一種用于檢測大腸菌群的試劑盒及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測大腸菌群的試劑盒及應用。該試劑盒包括引物序列和探針序列；其中：引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264組成；探針序列為探針Pb1156A。該試劑盒具有良好的靈敏度、特異性，可替代傳統(tǒng)方法。該試劑盒能快速有效的對食品或其他樣品中的大腸菌群進行計數，將大大降低現用的大腸菌群檢測方法的人力和物力消耗，簡化日常生產生活中大批量的食品或其他樣品的抽檢，因此，特別適合在食品領域中進行廣泛應用。
【專利說明】-種用于檢測大腸菌群的試劑盒及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測領域，特別涉及一種用于檢測大腸菌群的試劑盒及應用。

【背景技術】
[0002] 食物的微生物污染是影響食品安全的重要因素之一，在其貯藏與加工過程中，快 速、準確地檢測食物微生物污染，是控制和保障食品安全的重要手段。目前，對于食品中大 腸菌群的檢測，國內多數采用的檢測方法是依據中華人民共和國國家標準《食品衛(wèi)生微生 物學檢驗-大腸菌群的快速檢測》(GB/T4789. 32-2002)。國標法檢測結果的準確性、靈敏性 均較高，但是操作繁雜、耗時較長，不適合于保質期短的食品檢測；盡管快速檢測國標法大 大縮短了試驗周期，操作也相對較易，但仍然需要使用大量玻璃容器和儀器，不便于現場操 作。進出口行業(yè)標準《食品中大腸菌群和大腸桿菌快速計數法PetrifilmTM測試片法》（SN/ T 1896-2007)中的3M試紙快速檢測方法由于前處理簡單，處理時間短，在生產加工企業(yè)的 現場檢測中具有較大優(yōu)勢，但是其檢測效果和檢測限量是否達到國家規(guī)定的食品衛(wèi)生標準 還有待證實，且造價成本較高，不適應于日常生產生活中大批量的食品抽檢。
[0003] 由于大腸菌群的廣泛存在，使得傳統(tǒng)檢測方法變得繁復且低效，不適應于現代食 品檢測中快速靈敏的要求。因此研究出一種能夠同時檢測食品中各種大腸菌群且快速簡潔 的通用型檢測方法迫在眉睫。
[0004] 目前國內外應用于檢測大腸菌群的分子生物學技術，主要分為三類：普通PCR技 術、熒光PCR技術和基因芯片技術。基因芯片方法檢測效率高，但技術還不成熟，假陽性率 和假陰性率都很難控制，而且成本較高，目前還處于研究階段。普通PCR方法技術成熟，但 是，由于檢測樣品中，微生物種類很多，引物設計是難點，引物特異性不高，容易造成假陽性 結果；而且只能定性檢測出大腸菌群，而不能定量；再者需要對PCR產物進行后處理，極易 導致PCR產物污染。熒光PCR是在普通PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性 引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷 酸序列的技術，其除了具有普通PCR的優(yōu)點外，還具有以下優(yōu)點：（1)特異性更強，靈敏度更 高：由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，從而提高了特異性，并且由自動化儀 器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度；（2)全封閉反應，在 線式實時監(jiān)測熒光，無須PCR的對數期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法， 使得定量更準確可靠；(3)可實現單管雙檢或多檢，還可設計針對性內標，監(jiān)控抽提效率及 排除抑制劑干擾；(4)不接觸有毒試劑，操作安全；（5)有利于規(guī)?；⒆詣踊奥摼W管理； (6)適用范圍更廣，理論上可檢測任何大腸菌群的核酸。但是，熒光定量PCR對引物的要求 相對于普通PCR而言，更為苛刻。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種用于檢測大腸菌群 的試劑盒。該試劑盒能定量檢測大腸菌群。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述試劑盒的應用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：一種用于檢測大腸菌群的試劑盒，包括 引物序列和探針序列；其中：引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物 R1264組成；探針序列為探針Pbll56A ;
[0008] 所述的上游引物F1130a的序列為如下所述的任一條序列：核心序列A ;或以核心 序列A為中心，向5'和3'端分別或同時延伸1?10個核苷酸得到的序列；優(yōu)選為核心序 列A、向核心序列A的5'端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心序列A的3'端延伸10個 核苷酸得到的序列；
[0009] 核心序列 A :5' -TCCTGCTGATGAAGCAGAACAA-3' ；
