一種防治老年癡呆的藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了小分子多肽TAT-siP-PTPN1-HA及其在制備治療或預(yù)防老年癡呆藥物中的應(yīng)用，利用人工合成TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和siP-PTPN1-HA的融合蛋白多肽TAT-siP-PTPN1-HA，TAT可以攜帶siP-PTPN1-HA蛋白多肽經(jīng)血液穿過血腦屏障被神經(jīng)元攝取，將其運(yùn)用到在體的老年癡呆模型上，可有效發(fā)揮其阻斷miR-124與非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1(protein tyrosine phosphatase,non-receptor type 1,PTPN1)3′-非編碼序列(3′-untranslated region,3′-UTR)結(jié)合的生物學(xué)作用，從而有效逆轉(zhuǎn)PTPN1表達(dá)，并改善老年癡呆模型動(dòng)物表現(xiàn)出的微管相關(guān)蛋白tau的過度磷酸化、淀粉樣蛋白沉積，以及動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙，為進(jìn)一步開發(fā)臨床治療老年癡呆的藥物提供了新的方向。
【專利說明】一種防治老年癡呆的藥物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)疾病治療藥物研發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種小分子多肽 TAT-siP-PTPNl-HA，還涉及小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA在制備治療或預(yù)防老年癡呆藥 物中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 老年性癡呆（Alzheimer Disease, AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要癥狀 表現(xiàn)為記憶力減退，認(rèn)知能力低下和思維遲鈍，且進(jìn)行性加重，最后生活不能自理而死亡， 病程一般8?10年。隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加快，AD的患病人數(shù)急劇上升，已成為威脅老 齡特別是高齡人口身心健康的嚴(yán)重疾病，并帶來了嚴(yán)重的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和家庭問題。
[0003] AD病人主要腦病理改變是形成大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurof ibriIIary tangleS，NFTs)和大量老年斑、其分子標(biāo)志物分別是異常磷酸化的tau蛋白和β-淀粉樣蛋 白（Αβ)。國外學(xué)者已采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在小鼠成功地復(fù)制出β-淀粉樣蛋白沉積形成的老 年斑樣病變，從而使得未來AD治療將減少A β沉積作為藥物干預(yù)的靶標(biāo)成為可能。NFTs的 數(shù)量與AD臨床癡呆程度正相關(guān)。因此，干預(yù)NFTs對(duì)AD的防治尤為重要。自從發(fā)現(xiàn)NFTs的 主要成分是異常、過度磷酸化的Tau蛋白聚集形成的雙螺旋絲以來，國內(nèi)外學(xué)者普遍公認(rèn)， 骨架蛋白tau的異常、過度磷酸化是NFTs形成的關(guān)鍵步驟。過度磷酸化tau蛋白的聚集不 僅以纏結(jié)的形式存在，它也是神經(jīng)氈纖絲和老年斑中的營養(yǎng)不良突起的主要成分。
[0004] 目前尚沒有針對(duì)老年性癡呆病理特征的特效治療藥物和方法，常用的減緩老年癡 呆發(fā)作藥物有：（1)改善膽堿神經(jīng)傳遞藥物：老年癡呆的一個(gè)主要原因是膽堿不足導(dǎo)致記 憶衰退。因此乙酰膽堿酯酶（AchE)抑制劑通過增強(qiáng)膽堿能作用在老年癡呆治療方面發(fā)揮 了重要作用；(2)改善腦血液循環(huán)和腦細(xì)胞代謝的藥物：此類藥物可以擴(kuò)張腦血管以改善 老年癡呆患者的糖、蛋白、核酸、脂質(zhì)等代謝障礙；（3)鈣拮抗劑：此類藥物易于通過血腦屏 障，選擇性擴(kuò)張腦血管，從而改善記憶和認(rèn)知功能；(4)激素類藥物：主要緩解女性患者的 癥狀。然而，這些藥物僅對(duì)中晚期老年性癡呆患者的癡呆癥狀有所輕度改善或延緩癡呆進(jìn) 展。因此研發(fā)新的針對(duì)老年性癡呆病理學(xué)特征的藥物，成為全球的期待。
