疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開一種疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子，該啟動子屬于組織特異性表達(dá)啟動子，該啟動子能驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片特異表達(dá)。該啟動子可以應(yīng)用于水稻抗白葉枯病育種，通過驅(qū)動其它外源基因尤其是抗白葉枯病基因在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中集中特異表達(dá)，從而提高水稻對白葉枯病的抗性。同時，該啟動子對于應(yīng)用于水稻其它葉面病害的防治具有重要的理論及實際意義?！緦＠f明】疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種由疣粒野生稻中克隆的抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子，屬于分子生物學(xué)【
技術(shù)領(lǐng)域：
】?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]基因的表達(dá)和調(diào)控是植物基因工程研究的重要內(nèi)容之一，啟動子作為一種重要的調(diào)控元件，調(diào)控著外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的特定組織、特定發(fā)育階段和一定環(huán)境條件下的表達(dá)。利用基因工程技術(shù)將相關(guān)抗性基因?qū)胫参?，從而使植物抵御各種生物或非生物脅迫，是實現(xiàn)植物抗逆性改良的較好途徑，而啟動子的配置和外源基因的按需表達(dá)則顯得非常重要。目前在植物轉(zhuǎn)基因研究中最廣泛采用的啟動子有來源于花椰菜花葉病毒（CaMV)的35S啟動子（OdellJT,etal,IdentificationofDNAsequencesrequiredforactivityofthecauliflowermosaicvirus35Spromoter[J].Nature,313(6005):810-812,1985)，玉米泛素基因（Ubil)啟動子（ChristensenAHetal,Maizepolyubiquitingenestructurethermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation[J]·PlantMolBiol,18(4):675-689,1992)等，它們都屬于組成型啟動子，即在這類啟動子控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植株的各個組織、各個發(fā)育階段都會持續(xù)表達(dá)。這不僅造成了能量的浪費，而且對植物的生長發(fā)育也有不利的影響。[0003]尋找專一性啟動子，使外源基因特異地表達(dá)是植物基因工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。組織特異性啟動子作為一類專一性啟動子，能調(diào)控外源基因在植物發(fā)育過程中某一特定時空表達(dá)，它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定空間積累，增加區(qū)域表達(dá)量，而且也避免了植物能量的不必要浪費（楊予濤等，一個光合組織特異表達(dá)強啟動子的分離及功能分析[J].中國科學(xué)C輯，33(4):298-306,2003)。[0004]葉片是水稻的主要營養(yǎng)器官，同時也是白葉枯病的主要發(fā)生器官。因此，在水稻白葉枯病抗性改良中，使抗病基因在葉片中特異表達(dá)，不僅避免了基因產(chǎn)物的浪費，同時還能提高水稻植株的抗性，進而提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。而找到能調(diào)控抗病基因在水稻葉片特異性表達(dá)的啟動子，則是解決這一問題的關(guān)鍵。[0005]我們在疣粒野生稻受白葉枯病菌誘導(dǎo)的抑制差減文庫（SSH)中，克隆了一個抗白葉枯病相關(guān)基因Me094,該基因編碼金屬硫蛋白。金屬硫蛋白是一種小分子量，富含半胱氨酸的重金屬結(jié)合蛋白，參與植物中的金屬代謝和過多的重金屬的解毒，此外也參與植物的脅迫保護反應(yīng)（RobinsonNJetal,Plantmetallothionein[J]·Biochem,295:1-10,1993;CarginaleV,etal,Cadmium-induceddifferentialaccumulationofmetallothioneinisofonnsintheAntarcticicefishwhichexhibitsnobasalproteinbuthighendogenousmRNAlevels[J].Biochem.J,332:475-81,1998)。通過研究發(fā)現(xiàn)，Me094在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)能提商水稻的抗白葉枯病能力，用RNAi干擾技術(shù)干擾Me094基因的表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因水稻的抗病能力明顯減弱。這些結(jié)果表明Me094參與了疣粒野生稻抗白葉枯病過程。本發(fā)明所述的啟動子即是疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子，它是一個葉片特異表達(dá)的啟動子。目前，已成功克隆了多個葉片特異表達(dá)啟動子，如Rbcs(1，5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶小亞基基因）啟動子，Cab(捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因）啟動子等，這些啟動子的利用不同程度地提高了目的基因在葉片的特異表達(dá)。[0006]熱不對稱交錯PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR，簡稱TAIL-PCR)是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)由Liu和Whitter首先石開究并?