一種固定化細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種固定化細(xì)胞及其應(yīng)用，該固定化細(xì)胞采用以下方法制成，包括以下步驟：(1)碳纖維預(yù)處理；(2)制備細(xì)胞種子菌；(3)固定化細(xì)胞：可采用以下三種方法之一進行，(a)預(yù)處理的短切碳纖維成球之后，與細(xì)胞接觸，制成成球碳纖維載體固定化細(xì)胞；(b)菌種先生長繁殖到12～24h后，再與成球碳纖維載體接觸，制成成球碳纖維載體固定化細(xì)胞；(c)預(yù)處理過的短切碳纖維成球與細(xì)胞生長繁殖同步進行，制成成球碳纖維載體固定化細(xì)胞。本發(fā)明之固定化細(xì)胞是成球顆粒，具有總表面積大、機械強度高、發(fā)酵穩(wěn)定性好以及便于操作等優(yōu)點，適宜連續(xù)化使用，更適合于進行多酶體系連續(xù)反應(yīng)，尤其可高效多批次發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇，在生物發(fā)酵工業(yè)中具有廣泛的發(fā)展前途，成球碳纖維載體在細(xì)胞的固定化領(lǐng)域中也具有很大的應(yīng)用范圍。
【專利說明】—種固定化細(xì)胞及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定化細(xì)胞及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，即利用化學(xué)或物理手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性和可以反復(fù)使用的一種基礎(chǔ)技術(shù)。固定化細(xì)胞保持了細(xì)胞的生命活動能力，它不但比游離細(xì)胞的發(fā)酵更具有優(yōu)越性，而且比固定化酶有更多的優(yōu)點，比如:它免除了破碎細(xì)胞來提取胞內(nèi)酶的手續(xù)，降低制備成本；細(xì)胞生長停滯時間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快，抗污染能力強，可以連續(xù)發(fā)酵，反復(fù)使用，應(yīng)用成本低；酶在細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中穩(wěn)定性較高，完整細(xì)胞固定化后，酶活力的損失較少等。
[0003]目前，在細(xì)胞固定化方法中，應(yīng)用最廣的是包埋法，包埋法的載體主要是有機高聚物。在包埋技術(shù)發(fā)展的初期，以使用聚丙烯酰胺等合成高聚物為主，如今已逐漸轉(zhuǎn)向使用毒性小，不會損害細(xì)胞的海藻酸鹽、卡拉膠及瓊脂等天然聚合物。但是天然聚合物抗微生物分解性能較差，機械強度較低。吸附法也是常用的細(xì)胞固定化方法之一，吸附法具有兩大優(yōu)點，即簡單及合乎細(xì)胞的生理條件。當(dāng)載體與細(xì)胞懸浮液混合后，細(xì)胞便吸附在載體的表面。因為載體是惰性的，且沒有化學(xué)試劑參與過程，所以被固定的細(xì)胞系處在與懸浮細(xì)胞相同的生理條件下，這樣就不會影響細(xì)胞的生長，也不會影響細(xì)胞的特性和活力。吸附法固定化細(xì)胞的性能關(guān)鍵因素取決于選取的固定化載體材料和固定化所采用的方法。其中，固定化載體材料作為固定化細(xì)胞的一部分，載體材料的結(jié)構(gòu)和性能對固定化細(xì)胞的各種性能都有著巨大直接的影響。細(xì)胞固定化對載體材料的要求很高，目前，細(xì)胞使用的固定化載體材料的主要有:有機高分子載體、無機載體、復(fù)合載體三種。有機高分子載體具有很強的靈活性，可根據(jù)不同類型的細(xì)胞來設(shè)計與之相匹配的載體材料，并且也具有較大的強度、對微生物的腐蝕有較強的抵抗力，但傳質(zhì)性能較差，這對細(xì)胞固定時對細(xì)胞活性的影響較大。無機載體具有一些有機材料不具備的優(yōu)點，例如，穩(wěn)定性好、機械強度高、對微生物無毒性、不易被微生物所分解、耐酸堿、成本低、壽命長等；但固定化效率一般來說比較低。復(fù)合載體具有從反應(yīng)體系中易分離和回收、操作簡便、成本較低的優(yōu)點；但技術(shù)發(fā)展得還不成熟。當(dāng)前，細(xì)胞固定化所需載體成本高，并且載體也不能在固定化過程中重復(fù)使用，顆粒狀的固定化方法制作也困難，從而導(dǎo)致固定化細(xì)胞技術(shù)工業(yè)推廣困難。因此，設(shè)計、開發(fā)和制備性能優(yōu)異可控的載體材料已成為固定化細(xì)胞研究的熱點之一。