[0005] TAT稱細(xì)胞穿膜多肽（cell penetrating peptides)，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高效運(yùn) 輸載體。TAT能夠穿透細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜，攜帶多肽、蛋白質(zhì)以及DNA分子等通過受體轉(zhuǎn)運(yùn)方 式進(jìn)入胞質(zhì)和胞核發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)。目前研宄顯示HIV-TAT，能夠穿過所有組織細(xì)胞， 且無明顯的毒副作用。TAT能將與之相連的多肽在數(shù)分鐘內(nèi)帶入細(xì)胞，而且可以跨越血腦屏 障進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，被帶入細(xì)胞的多肽則保留了它們?cè)械纳锘钚?，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。
[0006] 基于 申請(qǐng)人:最近的研宄與TAT技術(shù)， 申請(qǐng)人:合成了一個(gè)由與miR-124競爭性結(jié)合 到PTPNl的:V -UTR的氨基酸序列組成的膜滲透性小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA，通過運(yùn) 用到在體的老年癡呆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型上，有效發(fā)揮其阻斷miR-124與PTPNl的:V -UTR結(jié) 合的生物學(xué)作用，促進(jìn)PTPNl表達(dá)，改善老年癡呆模型動(dòng)物表現(xiàn)出的微管相關(guān)蛋白tau的過 度磷酸化、淀粉樣蛋白沉積，以及動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙，為進(jìn)一步開發(fā)臨床治療老年癡呆的 藥物提供了分子靶點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供了一種小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA，其序列為SEQ ID NO. 1 所示。本發(fā)明將 TAT 穿膜肽（GRKKRRQRRRPRQ)與 siP-PTPNl-HA (PYGCRVIQRIGNYVIQH VASNNVEKIGGYVIRHVGGYVIRHVGNYVIQHVGNYVIQHVGCRVIQRILYPYDVPDYA)連接，得到具有生物 活性的 TAT-siP-PTPNl-HA 多肽（SEQ ID NO. 1:M GRKKRRQRRRPRQPYGCRVIQRIGNYVIQHVASN NVEKIGGYVIRHVGGYVIRHVGNYVIQHVGNYVIQHVGCRVIQRILYPYDVPDYA)，利用 TAT 的穿膜功能將 siP-PTPNl-HA多肽輸送進(jìn)入血液穿過血腦屏障，并被大腦神經(jīng)細(xì)胞攝取從而發(fā)揮其生物學(xué) 功能。
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供了小分子多肽TAT-SiP-PTPNl-HA對(duì)應(yīng)的核苷酸序列， 具體為SEQIDN0·2所示（SEQIDN0·2:ATGGGTCGTAAGAAGCGTCGTCAGCGTCGTCGTCCTCGTCA GCCTTACGGTTGTCGTGTTATTCAGCGTATTGGTAATTACGTTATCCAGCACGTTGCTTCTAATAACGTTGAGAAAA TTGGTGGCTATGTTATCCGCCACGTTGGCGGCTACGTTATTCGTCACGTGGGCAATTACGTGATCCAGCATGTTGGT AATTATGTGATTCAACATGTGGGCTGCCGTGTGATTCAGCGTATTCTTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCAT GA)，但不局限于該序列，所有編碼TAT-siP-PTPNl-HA多肽的核苷酸序列都為本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA在制備治療 或預(yù)防老年癡呆藥物中的應(yīng)用，將其靜脈注射，發(fā)現(xiàn)其可有效改善老年癡呆模型動(dòng)物表現(xiàn) 出的微管相關(guān)蛋白tau的過度磷酸化、淀粉樣蛋白沉積，以及動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙，為進(jìn)一 步開發(fā)臨床治療老年癡呆的藥物提供了分子靶點(diǎn)。