[0010] 所述的上游引物F1130b的序列為如下所述的任一條序列：核心序列B ;或以核心 序列B為中心，向5'和3'端分別或同時延伸1?10個核苷酸得到的序列；優(yōu)選為核心序 列B、向核心序列B的5'端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心序列B的3'端延伸10個 核苷酸得到的序列；
[0011] 核心序列 B : 5 ' -ATATCGAACTCATGAAGCAGCATAA-3 ' ；
[0012] 所述的下游引物R1264的序列為如下所述的任一條序列：核心序列C ;或以核心序 列C為中心，分別或同時向5'端延伸1?10個核苷酸以及向3'端延伸1?2個核苷酸得 到的序列；優(yōu)選為核心序列C、向核心序列C的5'端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心 序列C的3'端延伸2個核苷酸得到的序列；
[0013] 核心序列 C :5' -CCATGCCGTGGGTTTCAATAT-3' ；
[0014] 所述的探針Pbll56A的序列為如下所示的核心序列D ;或以核心序列D為中心，分 別或同時向5'端延伸1?2個核苷酸以及向3'端延伸1?10個核苷酸得到的序列；優(yōu)選 為核心序列D、向核心序列D的5'端延伸2個核苷酸得到的序列或向核心序列D的3'端延 伸10個核苷酸得到的序列；
[0015] 核心序列D :5' -R-AACGCCGTGCGCTGYTCGCA-Q-3'，R為熒光報告基團，Q為熒光淬 滅基團；
[0016] 上面所述的延伸均以大腸桿菌IacZ基因相應的序列為模板；
[0017] 所述的突光報告基團優(yōu)選為FAM (6-羧基突光素 ）、HEX (六氯-6-甲基突光素）或 TET (四氯-6-羧基熒光素）；
[0018] 所述的熒光淬滅基團優(yōu)選為TAMRA(6-羧基四甲基若丹明）或BHQl ;
[0019] 所述的核心序列 D 為 5' -HEX-AACGCCGTGCGCTGYTCGCA-BHQ1-3' ；Y 是簡并堿基，為 C或T ;
[0020] 所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，還包含用于熒光定量PCR的酶和試劑；
[0021] 所述試劑包括dNTP、緩沖液等；
[0022] 所述用于檢測大腸菌群的試劑盒可定量檢測大腸菌群，特別適合在食品領域中進 行應用。
[0023] 本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0024] (1)目前以分子方法檢測大腸菌群的方法，其引物與探針設計主要集中在 16S-23SrRNA，16S rRNA 和 lacZ(P -半乳糖苷酶基因）上，由于 16S-23S rRNA，16S rRNA 在大腸菌群的四個不同種屬（大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、克雷伯氏菌和腸桿菌屬）中拷貝 數差異十分大，造成基于16S-23S rRNA和16S rRNA的檢測大腸菌群的分子生物學方法，無 法對大腸菌群總數進行直觀的計數。本發(fā)明所提供的引物序列和探針序列是基于單拷貝的 IacZ所設計的，從而能有效的避免前述缺陷。
[0025] (2)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達56個拷貝/mL，說明其具有良好 的靈敏度。
[0026] (3)本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有大腸菌群的檢測樣本均無擴增信號，說 明其具有良好的特異性。
[0027] (4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術作為檢測方法，整個反應均在封閉的反應管內 進行，避免了其他核酸檢測方法如PCR -電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性結果； 由于對PCR產物進行實時監(jiān)測，大大節(jié)省了監(jiān)測時間，節(jié)約了人力物力。
[0028] (5)本發(fā)明所提供的試劑盒能快速有效的對食品或其他樣品中的大腸菌群進行計 數，將大大降低現用的大腸菌群檢測方法的人力和物力消耗，簡化日常生產生活中大批量 的食品或其他樣品的抽檢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1是不同探針引物組合的擴增曲線圖。
[0030] 圖2是部分目標菌株和非目標菌株DNA樣本的擴增曲線圖；其中，1-大腸桿菌 E. coli 0157:H7CICC 21530,2-陰溝腸桿菌 Enterbacter cloacae CICC21539,3-產氣 腸桿菌 Enterbacter aerogenes CICC10293,4-弗氏朽1 樣酸桿菌 Citrobacter freundii ATCC8090,5-肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonia CICC10781，6-產酸克雷伯氏菌 Klebsiella oxytoca CICC22912,7_ 副傷寒沙門氏菌 Salmonella paratyphi CMCC50093, 8-陰性對照。
[0031] 圖3是MPN法和本發(fā)明方法所得結果的Bland-Altman分析結果圖。
