一株高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢及其培養(yǎng)方法，屬生物科學(xué)領(lǐng)域。該菌株已于2014年5月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC No.9046。本發(fā)明通過固體斜面培養(yǎng)、種子及發(fā)酵培養(yǎng)得菌絲體，然后抽濾烘干得菌粉，通過檢測發(fā)現(xiàn)其冬蟲夏草多糖、蟲草酸、蟲草素等有效成分含量均高于天然冬蟲夏草，尤其是冬蟲夏草多糖含量可達(dá)10-11%，為進(jìn)一步制備冬蟲夏草多糖及系列產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。CGMCC No.904620140529
【專利說明】一株高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢及其培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢 (Hisutella sinensis)及其培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草又名中華蟲草，是冬蟲夏草菌寄生于高山草甸中的蝠蛾幼蟲，使幼蟲身 軀僵化，即冬蟲夏草菌的子實體與僵蟲菌核構(gòu)成的復(fù)合體，屬于可食用的真菌。冬蟲夏草是 我國一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多重功效。
[0003] 冬蟲夏草中含量最高的活性物質(zhì)是冬蟲夏草多糖，因其可以抗氧化、抗腫瘤和增 強(qiáng)免疫力等功效而受廣大人群青睞。冬蟲夏草多糖是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、 巖藻糖等組成的多聚糖。冬蟲夏草多糖有固本培元、扶正祛邪的作用，能調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、 護(hù)腎、延緩衰老、抗疲勞、調(diào)節(jié)脂代謝與糖代謝、抗肝纖維化和抗輻射等多種功能，是值得挖 掘的一大生物寶庫。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢及其培養(yǎng)方法。從一株 西藏冬蟲夏草子實體中分離到中國被毛孢（Hisutella sinensis)M_010。該菌種通過逐級 培養(yǎng)，獲得菌絲體，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)菌絲體中冬蟲夏草多糖含量遠(yuǎn)高于天然冬蟲夏草。
[0005] 為了達(dá)成上述目的之一，本發(fā)明可通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)：
[0006] -株絲狀真菌M-010,于2014年5月29日向中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心（CGMCC)申請菌種鑒定并提交保藏，經(jīng)鑒定該菌株為中國被毛孢（Hisutella sinensis)，保藏編號：CGMCC No. 9046,保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，分類 命名：冬蟲夏草 Ophiocordyceps sinensis。
[0007] rRNA 基因 ITS1-5. 8S-ITS2 區(qū)序列如下：
[0008] CACTGGAGGGTGTGGTGGTTTCACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCCGGTGCGAGGTTCTCAGCGAGCT ACTGCGCAGGGGAGCCGCGGCGGGGTCGCCACTGCGTTTAGGGGGCGGCGCGGGGCCGTGACCCCCAAGGCCGGGCC CCGCCGCCGCGAGGCGGGGGGCTCGAGGGTTGAGATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAGTGCTGGCGGGCGC AATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCAT CGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGCTTGCTTCTTGACTGAGAGATGCCACTGCG ACAGGAGGGTCTGGGGGTCCTCCGGCGGGCGCCCTGGTCCGGGCCCTGGGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAGGCAAC TGCTGTGGTGTTCGCAGGGGGTTTGGGAGTGGTGACTCGATAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTG TTA
[0009] 為了達(dá)成上述目的之二，本發(fā)明可通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)：
[0010] -種高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0011] (1)菌種斜面培養(yǎng)
[0012] 挑取中國被毛孢M(jìn)-010斜面培養(yǎng)的菌絲體一環(huán)，接種于新鮮斜面培養(yǎng)基，置于恒 溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15-25°C，培養(yǎng)時間為5-15天；斜面培養(yǎng)基選用馬鈴薯培養(yǎng) 基；
[0013] (2)菌種種子培養(yǎng)
[0014] 挑取一環(huán)步驟（1)的新鮮斜面生長的菌絲體于液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，培養(yǎng)周期為5-10天；
[0015] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖1-3%、蛋白胨0.2-1. 0%、復(fù)合氨基酸0.01-0. 1 %、磷酸二氫 鉀0· 1-0. 3%、七水硫酸鎂0.02-0. 08%，其余為水，pH自然；