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)措施是： 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)，老年癡呆模型動(dòng)物 中miR-124和PTPNl的:V -UTR相互結(jié)合，并介導(dǎo)下游微管相關(guān)蛋白tau的過度磷酸化、 淀粉樣蛋白沉積，以及動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙。阻斷miR-124和PTPNl的:V -UTR相互結(jié)合， 能有效改善上述癥狀。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)， 申請(qǐng)人:將TAT穿膜肽（GRKKRRQRRRPRQ)與siP-PTP Nl-HA(PYGCRVIQRIGNYVIQHVASNNVEKIGGYVIRHVGGYVIRHVGNYVIQHVGNYVIQHVGCRVIQRILYPY DVPDYA)連接，得到具有生物活性的TAT-siP-PTPNl-HA多肽，通過在體靜脈注射方式，使 TAT-siP-PTPNl-HA多肽進(jìn)入血液穿過血腦屏障并被大腦神經(jīng)細(xì)胞攝取發(fā)揮其生物學(xué)功能。
[0011] 小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA，其序列如下：
[0012] MGRKKRRQRRRPRQPYGCRVIQRIGNYVIQHVASNNVEKIGGYVIRHVGGYVIRHVGNYVIQHVGNYVI QHVGCRVIQRILYPYDVPDYA。
[0013] TAT-siP-PTPNl-HA 的對(duì)照為 TAT-scramble-HA，其序列為：
[0014] MGRKKRRQRRRPRQLIRQIVRCGVHQIVYNGVHQIVYNGVHRIVYGGVHRIVYGGIKEVNNSAVHQIVY NGIRQIVRCGYPYPYDVPDYA。
[0015] TAT-siP-PTPNl-HA多肽和對(duì)照TAT-scramble-HA由 申請(qǐng)人:通過原核表達(dá)、收集、 純化得到。
[0016] 小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA在制備治療或預(yù)防老年癡呆藥物的應(yīng)用，其應(yīng)用 過程如下：
[0017] TAT-siP-PTPNl-HA在老年癡呆動(dòng)物模型的應(yīng)用
[0018] Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠是公認(rèn)的老年癡呆動(dòng)物模型。通過免疫印跡檢測tau蛋白磷酸化 變化，ELISA檢測Αβ含量，水迷宮實(shí)驗(yàn)、長時(shí)程增強(qiáng)、高爾基染色檢測轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記 憶能力。對(duì)12月齡Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠尾靜脈單次注射10mg/kg的TAT-siP-PTPNl-HA 溶液，1周后，動(dòng)物進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，或者處死，取出腦組織。結(jié)果顯示其可有效改善老年癡 呆模型動(dòng)物Tg2576小鼠表現(xiàn)出的微管相關(guān)蛋白tau的過度磷酸化、淀粉樣蛋白沉積，以及 動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙。進(jìn)一步證明，TAT-siP-PTPNl-HA對(duì)老年癡呆模型具有確切的治療作 用。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：（1)本發(fā)明所涉及的小分子多肽 TAT-siP-PTPNl-HA容易誘導(dǎo)表達(dá)純度，完全可溶，適合靜脈注射，無毒副作用。（2)本發(fā)明 公開的TAT-siP-PTPNl-HA多肽，TAT可以攜帶siP-PTPNl-HA蛋白多肽經(jīng)血液穿過血腦屏 障被神經(jīng)元攝取，可以轉(zhuǎn)化應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如老年癡呆，使其具有實(shí)際操作的可行性。
