到I XioVu L， 加入磁珠，賠化15min，離也去上清；PBS重息細(xì)胞5 X lOVmL ;將細(xì)胞息液置于細(xì)胞分選儀 (Milteny Biotec GmbH公司，型號：autoMAC巧進(jìn)樣口，得到陽性細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
[0029] 步驟6 ;將細(xì)胞息浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞數(shù) (>95% )，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX lOVmL。之后于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔植入190 UL細(xì)胞息 液，隨后加入刀豆球蛋白ConA(終濃度為5y g/mL)，培養(yǎng)體系為200UL。置5% C02,4(TC 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4她，MIT法染色細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長下測定OD值。
[0030] 本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。與目前常用的混合培養(yǎng) 研究雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞相比，本發(fā)明關(guān)于一種雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法 有較大的創(chuàng)新性和獨特性，建立了成熟的雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，分離得 到了純度高且原始靜息的雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞，減少了分離過程的污染風(fēng)險，縮短了分 離所需的時間，保證了分離過程中細(xì)胞的活力。該方法的建立有利于獨立研究雞腸道上皮 Y 5T細(xì)胞的生物活性和免疫活性。
[0031] 本發(fā)明中的雞腸道上皮淋己細(xì)胞的分離，采用了物理輕微研磨和化學(xué)酶消化相結(jié) 合的方法。物理研磨分離細(xì)胞的弊端在于極易破壞細(xì)胞膜，減弱細(xì)胞活性，但其可縮短分離 時間；化學(xué)處理方法溫和，但酶的種類、濃度W及處理時間難W確定，該樣同樣帶來抑制細(xì) 胞活性的弊端。本發(fā)明先采用物理輕微研磨，即將剪碎的腸道上皮移入玻璃研磨器，輕且慢 研磨兩次，每次時間不超過IOs ;該步驟提高了細(xì)胞分離的效率，損傷細(xì)胞的程度較?。粸?化學(xué)消化奠定了基礎(chǔ)。將物理研磨后的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿中，加入終濃度為0. 05%的膠原酶 I和膠原酶IV混合酶制劑，37C，5% (?,置于搖床震蕩15min，即可看見離散較好的細(xì)胞。 酶消化法較為溫和，不易直接損傷細(xì)胞，加之之前的物理消化方法，可在較短時間內(nèi)得到活 力較好的細(xì)胞。物理研磨加之化學(xué)酶消化，得到了離散較好，活力較好的雞腸道上皮細(xì)胞。
[0032] 密度梯度分離腸道淋己細(xì)胞，利用較為精準(zhǔn)的密度淋己細(xì)胞分離液，得到了純度 較高的淋己細(xì)胞，從而去除了含量較高的腸道上皮細(xì)胞及其它雜細(xì)胞。
[0033] 磁珠二抗淋己細(xì)胞分選儀分選，得到純凈的雞腸道上皮的Y 5T細(xì)胞。先將得到 的腸道上皮淋己細(xì)胞與鼠抗雞TCRl -抗賠化，使TCRl與目標(biāo)細(xì)胞表面的Y 5抗原結(jié)合， 之后加入磁珠賠化，使TCRl與磁珠結(jié)合，經(jīng)由分選儀的磁性分選，得到陽性細(xì)胞，即為目標(biāo) 細(xì)胞Y 5 T細(xì)胞。磁珠二抗分選方法，解決了雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞分離純度差的問題。使 廣大科研工作者可W獨立研究雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞。
[0034] 本發(fā)明的有益效果
[00巧]本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明首先采用物理研 磨配合化學(xué)酶法離散雞腸道上皮細(xì)胞，提高了腸道細(xì)胞離散程度，縮短了細(xì)胞處理時間，保 證了細(xì)胞的高活性；最佳密度細(xì)胞分離液的使用，保證了腸道上皮淋己細(xì)胞的純化；磁珠 二抗分選法的使用，確保了目標(biāo)細(xì)胞較高的純凈度；并經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明分離培養(yǎng) 所得的目標(biāo)細(xì)胞純度高達(dá)90%。本發(fā)明解決了分離培養(yǎng)雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞過程中種種 弊端，從而為雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)和免疫學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1 ;新分離的肉仔雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞圖中顯示分離得到的肉仔雞腸道上皮 Y 5T細(xì)胞（IXioVmL)D
