一種生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)l-蘋果酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。利用自主選育的葡萄牙棒孢酵母CICC33054（Clavispora lusitaniae CICC 33054），經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，離心得酵母細胞。酵母細胞加入富馬酸鈉溶液進行生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)富馬酸鈣置換沉淀、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結(jié)晶干燥得L-蘋果酸成品。葡萄牙棒孢酵母CICC33054易于培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化效率高，用于L-蘋果酸生產(chǎn)可提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。CGMCC No.98482014.10.27
【專利說明】一種生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，尤其是涉及葡萄牙棒孢酵母CICC 33054生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]L-蘋果酸又名羥基琥珀酸或羥基丁二酸，分子式為C4H6O5，分子量為134.09。在常溫下，L-蘋果酸為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，有爽快的酸味，比重1.601，熔點98、9°C。在20°C下，34%的L-蘋果酸水溶液無旋光性，加水稀釋后可出現(xiàn)左旋，當其濃度超過34%時，又出現(xiàn)右旋。
[0003]由于L-蘋果酸分子中含有-OH基及-COOH基，因此對極性溶媒的溶解度大，化學性質(zhì)較為活潑。在常溫下它極易溶于乙醇中，在水中其溶解度隨水溫的升高而增大，呈強酸性。它還能與醇類、濃硫酸、苯酚、過氧化氫、三氯乙醛及醋酸鉛等發(fā)生反應(yīng)，并能與萘酚、間苯酚及2，7_萘二酚作用，使溶液呈不同的顏色。
[0004]L-蘋果酸是生物體代謝過程中所產(chǎn)生的重要有機酸。在微生物中，它的產(chǎn)生與多條重要的代謝途徑有關(guān)，出現(xiàn)于三羧酸循環(huán)(TCA)及其支路乙醛酸循環(huán)中，也是CO2固定反應(yīng)的產(chǎn)物。
[0005]幾十年來，人們對L-蘋果酸在微生物中的代謝途徑進行了研究，尤其對裂褶菌{Schizphylhls代謝途徑的研究比較深入。目前從事這方面工作的研究者大都認為CO2固定反應(yīng)是L-蘋果酸生成及積累的重要過程。
[0006]L-蘋果酸在水中溶解度大、酸味柔和、風味別致、質(zhì)地穩(wěn)定，其用途相當廣泛:
1.在食品工業(yè)上，L-蘋果酸是國際上公認的一種安全性食品添加劑，也是一種優(yōu)良的調(diào)酸劑和保鮮劑。與檸檬酸相比，L-蘋果酸的刺激較為緩慢，酸味可保留較長時間，與檸檬酸配合使用，可以模擬天然果實的酸味特征，使甜酸口感顯得自然、豐滿、調(diào)諧。現(xiàn)在歐美及日本各國的食品生產(chǎn)中，它已成為不可缺少的基本原料之一。另外，由于食品中添加L-蘋果酸可使PH值得到調(diào)整，加上其本身固有的抗菌作用，L-蘋果酸亦被廣泛地用于其它食品工業(yè)，如作水產(chǎn)品的保鮮劑等。
[0007]2.在醫(yī)藥上，L-蘋果酸具有重要的生理功能。L-蘋果酸直接參與人體代謝，對人體的健康有幫助。可用于治療貧血、肝功能不全、肝衰竭，并可作混合氨基酸注射液的組分和乳酸鈣注射液的安定劑。把L-蘋果酸加入藥物中還可增進藥物的穩(wěn)定性、改善人體對藥物的吸收能力。L-蘋果酸鉀可作為鉀的重要來源，亦具防止水腫、血壓過高及脂肪積聚之功效。L-蘋果酸及其鹽類還能作動物的生長促進劑。
[0008]3.工業(yè)上的其它用途。由于L-蘋果酸具抗氧化作用和較強的鰲合作用，因此廣泛地應(yīng)用于印染工業(yè)作為保色劑和增效劑。在化學工業(yè)方面，由于L-蘋果酸可調(diào)節(jié)pH值，因此可作牙膏及煙草的調(diào)味劑、皮膚清潔劑、焊錫助焊劑、空氣清新劑、洗滌劑助劑和廢氣脫硫劑，還可代替檸檬酸作為各種金屬容器及表面的除銹劑。在建材上，添加適量的L-蘋果酸于水泥中，可縮短凝固時間，防止堿性凝聚反應(yīng)的發(fā)生，提高混凝土的強度。L-蘋果酸還可代替草酸作為各種石塊的表面清洗劑，使其表面變得光滑、平整和美觀。
[0009]隨著L-蘋果酸應(yīng)用研究的不斷深入，其市場需求量逐年增加。經(jīng)過不斷努力，L-蘋果酸的生產(chǎn)方法已從早期單一的直接提取法，發(fā)展到今天的多種生產(chǎn)方法。根據(jù)生產(chǎn)原料的不同，可將L-蘋果酸的生產(chǎn)分為5種:
1.直接提取法:把石灰乳直接加人富含L-蘋果酸的果汁及蔬菜汁中，形成的L-蘋果酸鈣沉淀用硫酸處理，然后再回收游離的L-蘋果酸。
[0010]2.拆分法:在一定條件下，糖醛、β -內(nèi)醋、環(huán)戊二烯及丁烯二酸等均可合成DL-蘋果酸。將化學合成的DL-蘋果酸拆分就可獲得L-蘋果酸。