[0004]碳纖維是一種含碳量在95%以上的高強度、高模量纖維的新型纖維材料，具有生物相容性好、化學(xué)性能穩(wěn)定，高比表面積、耐高溫等優(yōu)良性能，這些特點決定碳纖維以及活性炭纖維具備成為良好的細(xì)胞固定化載體的特性。目前，碳纖維類材料作為固定化載體的優(yōu)越性已逐漸被越來越多的研究人員所重視。但是碳纖維材料作為細(xì)胞固定化載體的研究和應(yīng)用僅限于考量固定化效果方面的研究。碳纖維作為固定化載體的材料特性與細(xì)胞的固定化機制及相互作用關(guān)系幾乎沒有報道，尤其是載體的成球制備方法和固定化細(xì)胞更是研究的甚少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種固定化細(xì)胞及其應(yīng)用，該固定化細(xì)胞具有總表面積大、機械強度高、反復(fù)利用次數(shù)多以及便于操作的優(yōu)點，可應(yīng)用于多批次發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明之一種固定化細(xì)胞，可采用以下方法制成，包括以下步驟:
(1)碳纖維預(yù)處理:將碳纖維切成長度為0.3cm?0.8cm短切碳纖維放入有機溶劑中浸泡3?5h，過濾或離心回收上清液，用相當(dāng)于3?5倍碳纖維體積的水對短切碳纖維進行清洗，然后將清洗后的短切碳纖維浸泡于體積大于3倍碳纖維體積的沸水浴中處理3?5h后，用水清洗，烘干，取出備用；
(2)制備細(xì)胞種子菌:在無菌條件下，將細(xì)胞接種到斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28?32°C的條件下培養(yǎng)20?30h，形成種子菌；
(3)固定化細(xì)胞:可采用以下三種方法之一進行，(a)先將步驟(I)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養(yǎng)液中，放置于搖床中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h,可控成球，即得成球碳纖維載體；然后將步驟(2)中制備的細(xì)胞種子菌以2%?8%接種到上述含成球碳纖維載體的無菌種子培養(yǎng)液中，放置于搖床中，在28?32°C,控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動4?24h,即得成球碳纖維載體固定化細(xì)胞；或
(b)先將步驟(2)中制備的細(xì)胞種子菌以2%?8%接種無菌種子培養(yǎng)液中，放置于搖床中，在28?32°C控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm，搖動12?24h，即得擴大培養(yǎng)的細(xì)胞種子菌；然后將步驟(I)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入上述含擴大培養(yǎng)的細(xì)胞種子菌的種子培養(yǎng)液中，然后放置于搖床中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h，可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細(xì)胞；或
(c)先將步驟(I)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養(yǎng)液中，然后迅速以2%?8%接種量接種步驟(2)制備的細(xì)胞種子菌中，放置于搖床中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動12?24h,可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細(xì)胞。