[0037] 圖2 ;培養(yǎng)4她的肉仔雞腸道上皮Y 5T細(xì)胞圖中顯示培養(yǎng)4她后的肉仔雞腸道 上皮Y 5T細(xì)胞巧X107mL)。

【具體實施方式】
[0038] 為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合本發(fā)明的實施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0039] 實施例1
[0040] 本實施例W 30日齡1. 5kg健康白羽肉雞分離培養(yǎng)腸道上皮Y 5 T細(xì)胞。先進(jìn)行 2化的禁食，部污物皮屑，去除腹部及腿部羽毛，浸泡15min ;再于0. 1 %新潔爾滅溶液中浸 泡IOmin;取出肉仔雞，綁定于手術(shù)臺上，75%酒精噴于仔雞腹腿部，破開腹腔；1%雙抗溶 液噴于腹部各器官表面，手術(shù)綴找到空腸中段，取3cm腸段于1 %雙抗PBS溶液中。
[0041] 將溶液移入超凈臺，縱向剪開腸壁，1 %雙抗PBS溶液中測洗H次，移入無雙抗 PBS溶液測洗兩次，手術(shù)剪剝離腸壁脂肪和結(jié)締組織，移入無雙抗PBS溶液，手術(shù)剪將腸壁 剪為漿糊狀，玻璃研磨器小也研磨2次；將組織勻漿液移入15mL離也管，25(K)r/min，離也 IOmin ;去除上清，加入5血0. 05%膠原酶混合酶液，37°C，5% (?,置于搖床震蕩15min。
[0042] 向細(xì)胞液加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，25(K)r/min，離也IOmin ;去上 清，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重息細(xì)胞，離也洗涂細(xì)胞；再次重息細(xì)胞，分別經(jīng)過100目，200 目自制細(xì)胞師，貿(mào)也去上清。
[0043] 將細(xì)胞重息于密度為1. 058g/mL淋己細(xì)胞分離液（配制方法同上）；在15血離也 管底部加入4mL密度為1. 098g/mL的淋己細(xì)胞分離液；將細(xì)胞息液鋪于之上，30(K)r/min， 20min離也；取兩個不同密度的淋己細(xì)胞分離液界面黃白色細(xì)胞層，無血清RPMI-1640培養(yǎng) 液重息細(xì)胞，離也去上清，洗涂H次，即為本發(fā)明所制備的雞腸道上皮Y 5 T細(xì)胞（腸道上 皮淋己細(xì)胞）；顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞，約為IXioVmU活率95% W上。
[0044] 將細(xì)胞息液離也去上清，PBS重息細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到IXioVmU加入鼠抗雞 TCRl -抗，輕輕混勻，保證其濃度可達(dá)每IO7個細(xì)胞息液中含有20 y L抗體，4°C賠化lOmin， 250化/min,離也IOmin去上清；PBS重息細(xì)胞，再加入磁珠，使其濃度達(dá)到每IO7個細(xì)胞息液 中含有5 U L磁珠，4°C賠化15min，2500r/min，離也IOmin去上清；PBS重息細(xì)胞5 X IOVmL ; 將細(xì)胞息液置于細(xì)胞分選儀進(jìn)樣口，得到陽性細(xì)胞。
[0045] 收集細(xì)胞后，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)（>95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX 1〇7個/mL。 之后于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔植入190 y L細(xì)胞息液，隨后加入刀豆球蛋白Con A (終濃度 為5 y g/血)，培養(yǎng)體系為200 y L。置5% C〇2,4(TC二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4她，每孔輕輕吸棄 上清10011^加入100111不含小牛血清的1?^1-1640培養(yǎng)基，同時加入5111肖/1111^11'1'溶液 100 U L，繼續(xù)培養(yǎng)化，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 y L DMSO溶液，靜置10-15min，使紫色結(jié)晶 完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長下測定OD值。
[0046] 實施例2
[0047] --本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法對比試驗