[0011]3.利用微生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸。以能夠產(chǎn)生富馬酸酶的微生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸。到目前為止，篩選出來具有較高富馬酸酶活性的菌種有短乳桿 lif ^Lactobacillus brevis、、產(chǎn)氛短桿舊 Uirevibacterium ammoniagenes)>黃色短桿菌(Mrevibacterium fIavum)、脫氮副球菌iParacoccus denitrificans、、苜Ij腸道菌iPorocolobactoriuo sp.)、解脂假絲酵母{Candida Iipolytica )及溫特曲霉(.Aspergillus wentii)等。生物轉(zhuǎn)化法采用的方法有固定化酶或固定化細胞以及游離細胞法。固定化酶或固定化細胞法的酶和細胞能重復(fù)利用，但是固定化操作繁瑣，設(shè)備要求高。游離細胞法操作簡單工藝易控。
[0012]4.利用微生物發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸。采用此法的生產(chǎn)途徑有兩條:第一條是用單一菌種一步發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸,所用的菌種有黃曲霉(As/76?r^777w5.flavus、、寄生曲霉(AspergiIlus parasi ticus )、米曲霉(AspergiIlus oryzae )及出芽短梗霉(Aureobasidium pulIulans)等；第二條是混種發(fā)酵兩步生產(chǎn)L-蘋果酸,首先采用少根根霉(Mdzopus arrizus)或華根霉{Rhizopus)把糖質(zhì)原料轉(zhuǎn)化成富馬酸,然后利用膜醭畢赤酵母(/7ZcAia 普通變形桿菌{Proteus vulgaris)及宛氏擬青霉iPaecilomyces var1tii)中的一種,把富馬酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。由于發(fā)酵周期較長，產(chǎn)酸率相對較低、副產(chǎn)物較多，因此直到目前為止還尚未見有應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的報道。
[0013]5.利用微生物發(fā)酵非糖質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸。目前人們已成功地采用布倫假絲酵母brumptii )發(fā)酵正構(gòu)石臘,宛氏擬青霉發(fā)酵乙醇、甘油、醋酸及丙酸等,產(chǎn)堿菌Ulcaligenes sp.T501)發(fā)酵馬來酸，其轉(zhuǎn)化率分別達80%、48%及98.4%。但這些非糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的試驗?zāi)壳叭蕴幱趯嶒炇译A段，尚未投人工業(yè)生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題為提供一種以產(chǎn)富馬酸酶的微生物菌種葡萄牙棒孢酵母 CICC 33054 (Clavispora lusitaniae CICC 33054))生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn) L-蘋果酸。
[0015]本發(fā)明自主選育的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9848。
[0016]葡萄牙棒孢酵母CICC 33054的26S rDNA序列見序列表。
[0017]本發(fā)明的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054富馬酸酶活力高，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)酶活力可達2000U/g濕細胞。用于生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸，轉(zhuǎn)化效率高，便于后續(xù)提取，可提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。
[0018]本發(fā)明進一步提供一種微生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。將葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發(fā)酵培養(yǎng)后發(fā)酵液離心獲得酵母細胞，加入富馬酸鈉溶液，通過菌體細胞內(nèi)的富馬酸酶，光學專一性合成L-蘋果酸，然后經(jīng)過富馬酸鈣置換沉淀、過濾水洗得L-蘋果酸鈣沉淀，再經(jīng)硫酸溶液酸解，過濾水洗得L-蘋果酸溶液，經(jīng)濃縮、結(jié)晶、干燥得L-蘋果Ife成品。
[0019]具體步驟為:
(O葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種接種種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)18?24h，得接種液；
(2)接種液接入發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵2(T30h得發(fā)酵液,發(fā)酵液離心獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 細胞；
(3)葡萄牙棒孢酵母CICC33054細胞加入富馬酸鈉溶液，生物轉(zhuǎn)化生成蘋果酸，經(jīng)沉淀、過濾、酸解、過濾、濃縮、結(jié)晶、干燥得成品L-蘋果酸酸。
