一種利用重組大腸桿菌生產(chǎn)l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的方法
【專利摘要】公開了一種利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其中，利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是指在一定pH值的水溶液中，作用于游離的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的具有氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)的基因片段重組到載體里并轉(zhuǎn)入宿主菌，得到帶有重組DNA并且使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強(qiáng)的宿主菌。經(jīng)過以下階段(1)培養(yǎng)大量表達(dá)氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌細(xì)胞；(2)過量表達(dá)階段(1)中的氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶；(3)將階段(2)所得作為粗酶源，加入到含有L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽底物氨基酸的緩沖溶液中反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的高效生產(chǎn)。
【專利說明】一種利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] -種利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，屬于微生物基因工程 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酰胺（Gln)作為特別的免疫營(yíng)養(yǎng)素成為各領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)，尤其在機(jī)體應(yīng)激 狀態(tài)下對(duì)維護(hù)免疫功能的完整性和維護(hù)腸道結(jié)構(gòu)是無法替代的。因此，認(rèn)為谷氨酰胺是應(yīng) 激狀態(tài)下的"條件必需氨基酸"。但谷氨酰胺水溶性差（36g/L)，在水溶液、熱消毒及長(zhǎng)期儲(chǔ) 存時(shí)化學(xué)穩(wěn)定性不足，在加熱滅菌的條件下會(huì)生成有毒的焦谷氨酸和氨，而含有L-谷氨酰 胺的小肽，具有高熱穩(wěn)定性和水溶性，彌補(bǔ)了 L-谷氨酰胺的不足，擴(kuò)大了其在臨床上作為 靜脈營(yíng)養(yǎng)制劑的應(yīng)用范圍，而L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在穩(wěn)定性和水溶性上均優(yōu)于其他含 L-谷氨酰胺的小肽。
[0003] 目前，生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法以及生物 轉(zhuǎn)化法。由于化學(xué)合成法在合成過程中需要引入和去除保護(hù)基團(tuán)，合成步驟過多，成本過 高，并且需要用到有毒試劑，不適合工業(yè)生產(chǎn)；微生物發(fā)酵法成本低廉，環(huán)境溫和，但是產(chǎn)量 較低，離大規(guī)模生產(chǎn)還有一定距離；隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展以及微生物資源的發(fā)現(xiàn)，使得 微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成為工業(yè)上很有前景的生產(chǎn)方法。其中微生物 轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的報(bào)道相對(duì)較少，其中Yoshinori Hirao等人報(bào)導(dǎo)的通 過培養(yǎng)表達(dá)氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌酶法生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，在50L 發(fā)酵罐中，以2. OmL/h的速度流加葡萄糖，發(fā)酵培養(yǎng)24h，取一定量的發(fā)酵液加入到含500mM 底物的IL發(fā)酵罐中反應(yīng)40min，終產(chǎn)量達(dá)到67. 9g/L。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)目前生物轉(zhuǎn)化法獲得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成本高，產(chǎn)量較低的缺陷，本發(fā) 明要解決的問題是提供一種使含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性 增強(qiáng)的方法。
[0005] 本發(fā)明為了高效利用氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，提供了一 種使宿主菌中的氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶合成基因的拷貝數(shù)增加的方法，利用該方法可高效生 產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
[0006] 本發(fā)明是一種使含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強(qiáng) 的方法。其特征是：含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)是指在一定pH 值的水溶液中，作用于游離的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，生成L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺的具有氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)的基因片段重組到載體里并轉(zhuǎn)入進(jìn)宿主菌，得到 帶有重組DNA并且使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強(qiáng)的宿主菌，經(jīng)過以下階 段（1)培養(yǎng)大量表達(dá)氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌細(xì)胞；（2)過量表達(dá)階段（1)中 的氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶；（3)將階段（2)所得作為粗酶源，加入到含有L-谷氨酰胺和L-丙 氨酸甲酯鹽酸鹽底物氨基酸的一定pH值的水溶液中反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的 尚效生廣。
