一株順式環(huán)氧琥珀酸水解酶產(chǎn)生菌及其在l-酒石酸生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的雙頭菌屬CICC23800菌株（ Labrys sp .CICC23800），保藏編號為CGMCCNo.9849。雙頭菌屬CICC23800菌株經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，離心得菌體細(xì)胞，菌體細(xì)胞加入順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液進行生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)氯化鈣沉淀、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結(jié)晶干燥得L-酒石酸成品。雙頭菌屬CICC23800菌株用于L-酒石酸生產(chǎn)可提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。CGMCC No984920141027
【專利說明】一株順式環(huán)氧琥珀酸水解酶產(chǎn)生菌及其在L-酒石酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株雙頭菌屬CICC 23800菌株5/7.CICC 23800)，其可以用于生物轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸鈉生產(chǎn)L-酒石酸。

【背景技術(shù)】
[0002]L (+ )酒石酸，即2，3-二羥基丁二酸，為天然有機酸，無水結(jié)晶、無臭、味酸、無色透明，屬單斜晶系，相對密度1.76，熔點168°C?17(TC，易溶于水、甲醇、乙醇，難溶于乙醚、氯仿。
[0003]L(+)_酒石酸是一種天然有機酸，廣泛分布于自然界，特別是葡萄和羅望子果中。L(+)_酒石酸首先由Scheele于1769年從葡萄酒中發(fā)現(xiàn)，是一種重要的食品添加劑和工業(yè)原料。作為食品添加劑，它的酸味值約是檸檬酸的1.25倍，可作為飲料、糖果及葡萄酒等的酸味劑，它和檸檬酸、氧化亞鐵產(chǎn)生鮮綠色可作為食用色素用于糕點，亦可用作防腐劑和乳化穩(wěn)定劑。在工業(yè)方面主要用于印染的防染劑、照相顯影劑、金屬離子隱匿劑；在制藥工業(yè)中，可作為藥物拆分劑，如在生產(chǎn)抗結(jié)核藥乙胺丁醇中，L(+)_酒石酸作為不可替代的拆分劑用于拆分中間體(±)_2_氨基丁醇，它也可作為酒石酸苯茚胺，酒石酸異丁嗪等藥品的成鹽劑；此外在電鍍和制革等行業(yè)也有廣泛的用途。
[0004]L-酒石酸生產(chǎn)方法主要有酒石提取法、化學(xué)合成法、直接發(fā)酵法以及生物轉(zhuǎn)化法。但最具有工業(yè)生產(chǎn)價值的方法是生物轉(zhuǎn)化法。
[0005](1)酒石提取法:早期酒石酸主要從葡萄酒釀造的副產(chǎn)物酒石中提取，缺點是酒石供應(yīng)量有限、來源不穩(wěn)定。
[0006](2)化學(xué)合成法:化學(xué)法合成酒石酸為D-酒石酸和L-酒石酸的混合體，還需進行光學(xué)異構(gòu)體拆分才能得L-酒石酸，生產(chǎn)成本較高。
[0007](3)直接發(fā)酵法:1929年佳木首先報道了灰綠曲霉glaucus)在葡萄糖基質(zhì)上產(chǎn)生L(+)-酒石酸；1968年山田浩一等人采用Gluconobacter SuboxyansIAM-1829 (ATCC 621)直接發(fā)酵生產(chǎn)L (+)-酒石酸，產(chǎn)酸為14.6g/L，轉(zhuǎn)化率為29.2%。直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-酒石酸產(chǎn)酸及轉(zhuǎn)化率低，目前處于研究階段。
[0008](4)生物轉(zhuǎn)化法:利用微生物產(chǎn)生的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(ESH)水解順式環(huán)氧琥珀酸鈉成L (+)_酒石酸生物轉(zhuǎn)化的方法。目前報道的，產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶微生物菌種主要有:無色桿菌(Achromobacter tartarogens)和產(chǎn)喊桿菌iAlcaligenesepoxylyticus)，諾卡氏菌 iNocardia tartaricans)，棒狀桿菌{Corynebacterium sp.)，強壯根瘤菌mhizobiutn validum)等。生物轉(zhuǎn)化法的主要優(yōu)點是反應(yīng)立體專一'丨生強,轉(zhuǎn)化率高，基本上沒有其他副產(chǎn)物，后期的分離提純也更加方便。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題為通過自主選育獲得一株產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物菌種雙頭菌屬CICC 23800 Uabrys sp.CICC 23800)，用于水解順式環(huán)氧琥珀酸鈉生產(chǎn)L-酒石酸，轉(zhuǎn)化效率高，降低了 L-酒石酸生產(chǎn)成本。
[0010]本發(fā)明自主選育的雙頭菌屬CICC 23800 {Labrys sp.CICC 23800)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.9849。
[0011]本發(fā)明的雙頭菌屬CICC 2^mLabrys sp.CICC 23800)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力高，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)酶活力可達2300U/g濕細(xì)胞。用于水解順式環(huán)氧琥珀酸鈉生產(chǎn)L-酒石酸，底物順式環(huán)氧琥珀酸鈉濃度高，因而可生物合成高濃度的L-酒石酸，便于后續(xù)提取，可提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