[0008]對于采用以上三種固定化方法之一得到固定化細(xì)胞均是是通過對預(yù)處理過的短切碳纖維投入時間的改變來引起對細(xì)胞固定化時間的改變可控制得。方案(a)是預(yù)處理過的短切碳纖維成球之后，與細(xì)胞接觸的為已成球的固定化載體，對細(xì)胞固定化效果的影響；方案(b)則是生長繁殖之后的菌種，在與成球的固定化載體接觸之后，對細(xì)胞固定化效果的影響；方案(C)則是利用預(yù)處理過的短切碳纖維成球與細(xì)胞生長繁殖同步進行，對細(xì)胞固定化效果的影響。三種方案是為了更顯著的表現(xiàn)出成球碳纖維固定化載體的在細(xì)胞固定化效果上的優(yōu)勢。
[0009]進一步，所述制備方法的步驟(I)中，將碳纖維切成長度為0.4?0.6cm短切碳纖維放入丙酮中浸泡4h，過濾或離心回收上清液，用相當(dāng)于5倍碳纖維體積的蒸餾水對短切碳纖維進行清洗，然后將清洗后的短切碳纖維浸泡于體積6倍碳纖維體積的沸水浴中處理4h后，用蒸餾水清洗，烘干，取出備用。
[0010]進一步，所述制備方法的步驟(I)中，所述短切碳纖維選自2k碳纖維、3k碳纖維、6k碳纖維、24k碳纖維、補強布中的任一種。
[0011]進一步，所述短切碳纖維選自6k碳纖維。
[0012]進一步，所述制備方法的步驟(3)中，將備用的短切碳纖維，以等量方式每隔
0.5?5分鐘投入一次，共投放3?5次。
[0013]進一步，所述制備方法的步驟(3)中，所述短切碳纖維投入量為2.5?15g/L ;在250mL搖瓶中，所述含無菌種子培養(yǎng)液的量相當(dāng)于10-50倍碳纖維體積。
[0014]進一步,步驟(3)中,所述細(xì)胞種子菌的接種量為5%。
[0015]本發(fā)明之一種固定化細(xì)胞在多批次發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。
[0016]進一步，其特征在于，在第一批發(fā)酵結(jié)束時保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發(fā)酵液，同時加入新配制的補液進行第二批的發(fā)酵，同樣在第二批發(fā)酵結(jié)束時再次保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發(fā)酵液，加入新配制的補液進行第三批的發(fā)酵，以此類推進行十批發(fā)酵。
[0017]本發(fā)明提出的碳纖維自成球方案，其成球狀態(tài)受到一些參數(shù)的改變而發(fā)生變化:
(1)成球大小的改變
碳纖維自成球的大小主要與碳纖維的加入方法有關(guān)。若一次性將2.0?20g/L的碳纖維投入到液體中，然后放入120rpm?220rpm的搖床內(nèi)搖動0.5?4h后,可能會形成的大小不均一的球團；反之，若將碳纖維分成若干等分，每隔2分鐘投入至液體中，在同等條件下將會形成圖1所示大小均一的小球團。
碳纖維的長短和投入量對碳纖維成球的大小也有一定影響，碳纖維長度和投入量的參數(shù)分別在0.4?0.7cm和10?15g/L的條件下,形成大小均一的較小球團。而碳纖維長度大于0.7cm或投入量超過15g/L時,會形成較大型的球團。
(2)成球圓扁的改變
碳纖維成球的形態(tài)有的較為飽滿圓滑，而有的則扁平一些。影響成球圓扁形態(tài)的主要因素是容器內(nèi)液體的加入量。若加液量多于5倍碳纖維體積，則生成較扁的碳纖維球團，球團高徑比H/D = 0.6/1?1/0.6 ;而加液量少于3倍碳纖維體積，所生成的碳纖維球團高徑比為H/D = 1/0.4?0.4/1 ;若加液量剛剛能將球覆蓋，碳纖維成球形態(tài)較圓滑，球團高徑比為H/D = 1/0.8?0.8/1。另一個影響碳纖維成球圓扁程度的相關(guān)因素為液體環(huán)境的粘度，在無菌水、含水培養(yǎng)液、含水含菌種培養(yǎng)液中，三者粘度依次增高，在粘度較高的含水含菌種培養(yǎng)液環(huán)境下，成球較扁一些，在粘度較低的無菌水中則較為飽滿，但差別不顯著。
(3)成球數(shù)量的改變