[0007] 上述的氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶是在一定pH條件下，可使游離的L-谷氨酰胺和L-丙 氨酸甲酯鹽酸鹽轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶。
[0008] 上述的宿主菌除了大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等屬的微生 物菌珠外，還可以使用酵母菌或者動(dòng)物細(xì)胞宿主等。
[0009] 上述的宿主菌以大腸桿菌等作為宿主菌時(shí)，氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)載體在微生 物中獨(dú)立復(fù)制的同時(shí)，最好由啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)錄終 止序列組成。
[0010] 上述的宿主菌以大腸桿菌為宿主菌時(shí)，表達(dá)載體有pET21a、PUC19、pET28a等質(zhì) 粒。
[0011] 上述的表達(dá)載體中啟動(dòng)子可采用Iac啟動(dòng)子、PL、trp啟動(dòng)子、trp串聯(lián)啟動(dòng)子或 者T7啟動(dòng)子等。
[0012] 上述的表達(dá)載體中核糖體結(jié)合序列，只要在大腸桿菌等宿主中能表達(dá)即可，核糖 體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子之前保留適當(dāng)?shù)木嚯x
[0013] 上述的宿主菌以大腸桿菌為宿主時(shí)，可使用大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109、大 腸桿菌BL21 (DE3)、大腸桿菌W3310、大腸桿菌SCSllO等。
[0014] 上述的的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強(qiáng)的方法是通過使宿主菌 中的氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因的拷貝數(shù)增加來實(shí)現(xiàn)。
[0015] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強(qiáng)的方法中宿主菌中的氨基 酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因的拷貝數(shù)增加是通過導(dǎo)入經(jīng)密碼子優(yōu)化后的氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基 因來實(shí)現(xiàn)的。
[0016] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法，為了獲得含有本發(fā)明中用到的產(chǎn)酶的 宿主，例如重組棒狀桿菌、重組大腸桿菌、重組酵母菌等的細(xì)胞培養(yǎng)物，只要其能夠在合適 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物就可以了，對(duì)用于此目的的培養(yǎng)基，只要其能夠讓微生物正常生長(zhǎng)， 就沒有特別限制。該培養(yǎng)基可以是含有必要的普通碳源、有機(jī)氮無機(jī)氮源、磷源、無機(jī)離子 和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源的普通培養(yǎng)基。比如，只要該微生物能利用，就能夠使用任何碳源，能使用的 碳源的具體實(shí)施例，包括糖類諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉，醇類包括乙醇、山梨醇 和甘油，有機(jī)酸及其鹽包括檸檬酸、琥珀酸、乙酸和丙酸，碳?xì)浠衔锇ㄊ灱捌浠旌衔铩?br> [0017] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法，能使用的有機(jī)氮源實(shí)施例包括胰蛋白 胨、酵母膏、牛肉膏、酵母提取物等等，無機(jī)氮源諸如硫酸銨和氯化銨，延胡索酸銨鹽和檸檬 酸銨鹽，另外，培養(yǎng)基中用到的普通氮源，例如無機(jī)鹽、痕量金屬鹽和維生素，也能適宜的被 混合和使用。
[0018] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法中，作為無機(jī)鹽可使用磷酸氫二鉀、磷 酸二氫鉀、硫酸鎂等。
[0019] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法中，在培養(yǎng)時(shí)宿主采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的 表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，根據(jù)需要在培養(yǎng)基中補(bǔ)加誘導(dǎo)物。如果使用Iac啟動(dòng)子或者T 7啟動(dòng)子的表達(dá) 質(zhì)粒，在培養(yǎng)基中補(bǔ)加乳糖或者IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）等，而使用色氨 酸啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，需在培養(yǎng)基中補(bǔ)加吲哚丙烯酸（IAA)。
[0020] 本發(fā)明所提供的使含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增 強(qiáng)的方法，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖L pEAM330質(zhì)粒圖譜
[0022] 圖 2. pUC19-phoC-SAET 質(zhì)粒圖譜
[0023] 圖3. PCR產(chǎn)物電泳圖

【具體實(shí)施方式】
[0024] 一般性說明：實(shí)施例所提及的酶均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒與PCR產(chǎn) 物純化試劑盒以及膠回收試劑盒均購自上海生物工程有限公司，操作完全按照相應(yīng)說明進(jìn) 行。全基因合成由上海旭冠公司完成。
[0025] LB 培養(yǎng)基（％) :1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1 % NaCl，pH 7. 0-7. 2。
[0026] Amp抗性平板：1%胰蛋白胨，0. 5%酵母抽提物，1% NaCl，1. 5%瓊脂糖，氨芐青霉 素 50 μ g/ml〇
[0027] 5XKCM(大腸桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液）：0· 5M KC1，0. 15M CaC12,0. 25M MgC12。