[0048] 對比實驗采用傳統(tǒng)的0. 05%膠原酶IV消化，37°C，5% C〇2,置于搖床震蕩45min， 促使細(xì)胞完全離散。之后經(jīng)過密度梯度離也，采用磁珠二抗分選后，得到雞腸道上皮淋己細(xì) 胞，檢測細(xì)胞活力。
[0049] 發(fā)明人使用本方法及對比實施例所述方法，均作了十次試驗進(jìn)行比較，并進(jìn)行了 細(xì)胞分離情況的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，如表1比較：
[0050] 表1本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)方法分離細(xì)胞對比試驗
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括以下步驟： 步驟1 :由經(jīng)過禁食采用靜脈放血處死的試驗雞，無菌手術(shù)取2?3cm腸段置于含1% 雙抗的PBS中； 步驟2 :制備腸壁組織漿液經(jīng)離心去上清液后，于沉淀中加入0. 05%膠原酶混合酶進(jìn) 行消化； 步驟3 :向細(xì)胞液加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，離心；去上清，無血清培養(yǎng)液 重懸細(xì)胞，離心洗漆細(xì)胞；再次重懸細(xì)胞，分別經(jīng)過不同目數(shù)自制細(xì)胞篩過濾細(xì)胞，離心去 上清； 步驟4 :將細(xì)胞重懸于密度為1. 058g/mL淋巴細(xì)胞分離液中；于離心管底部加入4mL密 度為1. 098g/mL淋巴細(xì)胞分離液；將細(xì)胞懸液鋪于之上，離心；取兩個不同密度的淋巴細(xì)胞 分離液界面黃白色細(xì)胞層； 步驟5 :在濃度為1 X 107/mL細(xì)胞懸液中，先后加入一定量的TCR1抗體和磁珠，進(jìn)行磁 珠二抗分選，并用PBS適當(dāng)重懸稀釋，保證二者與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合；將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞分選 儀進(jìn)樣口，得到陽性細(xì)胞； 步驟6 :將細(xì)胞懸浮于10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào) 整細(xì)胞濃度為1 X 107/mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，測定其細(xì)胞存活情況。
2. 如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟 1中的雙抗為青霉素和鏈霉素，濃度為1% (V/V)。
3. 如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟1所 述的腸段為空腸中段。
4. 如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟2中 所述的混合消化酶為膠原酶I和膠原酶IV混合酶制劑其質(zhì)量比為為2:1。
5. 如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的 步驟3中無血清RPMI-1640培養(yǎng)液為RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中加入（V/V)0. 5%雙抗、1% L-谷氨酰胺和1 %羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7. 2?7. 4。
6. 如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的步 驟4不同密度淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)過密度為1. 101g/mL的淋巴細(xì)胞分離液原液與PBS -定 比例配制而得。
7. 如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的步 驟5中的磁珠二抗分選法，具體為先加入一定量TCR1抗體，保證其濃度可達(dá)每107個細(xì)胞 懸液中含有20 y L抗體；孵化后，離心去上清；再加入磁珠，使其濃度達(dá)到每107個細(xì)胞懸液 中含有5 y L磁珠，孵化離心去上清；PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分選儀分選。
8. 如權(quán)利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的步 驟1中的禁食時間，24?36h為最佳禁食時間。
【文檔編號】C12N5/0783GK104357393SQ201410645751
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】張海軍, 楊金玉, 武書庚, 齊廣海, 岳洪源, 王晶 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所