碳纖維的成球數(shù)量與其投入量有關(guān)，在投入量為2.0?15g/L的范圍內(nèi)，成球的數(shù)量隨著投入量的增加而增加。此外，碳纖維長度也會對成球數(shù)量造成影響，在投入量相同的條件下，選擇長度較短的碳纖維所生成的球團數(shù)量較多。
(4)成球均一性的改變
碳纖維成球的均一'丨生對固定化效果有一定影響，成球均一'I"生的改變主要與加入方法、加入的液體量有關(guān)，液體的加入量應(yīng)剛好能覆蓋成球碳纖維，且投入碳纖維時分開等量投入，成球的圓扁控制在高徑比為H/D = 1/0.8?0.8/1左右，使得小球能達(dá)到最佳圓滑飽滿程度，并在水中分布均勻。
(5)碳纖維種類所引起的成球差異通過投入不同種類的碳纖維，包括2k碳纖維、3k碳纖維、6k碳纖維、24k碳纖維、補強布等，發(fā)現(xiàn)不同種類的碳纖維在可控成球方面具有不同的形態(tài)特征。在所選碳纖維種類中，纖維束較少的碳纖維所成球更加圓滑，但數(shù)量較少；而纖維束較多的碳纖維數(shù)量較多，但也有可能會形成較大的球團。
[0018]本發(fā)明利用碳纖維可控成球這一技術(shù)，主要通過物理吸附法使細(xì)胞吸附在碳纖維表面固定，形成固定化細(xì)胞。其中，碳纖維材料，無論是活性炭纖維還是改性后的碳纖維，其在固定化應(yīng)用中所使用的固定方法多通過自身物理吸附性對細(xì)胞進行固定。其優(yōu)勢在于，可通過改變條件，控制碳纖維在液體環(huán)境下的成球效果；利用成球的碳纖維載體，對細(xì)胞進行固定化。
[0019]本發(fā)明之固定化載體碳纖維具有可控成球的現(xiàn)象，機理在于碳纖維受到范德華力、靜電排斥力和空間斥力和疏水力的作用達(dá)到平衡、相互制約，并且形成聚結(jié)態(tài)。同時又受到搖床所給的撞擊力、向心力和水的壓力作用而形成球狀。碳纖維載體的成球大小、圓扁、數(shù)量等受到碳纖維自身和外部環(huán)境的影響。
[0020]本發(fā)明之固定化細(xì)胞是成球顆粒，具有總表面積大、抗拉強度高、發(fā)酵穩(wěn)定性好以及便于操作等優(yōu)點，適宜連續(xù)使用，更適合于進行多酶體系連續(xù)反應(yīng)，尤其可高效多批次發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇，在生物發(fā)酵工業(yè)中具有廣泛的發(fā)展前途，成球碳纖維載體在細(xì)胞的固定化領(lǐng)域中也具有很大的應(yīng)用范圍。本發(fā)明在制備固定化細(xì)胞時，操作簡單，固定化過程溫和，原料廉價易得，成本低。實驗證明，在連續(xù)發(fā)酵過程中，成球碳纖維固定化載體的比表面積可達(dá)14m2/g,細(xì)胞的固定化效率超過33%,成球碳纖維載體的固定化效率大于1.2g/g,細(xì)胞固定化載體的抗拉強度在3500兆帕以上，成球碳纖維載體固定化細(xì)胞可連續(xù)發(fā)酵使用10次仍保持良好性能，木糖醇的產(chǎn)率可達(dá)70%以上(以初始木糖計)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為可控成球的碳纖維載體固定化細(xì)胞。

【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體的實施方式進一步詳細(xì)描述。以下實施例是用來進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，而不限制本發(fā)明的保護范圍。對于本發(fā)明所涉及的相關(guān)內(nèi)容及所做的修改，均屬于本發(fā)明保護范圍。
[0023]實施例1:成球碳纖維固定化假絲酵母細(xì)胞發(fā)酵木糖醇
[0024]將6k碳纖維短切成0.5cm的長度，然后進行預(yù)處理:在丙酮中浸泡4h后，過濾回收清液，用相當(dāng)于5倍碳纖維體積的蒸餾水對短切碳纖維進行清洗，然后將清洗后的短切碳纖維浸泡于體積6倍碳纖維體積的沸水浴中處理4h后，取出短切碳纖維，用蒸餾水沖洗干凈，放入風(fēng)箱烘干，取出備用。
[0025]成球碳纖維載體固定化細(xì)胞的種子培養(yǎng)液:木糖(20g/l),葡萄糖(20g/l),酵母浸粉(10g/l)，硫酸鎂(0.04g/l)，磷酸氫鉀(0.4g/l)，pH 為 4.0 ?5.5。