[0028] L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活測(cè)定：取0. 5ml的發(fā)酵液尚心去上清，加入0. 5mL 含有底物氨基酸的pH = 9. 0的IOOmM硼酸-NaOH緩沖溶液中（底物氨基酸濃度為：IOOmM Gln，和 IOOmM Ala-OMe. HC1)，混勻，25°C反應(yīng) 5min，加入等體積的 I. 7% (ν/ν)Η3Ρ04溶液終 止反應(yīng)。用0. 22 μ L的有機(jī)系濾膜過濾處理，OPA衍生后用HPLC測(cè)定L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺濃度，從而計(jì)算出酶活。
[0029] L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產(chǎn)量測(cè)定：取0. 5ml的發(fā)酵液離心去上清，加入0. 5mL含 有底物氨基酸的pH = 9的水溶液中（底物氨基酸濃度為：IOOmM Gln，和IOOmM Ala-OMe. HC1)，混勻，25°C反應(yīng)2h，加入等體積的I. 7% (VZV)H3PO4溶液終止反應(yīng)。用0. 22 μ L的有 機(jī)系濾膜過濾處理，OPA衍生后用HPLC測(cè)定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺濃度。
[0030] 實(shí)施例1 :氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶基因序列的設(shè)計(jì)
[0031] 根據(jù)大腸桿菌的密碼子使用頻率來優(yōu)化基因密碼子，消除低使用率的密碼子，同 時(shí)利用同義轉(zhuǎn)化方法消除EcoRI酶切位點(diǎn)，為了便于將氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因連接到其 他質(zhì)粒載體上，因此在終止子后面插入一個(gè)酶切位點(diǎn)BamH I (GGATCC)。
[0032] 考慮到mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，首先要保證AUG起始密碼子及其后的幾個(gè)堿基組成的密 碼子翻譯口袋呈打開狀態(tài)，降低核糖體結(jié)合到mRNA上的能勢(shì)，使得核糖體能夠順利地沿著 起始密碼子向后翻譯。
[0033] 本實(shí)施方式中氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因序列的原始序列，見Genbank ACCESSI0NAB610978,優(yōu)化后的氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶序列見SEQ ID N0:1。
[0034] 實(shí)施例2 :磷酸鹽啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)
[0035] 磷酸鹽啟動(dòng)子來源于PEAM330質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜如說明書附圖1，該質(zhì)粒的磷酸鹽啟 動(dòng)子來源于大腸桿菌K12菌株的磷酸鹽操縱子，是一個(gè)適合大量積累微生物菌體的弱啟動(dòng) 子，為了便于將磷酸鹽啟動(dòng)子和氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶連接到質(zhì)粒載體上，在啟動(dòng)子上游插 入一個(gè)EcoR 1酶切位點(diǎn)（GAATTC)，磷酸啟動(dòng)子序列見SEQ ID N0:2。
[0036] 將實(shí)施例1方式中優(yōu)化的氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因序列和實(shí)施例2方式中的磷 酸鹽啟動(dòng)子直接相連一起提交給上海旭冠公司人工合成并連接到載體PUC19上，得到質(zhì)粒 pUC19-phoC-SAET，質(zhì)粒圖譜如說明書附圖2。
[0037] 實(shí)施例3 :氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0038] 以質(zhì)粒pUC19-phoC-SAET為模板，利用引物
[0039] CAGAAGCTTATGAAAAACACTATAAGCT 和
[0040] CGAGGATCCTTAGTCTTTCAGAACAGAA，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。得到長(zhǎng)度為 1800bp 左右的 DNA 片段，PCR產(chǎn)物電泳圖如圖3所示。
[0041] (I) JM109/pUC19-phoC-SAET 的構(gòu)建
[0042] 將實(shí)施案例1，2中基因合成的質(zhì)粒pUC19-ph〇C-SAET轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受 態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化過程為：將3 μ L連接液加入至50 μ L的JM109感受態(tài)細(xì)胞中，然后再加入 10 μ L的5 XKCM緩沖液，混勻后，在冰上放置30min后，42。。熱激90s，然后在冰上放置5min 后，加入500 μ L的LB培養(yǎng)基，37 °C，220rpm培養(yǎng)60min后，涂布至Amp抗性平板上，培養(yǎng)12h 后，挑取單菌，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。然后進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證基因序列是否正確。從 而得到了構(gòu)建好的JM109/pUC19-phoC-SAET重組大腸桿菌。
[0043] (? JMl〇9/pUCl9-ptrp2_SAET 的構(gòu)建
[0044] 本實(shí)施方式中色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子序列為實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化并保藏；優(yōu)化后的色氨酸串聯(lián) 啟動(dòng)子序列見SEQ ID NO:3
[0045] 將實(shí)施案例3中PCR擴(kuò)增的SAET基因片段和載體pUC19-ptrp2-HYP (由實(shí)驗(yàn)室保 藏）用限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind III于37°C酶切2h，電泳，切膠回收目的條帶，兩片段在 T4連接酶的作用下16°C連接反應(yīng)16h，得到pUC19-ptrp2-SAET質(zhì)粒。連接體系為10 μ L :
[0046] 氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因片段：5 μ L
[0047] pUC19-ptrp2-HYP 膠回收片段：1 μ L
[0048] IOXbuffer ： IyL
[0049] Τ4 DNA Iigase ： IyL
[0050] ddH20: 2 UL