[0016] (3)菌種發(fā)酵培養(yǎng)
[0017] 以5-20% (V/V)的接種量將步驟（2)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為 15-25°C，發(fā)酵周期為7-10天；
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2-5%、蛋白胨0.5-1. 5%、復(fù)合氨基酸0.01-0. 1 %、磷酸二氫 鉀0.2-0. 5%、七水硫酸鎂0.05-0. 1%，其余為水，pH自然；
[0019] (4)抽濾、烘干將步驟（3)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體通過板框過濾，棄去濾液，獲得濕 菌絲體，50-70°C烘干粉碎后得菌絲體粉。
[0020] 所述高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢M(jìn)-010經(jīng)上述方法培養(yǎng)，獲得冬蟲夏草菌 粉，采用下述方法分別測定該菌種產(chǎn)冬蟲夏草多糖、蟲草酸、蟲草素三類活性物質(zhì)的含量：
[0021] (1)冬蟲夏草多糖含量測定：將培養(yǎng)獲得的菌絲體通過水提醇沉法獲得冬蟲夏草 多糖，采用苯酚硫酸法測定冬蟲夏草多糖的量。
[0022] (2)蟲草酸含量測定：采用液相色譜法。
[0023] (3)蟲草素含量測定：采用液相色譜法。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] (1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一株高產(chǎn)多糖的絲狀真菌M-010,經(jīng)過中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心（CGMCC)鑒定為中國被毛孢（Hisutella sinensis)，保藏編號： CGMCC No. 9046。
[0026] (2)本發(fā)明的中國被毛孢M(jìn)-010經(jīng)液體擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得的冬蟲夏草菌粉產(chǎn)量高，且 冬蟲夏草多糖、蟲草酸、蟲草素等有效營養(yǎng)成分高于天然冬蟲夏草。
[0027] (3)該菌株能高產(chǎn)冬蟲夏草多糖，產(chǎn)量可達(dá)10-11%，為冬蟲夏草多糖進(jìn)一步開發(fā) 利用奠定了基礎(chǔ)。

【具體實施方式】
[0028] 以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，僅僅是為清楚說明本發(fā)明所作的舉例，但 不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對所屬領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員來說，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的變化、變動、修改或替換，仍屬于本發(fā)明的范 圍。
[0029] 實施例1中國被毛孢的分離與培養(yǎng)
[0030] 1.分尚培養(yǎng)基
[0031] 馬鈴薯20%、產(chǎn)地土 1.8%、蛋白胨0.3%、葡萄糖1.5%、瓊脂2%。
[0032] 2.菌種的分離
[0033] 在海拔4500m的西藏那曲地區(qū)羌塘草原上采集到冬蟲夏草子實體，對蟲草子實體 的子座頭、子座柄和菌核采用75%酒精進(jìn)行表面消毒，用滅菌后的研缽進(jìn)行研磨成漿，然后 進(jìn)行常規(guī)梯度稀釋，獲得1〇_1、1〇_2、1〇_3、1〇_4、1〇_ 5共5個稀釋度，分別吸取0.11^稀釋液涂 布于分離培養(yǎng)基，倒置于隔水式培養(yǎng)箱中，于23°C ±1°C下培養(yǎng)4天，即發(fā)現(xiàn)1(Γ2、1(Γ3、1(Γ4 的稀釋度平板上長出白色菌落。
[0034] 3.菌株的純化
[0035] 將10'10'KT4的稀釋度平板上長出的單個菌落分別挑取到新的培養(yǎng)基平板上， 進(jìn)行傳代培養(yǎng)4天，發(fā)現(xiàn)菌落斑、形態(tài)、大小一致，并通過顯微鏡對菌絲進(jìn)行鏡檢，菌種單純 無雜菌污染。
[0036] 4、純化菌株的斜面培養(yǎng)
[0037] 接種上述純化菌株于馬鈴薯培養(yǎng)基斜面，于15_25°C條件下培養(yǎng)5-15天。
[0038] 實施例2中國被毛孢的液體培養(yǎng)
[0039] L培養(yǎng)基
[0040] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨0.6%、復(fù)合氨基酸0.05%、磷酸二氫鉀0. 1 %、七 水硫酸鎂0.03%，pH自然。
[0041] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2. 5%、蛋白胨0. 7%、復(fù)合氨基酸0. 06%、磷酸二氫鉀0. 2%、 七水硫酸鎂：〇. 05 %，pH自然。
[0042] 2.培養(yǎng)方法
[0043] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25°C，培養(yǎng)10天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 5%。
[0044] 以10% (V/V)的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25°C，發(fā)酵周 期為7天，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到1. 5%。
[0045] 實施例3
[0046] L培養(yǎng)基
[0047] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖1 %、蛋白胨0. 2%、復(fù)合氨基酸0. 01 %、磷酸二氫鉀0. 3%、七 水硫酸鎂0.02%，pH自然。
[0048] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 %、蛋白胨0. 5 %、復(fù)合氨基酸0. 01 %、磷酸二氫鉀0. 5 %、七 水硫酸鎂〇. 1%，PH自然。
