纖維素酶蛋白的分離提純方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及到纖維素酶分離純化方法。本方法首先調(diào)節(jié)纖維素酶蛋白濃度至3mg/mL～8mg/mL，通過高精度強陰離子柱層析，利用線性與梯度相結(jié)合的洗脫方式對纖維素酶液進行初步分離，真空冷凍濃縮至凍干粉，用pH4.0～6.0緩沖液溶解，然后再通過凝膠柱層析，并采用蛋白電泳進行純度檢測，最后通過質(zhì)譜檢測，從而達到高效、精確分離提純纖維素酶單酶組分的目的。與現(xiàn)有的方法對比，本方法可以實現(xiàn)酶蛋白單一組分的快速高效和精確分離，并能一次性獲得多個單酶組分。
【專利說明】纖維素酶蛋白的分離提純方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及到單酶分離提純方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是一類多組分酶的總稱，能夠?qū)㈦y以被生物利用的纖維素水解為利于被 生物利用的葡萄糖，因此被認(rèn)為是潛力巨大的酶制劑之一。纖維素酶屬于糖苷水解酶，能夠 降解纖維素的纖維素酶系至少包括三類組分：1、內(nèi)切型-β -葡聚糖酶（endo-Ι，4-β-D-gl ucanase, EC3. 2. I. 4) ;2、外切型-β -葡聚糖酶（exo-1, 4- β -D-glucanase, EC 3· 2. I. 91); 3、β -葡萄糖苷酶（β -1，4-D-glucosidase, EC 3. 2. I. 21)。而纖維素主體由批喃葡萄糖構(gòu) 成，并以β -1，4糖苷鍵連接，形成的大分子線性多聚物，單體為纖維二糖分子，主要由結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定、微生物難以降解的結(jié)晶區(qū)和結(jié)構(gòu)疏松、微生物容易降解的非結(jié)晶區(qū)兩部分構(gòu)成。
[0003] 纖維素酶系中的酶組分并不是單獨作用于纖維素從而水解纖維素的，它們通過相 互協(xié)同作用實現(xiàn)水解功能，其中內(nèi)切型-葡聚糖酶作用于非結(jié)晶區(qū)，水解β -1，4糖苷 鍵，可將線性纖維素多聚物截斷生成大量帶非還原性末端的纖維素小分子；外切型_β -葡 聚糖酶水解1，4-β-D-糖苷鍵，作用于線性纖維素多聚物的末端，生成單個纖維二糖分子； β_葡萄糖苷酶則將纖維二糖水解成為葡萄糖。通過纖維素酶復(fù)合酶組分的相互協(xié)同作用， 可以將地球上最豐富的生物高聚物一纖維素，轉(zhuǎn)化為微生物可以輕易利用的葡萄糖分子， 并通過發(fā)酵產(chǎn)生生物燃料，用以緩解目前的能源短缺的問題。
[0004] 纖維素酶的來源廣泛，能產(chǎn)生纖維素酶的生物包括昆蟲、軟體動物、原生動物、細 菌和真菌，纖維素酶最為方便的來源就是采用微生物作為纖維素酶的來源。然而，這些自產(chǎn) 酶天生具有一定的配比缺陷，比如：里氏木霉的纖維素酶中CBH II和β -葡萄糖苷酶表達 量不足，而黑曲霉所產(chǎn)酶中各酶的分泌高峰期不同，這些因素均對纖維素水解有限制作用。 所以，優(yōu)化定制纖維素酶，使各組分達到最佳配比，才能在最少酶用量時獲得最優(yōu)的水解效 果。可見，對纖維素酶復(fù)合酶液進行單酶分離提純是十分必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供纖維素酶酶蛋白的分離提純方法，通過高精度強陰離子柱 過柱、真空冷凍濃縮以及凝膠柱過柱，對纖維素復(fù)合酶液進行分離，并使之達到電泳純。為 分析纖維素酶協(xié)同作用，提高纖維素酶酶解效率奠定了基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)解決方法包括的纖維素酶蛋白的分離提純方法包括以下步驟：
[0007] 1、纖維素酶液蛋白濃度調(diào)節(jié)：一般而言，商業(yè)纖維素酶制劑十分粘稠，色澤厚重， 微生物自產(chǎn)酶或復(fù)配酶酶蛋白含量較低，均不滿足柱層析的要求，對酸性纖維素酶液而言， 用pH4. 0?6. 0緩沖溶液，例如檸檬酸緩沖液、檸檬酸-磷酸緩沖液或乙酸鈉緩沖液，將纖 維素酶蛋白含量調(diào)節(jié)至3mg/mL?8mg/mL較為合適。
[0008] 2、純化：對稀釋后的纖維素酶液進行陰離子交換柱層析色譜，采用高精度強陰離 子交換柱，例如Mono Q 5/50GL或Hitrap Q HP，利用線性與梯度洗脫結(jié)合的方式對纖維素 酶液進行分離，層析緩沖液為pH7. O?9. O緩沖溶液，例如Tris-HCl緩沖液。