[0020] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0021] 本發(fā)明通過給12月齡Tg2576小鼠注射TAT-siP-PTPNl-HA多肽，發(fā)現(xiàn)其可以改善 老年癡呆模型動(dòng)物的老年斑、tau蛋白過度磷酸化與學(xué)習(xí)、記憶障礙。
[0022] 具體操作步驟如下：
[0023] 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象
[0024] 雄性Tg2576小鼠（購買自Jax實(shí)驗(yàn)室），SPF級(jí)，體重25?32克，20只，常規(guī)環(huán) 境飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組（野生型對(duì)照小鼠）；②模型組（注射TAT-scramble-HA);③ 治療組（注射TAT-siP-PTPNl-HA);每組10只。
[0025] 2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?br> [0026] ①正常組：12月齡野生型對(duì)照小鼠，不處理
[0027] ②模型組：12月齡Tg2576小鼠，通過尾靜脈單次注射給予TAT-scramble-HA多 肽，劑量為l〇mg/kg。
[0028] ③治療組：12月齡Tg2576小鼠，通過尾靜脈單次注射給予TAT-siP-PTPNl-HA多 肽，劑量為l〇mg/kg。
[0029] 3.研宄方法
[0030] ①多肽誘導(dǎo)表達(dá)：采用原核表達(dá)載體，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，考 馬斯亮藍(lán)染色鑒定。
[0031] ②表達(dá)鑒定：通過免疫印跡檢測HA表達(dá)。
[0032] ③小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力：Morris水迷宮訓(xùn)練及測試；
[0033] ④海馬tau蛋白磷酸化：免疫印跡；
[0034] ⑤海馬A β含量：酶聯(lián)免疫吸附法
[0035] ⑥海馬突觸形態(tài)：高爾基染色
[0036] ⑦小鼠電生理：長時(shí)程增強(qiáng)電生理記錄
[0037] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0038] *Ρ〈(λ 05，與正常組比較
[0039] 林P〈0. 01，與正常組比較
[0040] #Ρ〈0· 05,與模型組比較
[0041] ##Ρ〈0· 01，與模型組比較
[0042] (1)考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證表達(dá)：見圖1。沒有加入IPTG藥物誘導(dǎo)，以及加入IPTG 誘導(dǎo)〇. 5, 1小時(shí)均沒有明顯表達(dá)；當(dāng)誘導(dǎo)2小時(shí)后，在目的分子量出現(xiàn)大量蛋白。
[0043] (2)免疫印跡染色驗(yàn)證表達(dá)：見圖2。通過識(shí)別HA的特異性抗體染色，檢測到 TAT-siP-PTPNl-HA 的表達(dá)。
[0044] (3)Morris水迷宮訓(xùn)練及測試結(jié)果：見圖3。模型組與正常組相比出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記 憶障礙，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明水迷宮測試的潛伏期明顯延長，學(xué)習(xí)的時(shí)間延長。模型組在目標(biāo)象限 停留時(shí)間和距離以及穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，說明記憶能力的減退，模型模擬老年癡呆 癥狀。治療組與模型組相比潛伏期時(shí)間變短，目標(biāo)象限停留次數(shù)和穿越平臺(tái)次數(shù)增加，其學(xué) 習(xí)和記憶能力都得到了良好的改善。
[0045] (4)Tau磷酸化免疫印跡結(jié)果：見圖4。與正常組相比較，模型組的海馬內(nèi)tau蛋白 在絲氨酸396,絲氨酸404位點(diǎn)，磷酸化水平明顯增高，TAT-siP-PTPNl-HA處理后，tau磷 酸化水平明顯下降。
