一種透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明選用末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物為起始，利用具有β(1→4)乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性和β(1→3)葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性的雙功能透明質(zhì)酸合酶，在末端葡萄糖醛酸的基礎(chǔ)上，進(jìn)行透明質(zhì)酸寡糖鏈的合成，制備獲得透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾的黃酮化合物。本發(fā)明方法避免了化學(xué)合成存在的頻繁保護(hù)和脫保護(hù)步驟，具有經(jīng)濟(jì)、綠色、高效等優(yōu)點(diǎn)，拓寬了黃酮類化合物的衍生，制備了具有藥物傳輸靶向標(biāo)簽的新型黃酮類藥物，為研發(fā)新型靶向性抗癌藥物開(kāi)辟了新的途徑，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物 的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。涉及一種透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸 的黃酮化合物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃酮類化合物（Flavonoid)是廣泛存在于自然界的一類重要的多酚類化合物，以 2-苯基色原酮（2-phenylchromone)為母核，兩個(gè)苯環(huán)（A與B環(huán)）通過(guò)中央三碳鏈相互聯(lián) 結(jié)而形成的一系列化合物。黃酮類化合物在植物界分布很廣，是植物次級(jí)代謝的產(chǎn)物，多存 在于高等植物及羊齒類植物中。直接從天然植物中提取的黃酮類化合物一般以游離態(tài)或糖 苷形式存在，分子中含有多個(gè)酚羥基。
[0003]

【權(quán)利要求】
1. 一種透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，步驟是： (1) 使用〇? 05?0? 5M、pH值為5. 5?9. 0的Tris-HCl緩沖液分別配制濃度為0? 1M的 UDP-GlcNAc (尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖）溶液，濃度為0. 1M的UDP-GlcA (尿苷二磷 酸-葡萄糖醛酸）溶液，備用； (2) 使用去離子水配制濃度為0. 1M的末端帶有葡萄糖醛酸的黃酮化合物，備用； (3) 使用0? 05?0? 5M、pH值為6. 5?8. 5的Tris-HCl緩沖液配制濃度為30mg/mL的 透明質(zhì)酸合酶溶液，備用； (4) 將步驟（1)制得的UDP-GlcNAc溶液與步驟⑵制得的末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化 合物溶液按1?3:0. 5?1的體積比混合，28°C水浴中孵育10±2分鐘，再加入反應(yīng)溶液總 體積10?30%的濃度為30mg/mL的透明質(zhì)酸合酶溶液，28?32°C水浴中反應(yīng)20?28小 時(shí)，100°C煮沸，得反應(yīng)液； (5) 將步驟（4)制得的反應(yīng)液在2?8°C條件下8, 000?13, 000轉(zhuǎn)/分鐘離心20? 60分鐘，收集上清液； (6) 將步驟（5)收集的上清液在30?37°C的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30?60分鐘去除多余 水分，得濃縮反應(yīng)液； (7) 將步驟（6)制得的濃縮反應(yīng)液使用分子篩凝膠層析純化，以去離子水為流動(dòng)相，按 柱體積0.2?1.5%的體積比例進(jìn)行上樣，層析柱選擇內(nèi)徑為1.0?3. 5厘米，長(zhǎng)度為1.0 米的普通中壓層析柱，洗脫流速為70?90mL/小時(shí)，收集洗脫液，然后利用薄層層析進(jìn)行產(chǎn) 物鑒定，對(duì)含有目標(biāo)產(chǎn)物的收集組分進(jìn)行合并，冷凍干燥，即得透明質(zhì)酸二糖修飾的黃酮化 合物； (8) 將步驟（7)制得的透明質(zhì)酸二糖修飾的黃酮化合物用濃度為0. 05?0. 5M、pH值 為5. 5?8. 0的Tris-HCl緩沖液配制成濃度為0. 1M的透明質(zhì)酸二糖修飾的黃酮化合物溶 液； (9) 將步驟（1)制得的UDP-GlcA溶液與步驟（8)制得的透明質(zhì)酸二糖修飾的黃酮化 合物溶液按1?3:0. 5?1的體積比混合，28°C水浴中孵育10±2分鐘，再加入反應(yīng)溶液總 體積10?30%的濃度為30mg/mL的透明質(zhì)酸合酶溶液，28?32°C水浴中反應(yīng)16?24小 時(shí)，100°C煮沸，得反應(yīng)液； (10) 將步驟（9)制得的反應(yīng)液在2?8°C條件下8, 000?13, 000轉(zhuǎn)/分鐘離心20? 60分鐘，收集上清液； (11) 將步驟（10)收集的上清液在30?37°C的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30?60分鐘去除多 余水分，得濃縮反應(yīng)液； (12) 將步驟（11)制得的濃縮反應(yīng)液使用分子篩凝膠層析純化，以去離子水為流動(dòng)相， 按柱體積0. 