[0009] 3、電泳純條帶檢測：對接收液進行SDS-PAGE檢測，當(dāng)接收管所對應(yīng)條帶為單一條 帶時，其接收管直接進入下一步的質(zhì)譜鑒定；當(dāng)接收管對應(yīng)條帶雜而多時，其接收管進行真 空冷凍濃縮過夜，將凍干酶粉用PH4. 0?6. 0緩沖溶液進行溶解，再采用凝膠柱層析，例如 Surperdex? 7510/300L 或 Surperdex? 20010/300L，層析緩沖液為 pH4. 0 ?6. 0 緩沖溶液。 將所得接收液同樣進行SDS-PAGE檢測，保留單條帶所對應(yīng)的接收管。
[0010] 4、質(zhì)譜檢測：對所有單條帶對應(yīng)的接收管均進行質(zhì)譜檢測，即可得到確切的單酶 組分。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 1、本方法操作周期短，分離工藝簡單，主要由陰離子柱層析與凝膠柱層析組成，陰 離子柱層析耗時約3小時，凝膠柱層析耗時約6小時。
[0013] 2、采用高精度強陰離子交換柱，提高分離效率，通過SDS-PAGE與質(zhì)譜檢測，能夠 精確檢驗分離組分。
[0014] 3、在經(jīng)過陰離子柱層析與真空冷凍濃縮后，用pH4. 0?6. 0的緩沖液溶解，且凝膠 柱層析的緩沖液同樣使用ΡΗ4. 0?6. 0的緩沖液，使分離后所得酶蛋白處于適宜環(huán)境中，保 持酶蛋白活力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖I B液濃度控制0?20 %線性增加，洗脫體積為30CV
[0016] 圖2 B液濃度控制20?30 %線性增加，洗脫體積為20CV
[0017] 圖3 B液濃度控制30?50 %線性增加，洗脫體積為30CV
[0018] 圖4 Mono Q 5/50GL柱層析后對蛋白峰進行SDS-PAGE，其中，
[0019] 泳道1、2、3檢測的是圖1中的峰1，
[0020] 泳道4、5、6、7檢測的分別是圖2中的峰1、2、3、4，
[0021] 泳道8、9、10、11、12檢測的是圖3中的峰1、2、3、4、5。
[0022] 圖5對圖4第5泳道所對應(yīng)的接收液進行凝膠柱層析
[0023] 圖6對圖4第6泳道所對應(yīng)的接收液進行凝膠柱層析
[0024] 圖7對圖4第7泳道所對應(yīng)的接收液進行凝膠柱層析
[0025] 圖8 -次純化和兩次純化后所得蛋白峰SDS-PAGE，其中，
[0026] 泳道1、2檢測的是圖5中的峰1，
[0027] 泳道3、4檢測的是圖7中的峰1，
[0028] 泳道5、6檢測的是圖1中的峰1，
[0029] 泳道7檢測的是圖3中的峰5。
[0030] 圖9 B液濃度控制0?9 %線性增加，洗脫體積為IOCV
[0031] 圖10 B液濃度控制0?13 %線性增加，洗脫體積為20CV
[0032] 圖11 B液濃度控制20?30%線性增加，洗脫體積為20CV
[0033] 圖12 Mono Q 5/50GL柱層析后對蛋白峰進行SDS-PAGE，其中，
[0034] 泳道1檢測的是圖11中的峰1，
[0035] 泳道2、3檢測的是圖11中的峰2，
[0036] 泳道4檢測的是圖11中的峰3，
[0037] 泳道5檢測的是圖9中的峰1，
[0038] 泳道6、7、8、9檢測的分別是圖10中的峰1、2、3、4。
[0039] 圖13對圖4的第2泳道所對應(yīng)的蛋白接收液進行凝膠柱層析
[0040] 圖14對圖4的第4泳道所對應(yīng)的蛋白接收液進行凝膠柱層析
[0041] 圖15 -次純化和兩次純化后所得蛋白峰SDS-PAGE，其中，
[0042] 泳道1檢測的是圖11的峰3，
[0043] 泳道2檢測的是圖9中的峰1，
[0044] 泳道3、4檢測的是圖10中的峰2、3，
[0045] 泳道5、6檢測的是圖14中的峰1。

【具體實施方式】
[0046] 下面通過實例，對發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明。
[0047] 實施例1
[0048] 取商業(yè)酶制劑GC220原酶液適量，用50mM檸檬酸緩沖液（pH4. 8)稀釋纖維素酶蛋 白濃度至5. 4369mg/mL,用水系0. 45 μ m針頭式過濾器過濾一次,使用美國通用電氣醫(yī)療集 團生產(chǎn)的AKT avant蛋白分離儀，通過高精度強陰離子柱Mono Q 5/50GL將復(fù)合酶液進行 初步分離。其中：緩沖液A液是20mM Tris-HCl緩沖液（pH7. 5)，B液是含IM NaCl的A液， 上樣量為lmL，控制流速為0. 7mL/min。陰離子柱層析結(jié)果見圖1?3。