[0026]成球碳纖維載體固定化細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)液:木糖(80g/l),葡萄糖(15g/l),酵母浸粉(8g/l)，pH為4.0?5.0，首先將培養(yǎng)液在121 °C的高溫下滅菌20min，得到菌體發(fā)酵培養(yǎng)液留作備用；然后按照20%的裝液量分別加入到三組250ml搖瓶中，并對三組搖瓶分別進行如下操作:
(1)在含發(fā)酵培養(yǎng)液的搖瓶投入10g/L的備用預(yù)處理碳纖維后，放入搖床中搖動4h，使碳纖維形成大小均一、高徑比為1/0.6?0.6/1的球團；之后對含已成球培養(yǎng)液進行接種，接種量為5%,接著放入轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床中，按照每48h為一批進行連續(xù)發(fā)酵十批。
(2)將一個含發(fā)酵培養(yǎng)液的搖瓶按照5%的接種量進行接種，待24h菌種成長后取出，然后按照10g/L的投入量投入備用預(yù)處理碳纖維，接著放入轉(zhuǎn)速為ISOrpm的搖床中，按照每48h為一批進行連續(xù)發(fā)酵十批。
(3)將一個含發(fā)酵培養(yǎng)液的搖瓶按照10g/L的投入量投入備用預(yù)處理碳纖維后，迅速按照5 %的接種量進行接種，然后放入轉(zhuǎn)速為ISOrpm的搖床中，按照每48h為一批進行連續(xù)發(fā)酵十批。
其中每批次發(fā)酵結(jié)束時需進行換液:在第一批發(fā)酵結(jié)束時保留所有成球碳纖維球團及約30%的發(fā)酵液，同時加入新配制的補液進行第二批的發(fā)酵。同樣在第二批發(fā)酵結(jié)束時再次保留所有成球碳纖維球團及約30%的發(fā)酵液，加入新配制的補液進行第三批的發(fā)酵。以此類推進行十批發(fā)酵，并對發(fā)酵產(chǎn)率和固定化效率進行檢測。
[0027]每次所得產(chǎn)物的固定化效果及木糖醇得率通過以下方法測定:
(1)固定化效率的測量方法采用的是重量法:細(xì)胞/酶的固定化效率計算為固定菌重/總菌重或固定酶重/總酶重);而載體固定化效率計算為固定菌重/載體重量(g/g);
(2)木糖醇測定方法采用國標(biāo)法
(3)成球碳纖維載體的抗拉強度的測定:依據(jù)國標(biāo)6B3354-82，利用電子拉伸機進行測定。
[0028]本實施例中測得連續(xù)發(fā)酵過程中，成球碳纖維載體的固定化效率1.0?1.2g/g，細(xì)胞的固定化效率為33?35%，成球碳纖維載體固定化細(xì)胞可連續(xù)發(fā)酵使用10次，木糖醇的產(chǎn)率可達(dá)70?72% (以初始木糖計)；本實施例測得細(xì)胞固定化載體的抗拉強度為3500兆帕。
【權(quán)利要求】
1.一種固定化細(xì)胞，其特征在于，可采用以下方法制成，包括以下步驟: (1)碳纖維預(yù)處理:將碳纖維切成長度為0.3cm?0.8cm短切碳纖維放入有機溶劑中浸泡3?5h，過濾或離心回收上清液，用相當(dāng)于3?5倍碳纖維體積的水對短切碳纖維進行清洗，然后將清洗后的短切碳纖維浸泡于體積大于3倍碳纖維體積的沸水浴中處理3?5h后，用水清洗，烘干，取出備用； (2)制備細(xì)胞種子菌:在無菌條件下，將細(xì)胞接種到斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28?32°C的條件下培養(yǎng)20?30h，形成種子菌； (3)固定化細(xì)胞:可采用以下三種方法之一進行，(a)先將步驟(1)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養(yǎng)液中，放置于搖床中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h,可控成球，即得成球碳纖維載體；然后將步驟(2)中制備的細(xì)胞種子菌以2%?8%接種到上述含成球碳纖維載體的無菌種子培養(yǎng)液中，放置于搖床中，在28?32°C,控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動4?24h,即得成球碳纖維載體固定化細(xì)胞；或 (b)先將步驟(2)中制備的細(xì)胞種子菌以2%?8%接種無菌種子培養(yǎng)液中，放置于搖床中，在28?32°C，控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm，搖動12?24h，即得擴大培養(yǎng)的細(xì)胞種子菌；然后將步驟(1)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入上述含擴大培養(yǎng)的細(xì)胞種子菌的種子培養(yǎng)液中，然后放置于搖床中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動0.5?4h，可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細(xì)胞；或 (c)先將步驟(1)中備用的短切碳纖維，以投入量為2.0?20g/L投入無菌種子培養(yǎng)液中，然后迅速以2%?8%接種量接種步驟(2)制備的細(xì)胞種子菌中，放置于搖床中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120rpm?220rpm,搖動12?24h,可控固定化，即得成球碳纖維載體固定化細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化細(xì)胞，其特征在于，所述制備方法的步驟(1)中，將碳纖維切成長度為0.4?0.6cm短切碳纖維放入丙酮中浸泡4h，過濾或離心回收上清液，用相當(dāng)于5倍碳纖維體積的蒸餾水對短切碳纖維進行清洗，然后將清洗后的短切碳纖維浸泡于體積6倍碳纖維體積的沸水浴中處理4h后，用蒸餾水清洗，烘干，取出備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化細(xì)胞，其特征在于，所述制備方法的步驟(1)中，所述短切碳纖維選自2k碳纖維、3k碳纖維、6k碳纖維、24k碳纖維、補強布中的任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述所述的固定化細(xì)胞，其特征在于，所述短切碳纖維選自6k碳纖維。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?3之一所述的固定化細(xì)胞，其特征在于，所述制備方法的步驟(3)中，將備用的短切碳纖維，以等量方式每隔0.5?5分鐘投入一次，共投放3?5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?3之一所述的固定化細(xì)胞，其特征在于，所述制備方法的步驟(3)中，所述短切碳纖維投入量為2.5?15g/L ;在250mL搖瓶中，所述含無菌種子培養(yǎng)液的量相當(dāng)于10?50倍碳纖維體積。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?3之一所述的固定化細(xì)胞，其特征在于，步驟(3)中，所述細(xì)胞種子菌的接種量為5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7之一所述的固定化細(xì)胞在多批次發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的固定化細(xì)胞在多批次發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用，其特征在于，在第一批發(fā)酵結(jié)束時保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發(fā)酵液，同時加入新配制的補液進行第二批的發(fā)酵，同樣在第二批發(fā)酵結(jié)束時再次保留所有成球碳纖維球團及20%?30%的發(fā)酵液，加入新配制的補液進行第三批的發(fā)酵，以此類推進行十批發(fā)酵。
【文檔編號】C12N11/14GK104404025SQ201410651984
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】王樂, 王金水, 尹艷麗, 胡元森 申請人:河南工業(yè)大學(xué)