[0049] 2.培養(yǎng)方法
[0050] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 15°C，培養(yǎng)5天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 3 %。
[0051] 以5% (V/V)的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為15°C，發(fā)酵周期 為10天，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到1. 2 %。
[0052] 實施例4
[0053] 1.培養(yǎng)基
[0054] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1.0%、復(fù)合氨基酸0. 1%、磷酸二氫鉀0.2%、七 水硫酸鎂0.08%，pH自然。
[0055] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%、蛋白胨1.5%、復(fù)合氨基酸0. 1%、磷酸二氫鉀0.5%、七 水硫酸鎂〇. 1%，PH自然。
[0056] 2.培養(yǎng)方法
[0057] 挑取一環(huán)新鮮斜面生長的菌絲體，于液體種子培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 20°C，培養(yǎng)8天，菌絲體干重達(dá)到發(fā)酵液的0. 8 %。
[0058] 以20% (V/V)的接種量將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20°C，發(fā)酵周 期為8天，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體干重得率達(dá)到1. 8 %。
[0059] 實施例5中國被毛孢有效營養(yǎng)成分分析
[0060] 將中國被毛孢進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，抽濾、烘干后，得到菌絲粉。分別對該菌絲體粉 和天然冬蟲夏草的冬蟲夏草多糖、蟲草酸、蟲草素的含量進(jìn)行檢測。
[0061] 1.冬蟲夏草多糖測定
[0062] 采用苯酚硫酸法，測定上述實施例液體培養(yǎng)的菌絲體粉的冬蟲夏草多糖含量為 10. 6%、10. 1 %和11. 0%，測定天然冬蟲夏草中冬蟲夏草多糖的含量為7. 8%，菌絲體粉比 天然冬蟲夏草中冬蟲夏草多糖含量分別提高了 35. 9%、29. 4%和41%。
[0063] 2.蟲草酸測定
[0064] 采用液相色譜法進(jìn)行蟲草酸的測定，色譜柱為Inertsil ODS-3 (4. 6mmX 250mm， 5 μ m)，柱溫30°C。檢測器為示差折光檢測器。流動相為：乙腈：水= 80:20,梯度洗脫，
[0065] 流速 0· 8mL/min。
[0066] 測定上述實施例液體培養(yǎng)的菌絲體粉的蟲草酸的含量為7. 8%、7. 7%和8. 0%， 天然冬蟲夏草中蟲草酸的含量為7. 5 %，菌絲體粉比天然冬蟲夏草中蟲草酸含量分別提高 了 4. 0%、1· 1%和 6%。
[0067] 3.蟲草素測定
[0068] 采用液相色譜法進(jìn)行蟲草素的測定，色譜柱為Inertsil ODS-3 (4. 6mmX 250mm， 5μπι)，柱溫30°C。檢測器為二極管陣列紫外檢測器，檢測波長260nm。流動相乙腈：水= 80:20，流速 0. 8mT,/min。
[0069] 測定上述實施例液體培養(yǎng)的菌絲體粉的蟲草素含量為0. 56%、0. 57 %和0. 59%， 天然冬蟲夏草中蟲草素的含量為〇. 48%，菌絲體粉比天然冬蟲夏草中蟲草素含量提高了 16. 7%、18· 7%和 22. 9%。
[0070] 此外，對該菌絲體粉的其他各項營養(yǎng)成分與天然冬蟲夏草進(jìn)行了比對，如下表。
[0071]

【權(quán)利要求】
1. 一株高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢M(jìn)-010,已于2014年5月29日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC No. 9046。
2. -種高產(chǎn)冬蟲夏草多糖的中國被毛孢的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 固體斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基選用馬鈴薯培養(yǎng)基；接種中國被毛孢菌種M-010于馬 鈴薯培養(yǎng)基斜面，在15_25°C條件下培養(yǎng)5-15天； (2) 種子培養(yǎng)接種步驟（1)菌絲至種子培養(yǎng)基中，于15-25°C條件下培養(yǎng)5-10天； 種子培養(yǎng)基：葡萄糖1-3%、蛋白胨0.2-1.0%、復(fù)合氨基酸0.01-0. 1%、磷酸二氫鉀 0? 1-0. 3%、七水硫酸鎂0? 02-0. 08%，其余為水，pH自然； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)按5-20% (V/V)接種量接種步驟（2)的種子菌液至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 15-25°C條件下培養(yǎng)7-10天； 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2-5%、蛋白胨0. 5-1. 5%、復(fù)合氨基酸0. 01-0. 1%、磷酸二氫鉀 0? 2-0. 5%、七水硫酸鎂0? 05-0. 1%，其余為水，pH自然； (4) 抽濾、烘干將步驟（3)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體進(jìn)行抽濾、烘干得菌絲粉。
【文檔編號】C12P19/04GK104480021SQ201410664856
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】高艷華, 任明, 袁博 申請人:濟(jì)南國力生物科技有限公司