[0049] 通過高精度強陰離子交換柱Mono Q 5/50GL后，對蛋白峰進行SDS-PAGE檢測。檢 測結(jié)果見圖4。
[0050] 凝膠柱Surperdex? 75 10/300L上樣量為500yL，對第一次跑膠驗證后雜帶所 對應(yīng)的接收液進行真空冷凍干燥至凍干粉，用50mM檸檬酸緩沖液（pH4. 8)溶解，然后通過 Surperdex? 7510/300L凝膠柱層析，進行進一步純化，層析緩沖液為含有0. 15 M NaCl的 50mM檸檬酸緩沖液（pH4. 8)，控制流速為0. 8mL/min。凝膠柱層析結(jié)果見圖5?7。
[0051] 對這些蛋白進行SDS-PAGE預(yù)實驗后，將經(jīng)過一次純化得到的電泳純和二次純化 得到的電泳純條帶所對應(yīng)的接收液進行SDS-PAGE。結(jié)果見圖8。
[0052] 對圖8中的這些條帶進行質(zhì)譜檢測，快速鑒定蛋白種類。鑒定結(jié)果見下表。
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 纖維素纖維素酶蛋白的分離提純方法，其特征在于方法的步驟如下： 1) 纖維素酶液蛋白濃度調(diào)節(jié)：用PH4. 0?6. 0緩沖溶液將纖維素酶液調(diào)節(jié)至合適的蛋 白濃度。 2) 純化：對稀釋后的纖維素酶液進行陰離子交換柱層析，利用線性與梯度洗脫結(jié)合的 方式對纖維素酶液進行分離，層析緩沖液為pH7. 0?9. 0緩沖溶液。 3) 電泳純條帶檢測：對接收液進行SDS-PAGE檢測，當(dāng)接收管所對應(yīng)條帶為單一條帶 時，其接收管直接進入下一步的質(zhì)譜鑒定；當(dāng)接收管對應(yīng)條帶雜而多時，其接收管利用凝膠 柱層析進一步分離純化，同樣再進行SDS-PAGE檢測，對單條帶所對應(yīng)的接收管保留。 4) 質(zhì)譜鑒定：對所有單條帶對應(yīng)的接收管均進行質(zhì)譜檢測，即可得到確切的單酶組 分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其纖維素酶是指商業(yè)酶制 齊IJ、各種微生物發(fā)酵培養(yǎng)所產(chǎn)酶液或其復(fù)配的酶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟1)中所用的PH4.0? 6. 0緩沖液是指pH4. 0?6. 0能使酶蛋白處于適宜環(huán)境中，保持酶蛋白活力的緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟1)中調(diào)節(jié)纖維素酶液 蛋白濃度至3mg/mL?8mg/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟2)中所用的pH7.0? 9. 0緩沖液是指pH7. 0?9. 0能使酶蛋白顆粒帶負(fù)電荷的緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟2)中純化所用陰離子 交換柱是指Mono Q 5/50GL及能與纖維素酶蛋白發(fā)生離子交換作用的高精度強陰離子柱。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟3)中進一步分離純化 根據(jù)接收管條帶是否單一而定，當(dāng)接收管所對應(yīng)條帶為單一條帶時，其接收管直接進入下 一步的質(zhì)譜鑒定；當(dāng)接收管對應(yīng)條帶雜而多時，其接收管進行真空冷凍濃縮至凍干粉，再用 pH4. 0?6. 0緩沖溶液進行溶解，進行凝膠柱層析，層析緩沖液為pH4. 0?6. 0緩沖溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶蛋白的分離提純方法，其步驟3)中純化所用凝膠柱 是指Surperdex? 7510/300L及對纖維素酶蛋白起分子篩作用的葡聚糖凝膠層析柱。
【文檔編號】C12N9/42GK104371990SQ201410665840
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】孫付保, 白仁惠, 張云博, 張震宇, 沈松, 周邦煒 申請人:江南大學(xué)