[0020]葡萄牙棒孢酵母CICC 33054的斜面種子培養(yǎng)可采用本領(lǐng)域常用技術(shù)手段。斜面培養(yǎng)基可以采用試管或者茄子瓶制備。通常情況下可采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)獲得適量種子培養(yǎng)液，若需大規(guī)模培養(yǎng)，可再進行發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，獲得量大的種子培養(yǎng)液。工業(yè)生產(chǎn)中，葡萄牙棒孢酵母CICC 33054細胞發(fā)酵液可通過發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0021]一些典型的培養(yǎng)基組成如下:
斜面培養(yǎng)基(g/L):麥芽浸粉8(Γ150.0，瓊脂15.0，pH值6.0?7.0。
[0022]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30.(Γ70.0，酵母粉2.(Γ8.0，硫酸銨3.(Γ8.0，磷酸二氫鉀1.(Γ5.0，七水硫酸鎂0.1?0.6，調(diào)節(jié)ρΗ6.(Γ7.0。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50.(Γ120.0，酵母粉2.(Γ8.0，硫酸銨3.(Γ8.0，磷酸二氫鉀1.(Γ5.0，七水硫酸鎂0.1?0.6，調(diào)節(jié)pH值6.0?7.0。
[0024]微生物保藏信息
微生物分類命名:葡萄牙棒孢酵母Iusitaniae)
保藏編號:CGMCC N0.9848 保藏日期:2014年10月27日；
保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0025]

【具體實施方式】
為進一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實施例具體說明。
[0026]實施例1 微生物菌種鑒定
1、基因組DNA提取
(1)用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面菌種，懸浮于Iml0.85% NaCl溶液中，10000r/min離心2min,棄上清；
(2)沉淀重懸于550ulIXTE中，沸水浴1min ；
(3)加3ul 蛋白酶 K (20ug/ml), 37°C溫育 30min ；
(4)加30ul 10% SDS，37。。溫育 30min ；
(5)加10ul5M NaCl溶液充分混勻，再加80ul CTAB/NaCl混勻，65°C水浴1min ； (6)加等體積氯仿/異戍醇(24:1),輕輕震蕩混勻，10000r/min離心8min；
(7)取上清液,加等體積酹/氯仿/異戍醇(25:24:1),輕輕震蕩搖勻；13000r/min離心8min ；
(8)重復(fù)步驟6；
(9)取上清，加0.6-0.8倍體積異丙醇，輕輕混勻后室溫靜置30min ；
(10)10000r/min離心8min,棄上清,加500ul 70%乙醇,顛倒數(shù)次洗鹽，棄上清；重復(fù)洗鹽兩次；
(11)倒置離心管，至DNA沉淀干燥；沉淀溶于50-100uldd H2O,-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]2、26S rDNA 擴增
PCR 反應(yīng)體系 50ul:DNA 模版 0.5ul(約 10ng)，1XTaq DNA 聚合酶 Buffer 5ul, 1pmol/ul dNTP lul，10pmol/ul 正反向引物各 Iul (正向引物 NLl 5 ‘一GCA TAT CAA TAA GCGGAG GAA AAG— 3’和反向引物 NL4 5 ‘一GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’)，2.5u/ul TaqDNA 聚合酶 0.5ul，添加 ddH20 至 SOult5PCR擴增反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 30s ;50。。30s ；72°C Imin 30s ；35 cycles ；72°C 1min ;4°C保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用ABI3700基因測序儀測序。
[0028]3、序列比對鑒定
微生物菌種26S rDNA序列于NCBI數(shù)據(jù)庫比對與模式株 Clavispora IusitaniaeCBS 4413τ (ΑΥ190538), Clavispora lusitaniae CBS 6936T (U44817)，相似性最高，分別為100.0%、93.4%。菌株鑒定命名為葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 (Clavispora lusitaniaeCICC 33054)。
[0029]實施例2
斜面培養(yǎng)基(g/L):麥芽浸粉90.0、瓊脂15.0、pH值6.0。
[0030]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40.0，酵母粉3.0，硫酸銨4.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.2，調(diào)節(jié)pH6.0。
[0031]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖70.0，酵母粉6.0，硫酸銨6.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.2，調(diào)節(jié)pH6.0。