[0046] (5)酶聯(lián)免疫法檢測小鼠海馬A β含量：見圖5。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)檢測發(fā) 現(xiàn)，與正常組相比較，模型組海馬內(nèi)Αβ含量升高，TAT-siP-PTPNl-HA處理后，Αβ含量明顯 下降。
[0047] (6)高爾基染色結(jié)果：見圖6。與正常組比較，模型組的海馬內(nèi)樹突棘密度明顯減 少，代表具有功能性的蘑菇狀樹突棘含量降低，說明模型組出現(xiàn)突觸形態(tài)異常變化。治療組 與模型組相比樹突棘密度增加，蘑菇狀樹突棘含量增加。
[0048] (7)電生理記錄結(jié)果：見圖7。與正常組相比較，模型組小鼠的興奮性突觸后電位 (EPSP)的幅度和頻率都下降，說明模型組出現(xiàn)突觸功能障礙。治療組與模型組相比樹突棘 密度增加興奮性突觸后電位（EPSP)的斜率明顯升高。
[0049] 5.結(jié)論及用法建議：
[0050] 以上結(jié)果顯示尾靜脈注射TAT-siP-PTPNl-HA的Tg2576小鼠水迷宮訓(xùn)練及檢測過 程中平臺(tái)的潛伏期增加，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少說明小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力損傷，檢測早 老性癡呆相關(guān)指標(biāo)tau蛋白磷酸化以及Αβ含量后發(fā)現(xiàn)，tau蛋白的磷酸化水平顯著上升， Αβ含量也有明顯升高，這些早老性癡呆的相關(guān)特征的改變，說明Tg2576小鼠模擬了老年 癡呆癥狀。
[0051] 跟模型組相比較，在給與了 TAT-siP-PTPNl-HA處理后，檢測小鼠水迷宮行為 學(xué)，其學(xué)習(xí)和記憶能力得到了有效的改善；同時(shí)，早老性癡呆相關(guān)指標(biāo)tau蛋白磷酸化 以及A β含量和模型組比較也有明顯降低，說明TAT-siP-PTPNl-HA能緩減Tg2576小鼠 海馬區(qū)tau的異常過度磷酸化、能減少淀粉樣蛋白Αβ沉積并改善動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙。 TAT-siP-PTPNl-HA能用于老年性癡呆的預(yù)防和治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052] 所有圖中，*P〈0. 05, #P〈0. 01與正常組比較；#P〈0. 05, ##P〈0. 01與模型組比較。 正常組，不做任何處理；模型組，Tg2576小鼠給予TAT-scramble-HA ;治療組：Tg2576小鼠 給予TAT-siP-PTPNl-HA。單次尾靜脈注射，劑量為10mg/kg。
[0053] 圖1為一種小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA的考馬斯亮藍(lán)染色圖。
[0054] 多肽的核苷酸序列由武漢擎科公司合成，通過分子生物學(xué)技術(shù)，將其構(gòu)建到元和 表達(dá)載體PGEX-5X-1中，在BL21感受態(tài)（北京全式金公司）中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增。當(dāng)菌液0D600 達(dá)到0. 6時(shí)，加入2mM的IPTG分別誘導(dǎo)0. 5, 1，2小時(shí)，最后通過SDS-PAGE電泳，并采用考 馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)2小時(shí)后，在目的大小位置出現(xiàn)大量富集蛋 白。圖中1，2,3,4分別表示沒有加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)0.5, 1，2小時(shí)。箭頭所指為目的大小 分子量。
[0055] 圖2為一種小分子多肽TAT-siP-PTPNl-HA的免疫印跡染色圖。
[0056] 多肽經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行純化，并采用Factor Xa進(jìn)行剪切，分離出目的小分子多 肽（約8kDa)。純化后蛋白樣品，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)，通過HA特異性抗體檢測表達(dá)情況。結(jié) 果證實(shí)表達(dá)成功。