[0032] 圖4是平板快速計數法和本發(fā)明方法所得結果的Bland-Altman分析結果圖。
[0033] 圖5是MPN法和平板快速計數法所得結果的Bland-Altman分析結果圖。
[0034] 其中：MPN法表示GB/T4789. 32-2002法，平板快速計數法表示SN/T 1896-2007 法，UCL和LCL為均值± I. 96SD參考線。

【具體實施方式】
[0035] 下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0036] 實施例1
[0037] 1、引物和探針設計：通過分別對所有已知的大腸菌群（大腸埃希氏菌、檸檬酸桿 菌、克雷伯氏菌和腸桿菌）基因組的15條IacZ基因序列進行比較分析，找出高度保守的區(qū) 段有1597-1643和1130-1169這2處，通過premier 3. 0選擇無二級結構且高度保守的區(qū) 段，設計多組引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內無互補序列。引 物列表1如下所示：
[0038] 表1弓丨物和探針列表（均為5' -3'）
[0039]

【權利要求】
1. 一種用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：包括引物序列和探針序列；其中： 引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264組成；探針序列為探針 Pbll56A ； 所述的上游引物F1130a的序列為如下所述的任一條序列：核心序列A ;或以核心序列 A為中心，向5'和3'端分別或同時延伸1?10個核苷酸得到的序列； 核心序列 A :5' -TCCTGCTGATGAAGCAGAACAA-3' ； 所述的上游引物F1130b的序列為如下所述的任一條序列：核心序列B ;或以核心序列 B為中心，向5'和3'端分別或同時延伸1?10個核苷酸得到的序列； 核心序列 B :5' -ATATCGAACTCATGAAGCAGCATAA-3' ； 所述的下游引物R1264的序列為如下所述的任一條序列：核心序列C ;或以核心序列C 為中心，分別或同時向5'端延伸1?10個核苷酸以及向3'端延伸1?2個核苷酸得到的 序列； 核心序列 C :5' -CCATGCCGTGGGITTCAATAT-3' ； 所述的探針Pbll56A的序列為如下所示的核心序列D ;或以核心序列D為中心，分別或 同時向5'端延伸1?2個核苷酸以及向3'端延伸1?10個核苷酸得到的序列； 核心序列D :5' -R-AACGCCGTGCGCTGYTCGCA-Q-3'，R為熒光報告基團，Q為熒光淬滅基 團。
2. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：所述的上游引物 F1130a的序列為核心序列A、向核心序列A的5'端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心 序列A的3'端延伸10個核苷酸得到的序列。
3. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：所述的上游引物 F1130b的序列為核心序列B、向核心序列B的5'端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心 序列B的3'端延伸10個核苷酸得到的序列。
4. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：所述的下游引物 R1264的序列為核心序列C、向核心序列C的5'端延伸10個核苷酸得到的序列或向核心序 列C的3'端延伸2個核苷酸得到的序列。
5. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：所述的探針 Pbll56A的序列為核心序列D、向核心序列D的5'端延伸2個核苷酸得到的序列或向核心 序列D的3'端延伸10個核苷酸得到的序列。
6. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：所述的熒光報告 基團為FAM、HEX或TET。
7. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：所述的熒光淬滅 基團為TAMRA或BHQ1。
8. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：所述的核心序列D 為 5,-HEX-AACGCCGTGCGCTGYTCGCA-BHQ1-3' 。
9. 權利要求1?8任一項所述的用于檢測大腸菌群的試劑盒，其特征在于：還包含用 于熒光定量PCR的酶和試劑。
10. 權利要求1?9任一項所述用于檢測大腸菌群的試劑盒在食品領域中進行應用。
【文檔編號】C12R1/19GK104404144SQ201410660228
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權日:2014年11月18日
【發(fā)明者】胡雙芳, 肖性龍, 李蓉, 余以剛, 吳暉 申請人:華南理工大學, 中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心