[0032]取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種一環(huán)接種到裝有30mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床200rpm，29°C培養(yǎng)18h得接種液。取3mL接種液，接種到裝有300mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，200rpm培養(yǎng)28h，獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發(fā)酵液，發(fā)酵液5000rpm離心1min得酵母細胞，加入300mL的139g/L的富馬酸溶液(氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為6.0)，再加入0.2mL甲苯，30°C生物轉(zhuǎn)化31h生成L-蘋果酸。加入富馬酸鈣置換，過濾得L-蘋果酸鈣沉淀，再經(jīng)硫酸酸解后過濾得L-蘋果酸溶液，80°C濃縮，冷卻結(jié)晶、干燥后得L-蘋果酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合并到下一批L-蘋果酸溶液中。
[0033]實施案例3
斜面培養(yǎng)基(g/L):麥芽浸粉150.0、瓊脂15.0、pH值7.0。
[0034]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖70.0，酵母粉8.0，硫酸銨8.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調(diào)節(jié)pH值7.0。
[0035]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖120.0，酵母粉15.0，硫酸銨12.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調(diào)節(jié)pH值為7.0。
[0036]取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種一環(huán)接種到裝有300mL種子培養(yǎng)基的IL三角瓶中，搖床200rpm，33°C培養(yǎng)24h得接種液，合并得發(fā)酵液600mL。取600mL接種液，接種到裝有30L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐，330C，通氣量lv/v.min, 500rpm培養(yǎng)24h，獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發(fā)酵液，發(fā)酵液5000rpm離心1min得酵母細胞，加入60L的139g/L的富馬酸溶液(氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為6.0)，再加入300ml甲苯，40°C生物轉(zhuǎn)化28h生成L-蘋果酸。加入富馬酸鈣置換，過濾得L-蘋果酸鈣沉淀，再經(jīng)硫酸酸解后過濾得L-蘋果酸溶液，80°C濃縮，冷卻結(jié)晶干燥后得L-蘋果酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合并到下一批L-蘋果酸溶液中。加入富馬酸鈣置換過濾得L-蘋果酸鈣沉淀后的過濾液可再用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-蘋果酸。
[0037]實施案例4
斜面培養(yǎng)基(g/L):麥芽浸粉150.0、瓊脂15.0、pH值7.0。
[0038]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖70.0，酵母粉8.0，硫酸銨8.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調(diào)節(jié)pH值7.0。
[0039]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖120.0，酵母粉15.0，硫酸銨12.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調(diào)節(jié)pH值為7.0。
[0040]取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種一環(huán)接種到裝有300mL種子培養(yǎng)基的IL三角瓶中，搖床200rpm，33°C培養(yǎng)24h得接種液，合并得發(fā)酵液600mL。取600mL接種液，接種到裝有30L種子培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐，330C，通氣量lv/v.min, 500rpm培養(yǎng)20h，獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 二級種子液。取300L 二級種子液接入裝有15m3發(fā)酵培養(yǎng)基的20m3發(fā)酵罐，33°C,通氣量0.5v/v.min,200rpm培養(yǎng)20h。發(fā)酵液離心1min得酵母細胞,加入30 m3的139g/L的富馬酸溶液(氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為6.0)，再加入400L甲苯，40°C生物轉(zhuǎn)化30h生成L-蘋果酸。加入富馬酸鈣置換，過濾得L-蘋果酸鈣沉淀，再經(jīng)硫酸酸解后過濾得L-蘋果酸溶液，80°C濃縮，冷卻結(jié)晶干燥后得L-蘋果酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合并到下一批L-蘋果酸溶液中。加入富馬酸鈣置換過濾得L-蘋果酸鈣沉淀后的過濾液可再用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-蘋果酸。