[0057] 圖3為TAT-siP-PTPNl-HA改善Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶的水迷宮結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0058] 實(shí)驗(yàn)所采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)包括圓形水池直徑120cm，高60cm ;圓柱形有 機(jī)玻璃平臺(tái)直徑l〇cm，高40cm。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2°C，平臺(tái) 放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下約2cm。訓(xùn)練時(shí)將小鼠從任一象限1/2弧度處頭 面向池壁輕放于水中，檢測其潛伏期（即小鼠從入水點(diǎn)起到找到平臺(tái)所用的時(shí)間）、路徑作 為衡量小鼠學(xué)習(xí)記憶和測試成績的指標(biāo)。每只小鼠每天在4個(gè)象限共訓(xùn)練4次，每次游泳 時(shí)限為60s，即在60s內(nèi)未找到平臺(tái)者系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導(dǎo)其 上臺(tái)，休息30s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。首先訓(xùn)練時(shí)間為6天，在第7天的時(shí)候，記錄小鼠找到 平臺(tái)期所需時(shí)間，記錄小鼠找到平臺(tái)所需潛伏期。休息一天，去平臺(tái)，計(jì)算1分鐘內(nèi)小鼠在 目標(biāo)象限的停留時(shí)間并分析其在平臺(tái)所在位置的穿越次數(shù)，以評(píng)價(jià)其記憶能力。
[0059] 結(jié)果顯示跟正常組相比模型組小鼠游泳軌跡混亂，找到平臺(tái)所需潛伏期時(shí)間最 長，說明小鼠學(xué)習(xí)能力受到損傷，在給予TAT-siP-PTPNl-HA后，治療組小鼠跟模型組 相比軌跡重新恢復(fù)簡單，潛伏期變短；模型組小鼠穿越平臺(tái)的時(shí)間和距離最短，次數(shù)最 少，說明模型組老鼠的記憶能力受到損害，不記得平臺(tái)的位置；治療組小鼠跟模型組相比 穿越平臺(tái)的時(shí)間和距離恢復(fù)到正常一致，穿越平臺(tái)次數(shù)也相應(yīng)增加，其記憶能力在給予 TAT-siP-PTPNl-HA后得到明顯恢復(fù)。
[0060] 圖4為TAT-siP-PTPNl-HA改善Tg2576小鼠 tau蛋白磷酸化結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0061] 水迷宮訓(xùn)練完成后，頸椎脫臼斷頭處死小鼠，迅速取出大腦腦組織置于 0-4°C 0. 05M Tris緩沖鹽溶液（TB，pH7. 0)內(nèi)，快速分離雙側(cè)海馬，制成10 %的蛋白勻漿， 在IOOOrmp離心5分鐘，取上清，測定蛋白含量后備用。
[0062] 分別檢測tau蛋白不同位點(diǎn)的磷酸化水平，包括pS396, pS404。β -actin為內(nèi)參 條帶，證明蛋白上樣量的一致性。通過與總tau tau5比較，模型組磷酸化位點(diǎn)磷酸化水平 明顯增加，tau發(fā)生過度磷酸化；治療組給TAT-siP-PTPNl-HA后，tau的過度磷酸化得到改 善。
[0063] 圖5為TAT-siP-PTPNl-HA改善Tg2576小鼠 A β沉積結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0064] 樣品制備同免疫印跡，用Αβ 42的抗體進(jìn)行包被后漂洗，加入樣品，用四甲基聯(lián)苯 胺（3,3'，5,5' -tetramethylbenzidine，TMB)顯色，并在分光光度計(jì)上波長450nm讀數(shù)。
[0065] 阿爾茨海默病病人的另一病理學(xué)特征是腦內(nèi)Αβ聚集，Αβ的產(chǎn)生是由于淡粉樣 蛋白前體蛋白（APP)的剪切錯(cuò)誤導(dǎo)致的，可以產(chǎn)生兩種剪切片段Αβ 40和Αβ 42。其中， Αβ 42具有較高的毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組老鼠中Αβ 42片段的釋放明顯增多， TAT-siP-PTPNl-HA治療后，治療組Αβ 42回到正常組水平，進(jìn)一步證明TAT-siP-PTPNl-HA 能夠改善阿爾茨海默病模型小鼠出現(xiàn)的病理特征。