[0051] 16 °C連接過夜后，將3 μ L的連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化過 程為：將3 μ L連接液加入至50 μ L的JM109感受態(tài)細(xì)胞中，然后再加入10 μ L的5 X KCM緩 沖液，混勻后，在冰上放置30min后，42°C熱激90s，然后在冰上放置5min后，加入500 μ L的 LB培養(yǎng)基，37 °C，220rpm培養(yǎng)60min后，涂布至Amp抗性平板上，培養(yǎng)12h后，挑取單菌，過夜 培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。然后進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證基因序列是否正確。從而得到了構(gòu)建好的 pUC19-ptrp2-SAET重組質(zhì)粒。將測(cè)序正確的質(zhì)粒pUC19-ptrp2-SAET轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109 中，得到構(gòu)建好的重組大腸桿菌JM109/pUC19-ptrp2-SAET。
[0052] 實(shí)施例4 :L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的檢測(cè)
[0053] OPA衍生方法：50yL樣品，加入200 yL甲醇，200 yL 0· ImM四硼酸鈉，加入50yL 的衍生試劑（50mg 0PA，加入4. 5mL甲醇溶解，加入500ul 0. ImM四硼酸鈉，加入50 μ L的巰 基乙醇，混勻后置4°C保存），于37°C恒溫水浴鍋中加熱衍生25min。
[0054] HPLC檢測(cè)方法：日立I HPLC系統(tǒng)（輸液泵、熒光檢測(cè)器，柱溫箱，進(jìn)樣器，數(shù)字記 錄及處理裝置），1&七618乂-131^(^(]18(25〇111111\4.6111111，5以111)，操作時(shí)柱溫控制在40 <€。流 動(dòng)相：含17 %乙腈的磷酸緩沖液（pH 7. 2)，流速：lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)338nm，發(fā) 射波長(zhǎng)450nm〇
[0055] 實(shí)施例5 :重組菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0056] 搖瓶培養(yǎng)：挑取重組大腸桿菌單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素 50 48/1^)中，30°〇、220印111培養(yǎng)811后，按5%接種量接入含有251^發(fā)酵培養(yǎng)基（2(^/1葡 萄糖，l〇g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L硫酸銨，lg/L磷酸氫二鉀，3g/L磷酸二氫鉀， 〇. 5g/L硫酸鎂）的250mL搖瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床中22°C、220rpm培養(yǎng)20h。取發(fā)酵液測(cè)定 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺濃度。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的測(cè)定方法詳見實(shí)施方式一般性說 明。發(fā)酵結(jié)果顯示，重組大腸桿菌JM109/pUC19-ph 〇C-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺產(chǎn)量 達(dá)到29mg/L，重組大腸桿菌JM109/pUC19-ptrp2-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺產(chǎn)量達(dá)到 32mg/L〇
[0057]
[0058」

【權(quán)利要求】
1. 一種利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其中，利用重組大腸桿 菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是通過將具有氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的基因片 段重組到載體上并轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞，得到的具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成活性的重 組微生物。
2. 權(quán)利要求1所述的利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在 于通過優(yōu)化氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因的密碼子，并使重組微生物中的經(jīng)密碼子優(yōu)化后的氨 基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因的拷貝數(shù)增加來實(shí)現(xiàn)。
3. 權(quán)利要求2所述的重組微生物中的氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因的拷貝數(shù)增加是通過 將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶基因連接到多拷貝質(zhì)粒中來實(shí)現(xiàn)的。
4. 權(quán)利要求3所述的多拷貝質(zhì)粒包括但不局限于pUC19、pKYPIO等。 5. L-丙氨酰-L-谷氨酰的生產(chǎn)方法，其特征是將權(quán)利要求1、2、3所述的重組微生物在 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)物、菌體或者它們的處理物作為酶源，在一定pH值的水溶液 中，作用于游離的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，再從 該水性介質(zhì)中提取生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
6. 權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征是水性介質(zhì)是一定pH值的水溶液。
7. 權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征是向水性介質(zhì)中添加 L-谷氨酰胺和L-丙氨酸 甲酯鹽酸鹽兩個(gè)底物。
8. 權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于菌體培養(yǎng)和酶催化反應(yīng)分兩步進(jìn)行。
9. 權(quán)利要求1、2、3、5所述的重組微生物包括但不局限于大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、假 單胞菌屬。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104480172SQ201410663050
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】張震宇, 何艷春, 夏紫薇, 王宇婷 申請(qǐng)人:江南大學(xué)