[0041]以上所述的實施案例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明的設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。
[0042]序列表
<110>中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院
〈120〉一種生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸的方法
〈160〉 I
<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
<211>482
<211>DNA
〈213〉葡萄牙棒孢酵母 CICC 33054 (Clavispora lusitaniae CICC 33054)
<400>1
gctcaaattt gaaatcctgc gggaattgta atttgaaggt ttcgtggtct gagtcggccg60cgcccaagtc cattggaaca tggcgcctgg gagggtgaga gccccgtatg gcgcacgccg120
actctttgca ccgcggctcc gacgagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg180
gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg240
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cccttttcga ggcctgcgat tctaggacgc tggcgtaatg gttgcaagcc gcccgtcttg480aa
【權(quán)利要求】
1.一株葡萄牙棒抱酵母 CICC 33054 (Clavispora lusitaniae CICC 33054),保藏編號為 CGMCC N0.9848。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄牙棒抱酵母CICC33054 (Clavispora lusitaniae CICC33054)用于生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸。
3.如權(quán)利要求2所述的生物轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發(fā)酵培養(yǎng)，離心得酵母細胞，酵母細胞加入富馬酸鈉溶液進行生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)富馬酸鈣置換沉淀、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結(jié)晶、干燥得L-蘋果Ife成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步驟: (O葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種接種種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)18?24h，得接種液； (2)接種液接入發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵2(T30h得發(fā)酵液,發(fā)酵液離心獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 細胞； (3)葡萄牙棒孢酵母CICC33054細胞加入富馬酸鈉溶液，生物轉(zhuǎn)化生成L-蘋果酸，經(jīng)富馬酸鈣置換沉淀、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結(jié)晶、干燥得L-蘋果酸成品。
5.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特征在于步驟(I)和(2)葡萄牙棒孢酵母CICC33054培養(yǎng)溫度為25-35°C。
6.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特征在于步驟(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)為:葡萄糖50.(Γ120.0,酵母粉2.(Γ8.0,硫酸銨3.(Γ8.0,磷酸二氫鉀1.(Γ5.0,七水硫酸鎂0.Γο.6，調(diào)節(jié) pH 值 6.0?7.0。
7.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特征在于步驟(3)富馬酸鈉溶液pH值為6.(Γ8.0。
8.如權(quán)利要求4所訴的方法，其特診在于步驟(3)生物轉(zhuǎn)化溫度3(T45°C。
【文檔編號】C12N1/16GK104357340SQ201410648894
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】程池, 黃玲, 裴疆森, 劉勇, 張京濤, 徐友強, 王哲 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院