[0066] 圖6為TAT-siP-PTPNl-HA改善Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶的高爾基染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0067] 水迷宮訓(xùn)練完成后，進(jìn)行麻醉處理，并依次采用4%甲醛生理鹽水、含重鉻酸鉀媒 染液、1%硝酸銀溶液灌流，經(jīng)震蕩切片機(jī)進(jìn)行切片，采用梯度酒精脫水，二甲苯透明處理 后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察樹突棘形態(tài)。模型組小鼠的大腦海馬內(nèi)樹突棘數(shù)量減少， 蘑菇狀樹突棘比例下降，治療組增加了樹突棘密度和蘑菇狀樹突棘含量。
[0068] 圖7為TAT-siP-PTPNl-HA改善Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶的長時(shí)程增強(qiáng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0069] 小鼠麻醉后固定于立體定位儀上，施行局部開顱術(shù)，將刺激電極和記錄電極分別 放在海馬CA3和CAl區(qū)域。刺激CA3區(qū)誘發(fā)場電位。選擇合適的刺激和記錄電極位置。繪制 I/O曲線，選擇誘發(fā)fEPSP幅度最大值的40%當(dāng)作刺激強(qiáng)度，使用一串高頻刺激（100Hz，Is) 刺激 CA3 區(qū) Schaeffer col lateral-commissural fibers 誘導(dǎo) CAl 區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)（LTP)，記 錄120分鐘。
[0070] 與正常組相比較，模型組小鼠的興奮性突觸后電位（EPSP)的幅度和頻率都下降， 說明模型組出現(xiàn)突觸功能障礙。治療組與模型組相比樹突棘密度增加興奮性突觸后電位 (EPSP)的幅度和頻率都明顯升高。

【具體實(shí)施方式】
[0071] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0072] 本發(fā)明通過給12月齡Tg2576小鼠注射TAT-siP-PTPNl-HA多肽，發(fā)現(xiàn)其可以改善 老年癡呆模型動(dòng)物的老年斑、tau蛋白過度磷酸化與學(xué)習(xí)、記憶障礙。
[0073] 具體操作步驟如下：
[0074] L實(shí)驗(yàn)對(duì)象：雄性Tg2576小鼠（購買自Jax實(shí)驗(yàn)室），SPF級(jí)，體重25?32 克，20只，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組（野生型對(duì)照小鼠）；②模型組（注射 TAT-scramble-HA);③治療組（注射 TAT-siP-PTPNl-HA);每組 10 只。
[0075] 2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽洌?br> [0076] ①正常組：12月齡野生型對(duì)照小鼠，不處理
[0077] ②模型組：12月齡Tg2576小鼠，通過尾靜脈單次注射給予TAT-scramble-HA多 肽，劑量為l〇mg/kg。
[0078] ③治療組：12月齡Tg2576小鼠，通過尾靜脈單次注射給予TAT-siP-PTPNl-HA多 肽，劑量為l〇mg/kg。
[0079] 3.研宄方法：
[0080] ①多肽誘導(dǎo)表達(dá)：采用原核表達(dá)載體，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，考 馬斯亮藍(lán)染色鑒定。
[0081] ②表達(dá)鑒定：通過免疫印跡檢測HA表達(dá)。
[0082] ③小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力：Morris水迷宮訓(xùn)練及測試；
[0083] ④海馬tau蛋白磷酸化：免疫印跡；
[0084] ⑤海馬A β含量：酶聯(lián)免疫吸附法
[0085] ⑥海馬突觸形態(tài)：高爾基染色
[0086] ⑦小鼠電生理：長時(shí)程增強(qiáng)電生理記錄
[0087] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0088] *P〈0. 05，與正常組比較
[0089] #P〈0. 01，與正常組比較
[0090] #Ρ〈0· 05,與模型組比較
[0091] ##Ρ〈0· 01，與模型組比較