[0012]本發(fā)明進一步提供一種微生物轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸鈉生產(chǎn)L-酒石酸的方法。將雙頭菌屬CICC 23800發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液離心獲得微生物菌體，加入順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液，通過菌體細(xì)胞內(nèi)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，光學(xué)專一性水解順式環(huán)氧琥珀酸鈉，生成L-酒石酸，然后經(jīng)過氯化鈣沉淀、過濾水洗得酒石酸鈣沉淀，再經(jīng)硫酸溶液酸解，過濾水洗得L-酒石酸溶液，經(jīng)濃縮、熱濾、結(jié)晶得L-酒石酸成品。
[0013]具體步驟為:
(1)將雙頭菌屬CICC23800斜面菌種，接種種子培養(yǎng)基，25?37°C發(fā)酵培養(yǎng)18?30h得接種液；
(2)接種液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25?37°C，培養(yǎng)30?48h，得雙頭菌屬CICC23800發(fā)酵液；
(3)發(fā)酵液離心獲得雙頭菌屬CICC23800菌體細(xì)胞；
(4)雙頭菌屬CICC23800菌體細(xì)胞加入pH值6.(T9.0順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液，25-45°C生物轉(zhuǎn)化生成L-酒石酸，經(jīng)沉淀、過濾、酸解、過濾、濃縮、結(jié)晶、干燥得成品L-酒石酸。
[0014]雙頭菌屬CICC 23800的斜面種子培養(yǎng)可采用本領(lǐng)域常用技術(shù)手段。斜面培養(yǎng)基可以采用試管或者茄子瓶制備。通常情況下可采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)獲得適量接種液及發(fā)酵液，若需大規(guī)模培養(yǎng)，可再利用發(fā)酵罐進行擴大培養(yǎng)。
[0015]一些典型的培養(yǎng)基組成如下:
斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖6.(Γ12.0，酵母浸粉3.0?8.0，瓊脂15.0, ρΗ6.0?7.5。
[0016]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖4.(Γ12.0，硫酸銨3.(ΓΙΟ.0，磷酸二氫鉀1.0?4.0，七水硫酸鎂0.2?0.8，硫酸亞鐵0.01?0.04，調(diào)節(jié)ρΗ6.0?7.5。
[0017]微生物保藏信息
微生物分類命名:雙頭菌sp.)
保藏編號:CGMCC N0.9849 保藏日期:2014年10月27日；
保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0018]微生物保藏信息
微生物分類命名:雙頭菌屬CICC 23800 Uabrys sp.CICC 23800)
保藏編號:CGMCC N0.9849 保藏日期:2014年11月6日；
保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心； 保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0019]【具體實施方式】:
為進一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實施例具體說明。
[0020]實施例1 微生物菌種鑒定
1、基因組DNA提取
(1)用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面菌種，懸浮于lml0.85% NaCl溶液中，10000r/min離心2min,棄上清；
(2)沉淀重懸于550ul 1XTE 中，加 17ul 溶菌酶(35mg/ml)，37°C溫育 30min ；
(3)加3ul 蛋白酶 K (20ug/ml), 37°C溫育 30min ；
(4)加30ul 10% SDS，37。。溫育 30min ；
(5)加lOOul5M NaCl溶液充分混勻，再加80ul CTAB/NaCl混勻，65°C水浴lOmin ；
(6)加等體積氯仿/異戍醇(24:1),輕輕震蕩混勻，10000r/min離心8min；
(7)取上清液，加等體積酹/氯仿/異戍醇(25:24:1),輕輕震蕩搖勻；13000r/min離心8min ；
(8)重復(fù)步驟6；
(9)取上清，加0.6-0.8倍體積異丙醇，輕輕混勻后室溫靜置30min ；
(10)10000r/min離心8min,棄上清,加500ul 70%乙醇,顛倒數(shù)次洗鹽，棄上清；重復(fù)洗鹽兩次；
(11)倒置離心管，至DNA沉淀干燥；沉淀溶于50-100uldd H20，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0021]2、16S rDNA 擴增
PCR 反應(yīng)體系 50ul:DNA 模版 0.5ul (約 10ng)，10XTaq DNA 聚合酶 Buffer5ul, lOpmol /ul dNTP lul, lOpmol/ul 正反向引物各 lul (正向引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；反向引物 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT_3’)，2.5u/ulTaq DNA 聚合酶 0.5ul，添加 ddH20 至 50ul。PCR 擴增反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 30s ；50°C30s ；72°C lmin 30s ；35 cycles ；72°C lOmin ;4°C保存。PCR 擴增產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用ABI3700基因測序儀測序。
[0022]3、序列比對鑒定
微生物菌種16S rDNA序列于NCBI數(shù)據(jù)庫比對與雙頭菌屬Uabrys)模式菌株Labrysportucalensis FI 1τ(AY362040), Labrys neptuniae Liujia_146T(DQ417335), Labrysmonachus VKM B_1479T (AJ535707)相似性分別為 99.63%、99.56% ,98.10%。菌株鑒定命名為雙頭菌屬sp.)