2?1. 5 %的體積比例進(jìn)行上樣，層析柱選擇內(nèi)徑為1. 0?3. 5厘米，長(zhǎng)度為1. 0 米的普通中壓層析柱，洗脫流速在70?90mL/小時(shí)，收集洗脫液，利用薄層層析進(jìn)行產(chǎn)物 鑒定，對(duì)含有目標(biāo)產(chǎn)物的收集組分進(jìn)行合并，冷凍干燥，即得透明質(zhì)酸三糖修飾的黃酮化合 物； (13) 將步驟（12)制得透明質(zhì)酸三糖修飾的黃酮化合物用濃度為0. 05?0. 5M、pH值 為5. 5?8. 0的Tris-HCl緩沖液配制成濃度為0. 1M的透明質(zhì)酸三糖修飾的黃酮化合物溶 液； (14) 將步驟（1)制得的UDP-GlcA溶液與UDP-GlcNAc溶液以及步驟（13)制得的透明 質(zhì)酸三糖修飾的黃酮化合物按反應(yīng)溶液終摩爾濃度比為1?1000:1?1000:1的比例混 合，28°C水浴中孵育10 ±2分鐘，再加入反應(yīng)溶液總體積10?30%的濃度為30mg/mL的透 明質(zhì)酸合酶溶液，28?32°C水浴中反應(yīng)10?16小時(shí)，100°C煮沸，得反應(yīng)液； (15) 將步驟（14)制得的反應(yīng)液在2?8°C條件下8, 000?13, 000轉(zhuǎn)/分鐘離心20? 60分鐘，收集上清液； (16) 將步驟（15)收集的上清液在30?37°C的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30?60分鐘去除多 余水分，得濃縮反應(yīng)液； (17) 將步驟（16)制得的濃縮反應(yīng)液透析去除小分子雜質(zhì)，選擇截留分子量范圍為 100?1，000的超濾管，6, 000轉(zhuǎn)/分鐘離心30±5分鐘，收集超濾后的組分，進(jìn)行冷凍干燥， 即獲得透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物。
2. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，其 特征在于：步驟（1)、（3)、⑶或（13)中所述的Tris-HCl緩沖液濃度為0. 05M，其pH值為 7. 5。
3. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，其 特征在于：步驟（4)、（9)或（14)中所述的反應(yīng)液中含有終濃度為20mM的MnC12。
4. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，其 特征在于：步驟（4)中所述UDP-GlcNAc溶液與步驟（2)制得的末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化 合物溶液按1. 2:1的體積比混合；所述透明質(zhì)酸合酶溶液加入量占反應(yīng)總體積的20% ;所 述反應(yīng)是在30°C水浴中進(jìn)行反應(yīng)24小時(shí)。
5. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，其 特征在于：步驟（5)、（10)或（15)中所述離心條件是：4°C條件下12, 000轉(zhuǎn)/分鐘離心30 分鐘。
6. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法， 其特征在于：步驟（7)或（12)中所述分子篩凝膠層析選用Bio-Gel P2膠，其分離分子量范 圍是100?1，800,上樣量為柱體積的0. 5%，流速控制為85mL/小時(shí)。
7. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，其 特征在于：步驟（7)或（12)中所述薄層層析選用Merck公司生產(chǎn)的TLC Silica gel 60F254， 展開(kāi)劑組分選用體積比為乙酸乙酯：甲醇：水：乙酸=5:2:1:0.4的混合溶液。
8. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，其 特征在于：步驟（9)中所述UDP-GlcA溶液與步驟（8)制得的透明質(zhì)酸二糖修飾的黃酮化合 物溶液按1. 2:1的體積比混合；所述透明質(zhì)酸合酶溶液加入量占反應(yīng)總體積的20% ;所述 反應(yīng)是在30°C水浴中進(jìn)行反應(yīng)20小時(shí)。
9. 如權(quán)利要求1所述透明質(zhì)酸寡糖鏈修飾末端帶葡萄糖醛酸的黃酮化合物的方法，其 特征在于：步驟（14)中所述UDP-GlcA溶液與UDP-GlcNAc溶液以及步驟（13)制得的透明 質(zhì)酸三糖修飾的黃酮化合物按反應(yīng)溶液終摩爾濃度比為500:500:1的比例混合；所述透明 質(zhì)酸合酶溶液加入量占反應(yīng)總體積的20% ;所述反應(yīng)是在30°C水浴中進(jìn)行反應(yīng)12小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12P19/60GK104388499SQ201410649632
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】房俊強(qiáng), 王鵬, 付玄, 薛夢(mèng)陽(yáng) 申請(qǐng)人:山東大學(xué)