[0092] (1)考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證表達(dá)：見圖1。沒有加入IPTG藥物誘導(dǎo)，以及加入IPTG 誘導(dǎo)〇. 5, 1小時(shí)均沒有明顯表達(dá)；當(dāng)誘導(dǎo)2小時(shí)后，在目的分子量出現(xiàn)大量蛋白。
[0093] (2)免疫印跡染色驗(yàn)證表達(dá)：見圖2。通過識(shí)別HA的特異性抗體染色，檢測到 TAT-siP-PTPNl-HA 的表達(dá)。
[0094] (3)Morris水迷宮訓(xùn)練及測試結(jié)果：見圖3。模型組與正常組相比出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記 憶障礙，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明水迷宮測試的潛伏期明顯延長，學(xué)習(xí)的時(shí)間延長。模型組在目標(biāo)象限 停留時(shí)間和距離以及穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，說明記憶能力的減退，模型模擬老年癡呆 癥狀。治療組與模型組相比潛伏期時(shí)間變短，目標(biāo)象限停留次數(shù)和穿越平臺(tái)次數(shù)增加，其學(xué) 習(xí)和記憶能力都得到了良好的改善。
[0095] (4)Tau磷酸化免疫印跡結(jié)果：見圖4。與正常組相比較，模型組的海馬內(nèi)tau蛋白 在絲氨酸396,絲氨酸404位點(diǎn)，磷酸化水平明顯增高，TAT-siP-PTPNl-HA處理后，tau磷 酸化水平明顯下降。
[0096] (5)酶聯(lián)免疫法檢測小鼠海馬A β含量：見圖5。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)檢測發(fā) 現(xiàn)，與正常組相比較，模型組海馬內(nèi)Αβ含量升高，TAT-siP-PTPNl-HA處理后，Αβ含量明顯 下降。
[0097] (6)高爾基染色結(jié)果：見圖6。與正常組比較，模型組的海馬內(nèi)樹突棘密度明顯減 少，代表具有功能性的蘑菇狀樹突棘含量降低，說明模型組出現(xiàn)突觸形態(tài)異常變化。治療組 與模型組相比樹突棘密度增加，蘑菇狀樹突棘含量增加。
[0098] (7)電生理記錄結(jié)果：見圖7。與正常組相比較，模型組小鼠的興奮性突觸后電位 (EPSP)的幅度和頻率都下降，說明模型組出現(xiàn)突觸功能障礙。治療組與模型組相比樹突棘 密度增加興奮性突觸后電位（EPSP)的斜率明顯升高。
[0099] 5.結(jié)論及用法建議：以上結(jié)果顯示尾靜脈注射TAT-siP-PTPNl-HA的Tg2576小 鼠水迷宮訓(xùn)練及檢測過程中平臺(tái)的潛伏期增加，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少說明小鼠的學(xué)習(xí)和 記憶能力損傷，檢測早老性癡呆相關(guān)指標(biāo)tau蛋白磷酸化以及Αβ含量后發(fā)現(xiàn)，tau蛋白 的磷酸化水平顯著上升，Αβ含量也有明顯升高，這些早老性癡呆的相關(guān)特征的改變，說明 Tg2576小鼠模擬了老年癡呆癥狀。跟模型組相比較，在給與了 TAT-siP-PTPNl-HA處理后， 檢測小鼠水迷宮行為學(xué)，其學(xué)習(xí)和記憶能力得到了有效的改善；同時(shí)，早老性癡呆相關(guān)指標(biāo) tau蛋白磷酸化以及A β含量和模型組比較也有明顯降低，說明TAT-siP-PTPNl-HA能緩減 Tg2576小鼠海馬區(qū)tau的異常過度磷酸化、能減少淀粉樣蛋白Αβ沉積并改善動(dòng)物學(xué)習(xí)、記 憶障礙。TAT-siP-PTPNl-HA能用于老年性癡呆的預(yù)防和治療。
【權(quán)利要求】
1. 一種人工合成的小分子多肽，其序列為SEQ ID NO. 1所不。
2. 編碼權(quán)利要求1所述小分子多肽的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
4. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的序列在制備治療或預(yù)防老年癡呆藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK104479027SQ201410668134
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】朱鈴強(qiáng), 王雄, 王玉田, 劉丹, 黃和周 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)