實施例2
斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0，酵母浸粉5.0，瓊脂15.0, pH6.5。
[0023]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0，硫酸銨6.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.6，硫酸亞鐵0.02，調(diào)節(jié)pH6.5。
[0024]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10.0，硫酸銨6.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.6，硫酸亞鐵0.02，順式環(huán)氧琥珀酸鈉2.0，調(diào)節(jié)pH6.5。
[0025]取雙頭菌屬CICC 23800斜面菌種一環(huán)接種到30mL種子培養(yǎng)基中，搖床200rpm，29°C培養(yǎng)18h得接種液。取接種液2ml，接種到裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，200rpm攪拌，29°C培養(yǎng)44h，獲得雙頭菌屬CICC 23800發(fā)酵液，發(fā)酵液lOOOOrpm離心得菌體細(xì)胞，力口入200mL的15%順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液，pH值7.0，30°C生物轉(zhuǎn)化44h生成L-酒石酸，加入氯化鈣，過濾得L-酒石酸鈣沉淀，酒石酸鈣沉淀加入硫酸溶液，酸解后過濾得L-酒石酸溶液，80°C濃縮，冷卻結(jié)晶干燥后得L-酒石酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合并到下一批L-酒石酸溶液中。
[0026]實施案例3
斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖12.0，酵母浸粉8.0，？!17.5。
[0027]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖12.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,調(diào)節(jié)pH7.5。
[0028]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,順式環(huán)氧琥珀酸鈉5.0，調(diào)節(jié)pH7.5。
[0029]取雙頭菌屬CICC 23800斜面菌種一環(huán)接種到裝有300mL種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，搖床200rpm，35°C培養(yǎng)28h得接種液。取接種液400mL，接種到裝有40L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，400rpm攪拌，通氣量lv/v.min，35°C培養(yǎng)44h，獲得雙頭菌屬CICC 23800發(fā)酵液，發(fā)酵液lOOOOrpm離心得菌體細(xì)胞，加入40L的15%順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液，pH值9.0，45°C生物轉(zhuǎn)化42h生成L-酒石酸，加入氯化鈣，過濾得L-酒石酸鈣沉淀，酒石酸鈣沉淀加入硫酸溶液，酸解后過濾得L-酒石酸溶液，80°C濃縮，冷卻結(jié)晶干燥后得L-酒石酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合并到下一批L-酒石酸溶液中。
[0030]實施案例4
斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖12.0，酵母浸粉8.0，？!17.5。
[0031]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖12.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,調(diào)節(jié)pH7.5。
[0032]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,順式環(huán)氧琥珀酸鈉5.0，調(diào)節(jié)pH7.5。
[0033]取雙頭菌屬CICC 23800斜面菌種一環(huán)接種到裝有300mL種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，搖床200rpm，35°C培養(yǎng)28h得接種液。取接種液400mL，接種到裝有40L種子培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，400rpm攪拌，通氣量lv/v.min，35°C培養(yǎng)28h，獲得雙頭菌屬CICC 23800二級種子液。取二級種子液160L，接種裝有16m3發(fā)酵培養(yǎng)基的20 m3發(fā)酵罐通氣量0.5v/v.min, 200rpm, 35°C培養(yǎng)44h,發(fā)酵液lOOOOrpm離心得菌體細(xì)胞，加入16m3的15%順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液，pH值9.0，45°C生物轉(zhuǎn)化42h生成L-酒石酸，加入氯化鈣，過濾得L-酒石酸鈣沉淀，酒石酸鈣沉淀加入硫酸溶液，酸解后過濾得L-酒石酸溶液，80°C濃縮，冷卻結(jié)晶干燥后得L-酒石酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合并到下一批L-酒石酸溶液中。
[0034]以上所述的實施案例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明的設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。
[0035]序列表
<110>中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院
〈120〉一株順式環(huán)氧琥珀酸水解酶產(chǎn)生菌及其在L-酒石酸生產(chǎn)中的應(yīng)用〈160〉 I
<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211>1369
<211>DNA
〈213〉雙頭菌屬 CICC 23800 Uabrys sp.CICC 23800)
<400>1
ggcttaccat gcaagtcgaa cgccccgcaa ggggagtggc agacgggtga gtaacgcgtg60
gggatgtgcc ttgaggtggg gaataactgt gggaaactac agctaatacc gcataagccc120
ttcgggggaa agatttatcg cctttagagc aacccgcgtc agattagcta gttggtaggg180
taatggccta ccaaggcgac gatctgtagc tggtctgaga ggatgaccag ccacactggg240
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg300
caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg atgacggcct tagggttgta aagctctttt360
aacagggacg ataatgacgg tacctgtaga ataagccccg gcaaacttcg tgccagcagc420
cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg480
cggattgtta agtcgggggt gaaatcctga ggctcaacct cagaactgcc ttcgatactg540
gcgatcttga gttcggaaga ggttggtgga acagctagtg tagaggtgaa attcgtagat600
attagctaga acaccagtgg cgaaggcggc caactggtcc gatactgacg ctgaggtgcg660
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg720
ccagccgtcg gggagcttgc tcttcggtgg cgcagctaac gctttaagca ttccgcctgg780
ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga840
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gcccttgaca tcccggtcgc900
ggatcacaga gatgagatcc ttcagttcgg ctggaccggt gacaggtgct gcatggctgt960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgcccct1020
agttgccagc attcagttgg gcactctagg gggactgccg gtgataagcc gcgaggaagg1080
tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg1140
cggtgacagt gggaagcgaa ggggtgaccc ttagcaaatc tccaaaagcc gtctcagttc1200
agattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa ggtggaatcg ctagtaatcg cagatcagca1260
tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg1320
ttttacccga aggcgctgcg ccaaccgcaa ggaggcaggc gaccacgta1369
【權(quán)利要求】
1.一株雙頭菌屬 CICC 23800 菌株sp.CICC 23800)，保藏編號為 CGMCCN0.9849。
2.如權(quán)利要求1所述的雙頭菌屬CICC23800菌株，其特征在于能夠產(chǎn)生順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，用于生物轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸鈉生產(chǎn)L-酒石酸。
3.如權(quán)利要求2所述的一種生物轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸鈉生產(chǎn)L-酒石酸的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的雙頭菌屬CICC 23800菌株發(fā)酵培養(yǎng)，離心得菌體細(xì)胞，菌體細(xì)胞加入順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液進行生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)氯化鈣沉淀、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結(jié)晶干燥得L-酒石酸成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)雙頭菌屬CICC23800斜面菌種接種種子培養(yǎng)基培養(yǎng)18?30h，得接種液； (2)接種液接入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)3(T48h，發(fā)酵液離心獲得雙頭菌屬CICC23800菌體細(xì)胞； (3)雙頭菌屬CICC23800菌體細(xì)胞加入順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液，生物轉(zhuǎn)化生成L-酒石酸，經(jīng)沉淀、過濾、酸解、濃縮、過濾、結(jié)晶得成品L-酒石酸。
5.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特征在于步驟(I)和(2)雙頭菌屬CICC23800培養(yǎng)溫度為 25-37°C。
6.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特征在于步驟(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)為:葡萄糖4.(Γ15.0,硫酸銨3.(Γ10.0,磷酸二氫鉀1.0?4.0,七水硫酸鎂0.2?0.8，硫酸亞鐵0.01?0.04，順式環(huán)氧琥珀酸鈉1.0?5.0，調(diào)節(jié)ρΗ6.0?7.5。
7.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特征在于步驟(3)順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液pH值為6.0?9.0。
8.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特征在于步驟(3)生物轉(zhuǎn)化溫度3(T45°C。
【文檔編號】C12R1/01GK104388346SQ201410648880
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】程池, 劉勇, 裴疆森, 徐友強, 張京濤, 王哲 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院