艮道（LiuYGetal，ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentfromPlandYACclonesforchromosomewalking[J]·Genomics,25:674-681，1995)。利用該技術(shù)分離出的DNA序列可用于圖位克隆、遺傳圖譜繪制的探針，也可以直接測序。近年來，由此形成的技術(shù)路線已成功地用于從PUYAC和BAC克隆中分離獲得插入末端的DNA序列，擬南芥的T-DNA側(cè)翼序列及多個基因的啟動子序列，并且取得了顯著成效?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的是提供一新的疣粒野生稻中抗白葉枯病相關(guān)基因Me094的上游啟動子序列，以及該啟動子在驅(qū)動外源基因尤其是抗病基因在轉(zhuǎn)基因植物的葉片特異表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)基因植物抵御病害能力上的應(yīng)用。[0008]本發(fā)明針對上述研究背景，根據(jù)已克隆了的疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094序列，通過TAIL-PCR技術(shù)分離克隆了該基因的上游啟動子，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥進行啟動子功能研究。[0009]本發(fā)明所提供的一種疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0010]本發(fā)明還提供了上述疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子在驅(qū)動外源抗病基因在轉(zhuǎn)基因植物的葉片特異表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因植物抵御病害能力上的應(yīng)用。[0011]所述的提1?轉(zhuǎn)基因植物抵御病害能力上的應(yīng)用為提1?轉(zhuǎn)基因水稻抵御白葉枯病害能力上的應(yīng)用。[0012]本發(fā)明還提供了上述疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中驅(qū)動下游基因葉片特異表達(dá)的應(yīng)用。[0013]本發(fā)明還提供了一種擴增本發(fā)明疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子的引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5組成，引物AD1的堿基序列如SEQIDNO:2所示，引物AD2的堿基序列如SEQIDNO:3所不，引物AD3的喊基序列如SEQIDNO:4所不，引物AD4的喊基序列如SEQIDNO:5所示，引物AD5的堿基序列如SEQIDNO:6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3組成，所述引物ME094-1的堿基序列如SEQIDNO:7所示，引物ME094-2的堿基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的堿基序列如SEQIDNO:9所示。[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：[0015]本發(fā)明通過TAIL-PCR技術(shù)首次從疣粒野生稻中克隆獲得抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子，該啟動子能驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片特異表達(dá)，屬于組織特異性表達(dá)啟動子。本發(fā)明發(fā)掘的疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因啟動子，可以應(yīng)用于水稻抗白葉枯病育種，對于驅(qū)動其它外源基因尤其是抗白葉枯病基因在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中集中特異表達(dá)，從而提高水稻對白葉枯病的的抗性具有重要的理論及實際意義。同時該啟動子也可以應(yīng)用于水稻其它葉面病害的防治。[0016]序列表中SEQIDNO:1所示的是本發(fā)明疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子的核苷酸序列。[0017]序列表中SEQIDNO:2所示的是引物ADl的堿基序列。[0018]序列表中SEQIDNO:3所示的是引物AD2的堿基序列。[0019]序列表中SEQIDNO:4所示的是引物AD3的堿基序列。[0020]序列表中SEQIDNO:5所示的是引物AD4的堿基序列。[0021]序列表中SEQIDNO:6所示的是引物AD5的堿基序列。[0022]序列表中SEQIDNO:7所示的是引物ME094-1的堿基序列。[0023]序列表中SEQIDNO:8所示的是引物ME094-2的堿基序列。[0024]序列表中SEQIDNO:9所示的是引物ME094-3的堿基序列。[0025]序列表中SEQIDNO:10所示的是Me94Pr-l引物的堿基序列。[0026]序列表中SEQIDNO:11所示的是Me94Pr-2引物的堿基序列。[0027]序列表中SEQIDNO:12所示的是疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094的cDNA全長的核苷酸序列。[0028]序列表中SEQIDNO:13所示的是疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094編碼的氨基酸序列。[0029]序列表中SEQIDNO:14所示的是Me094的EST序列上游引物Me094-E(+)的堿基序列。[0030]SEQIDNO:15所示的是Me094的EST序列下游引物Me094-E(_)的堿基序列。[0031]SEQIDNO:16所示的是接頭引物AP的堿基序列。[0032]SEQIDNO:17所示的是Me094的ORF序列上游引物Me094-F(+)的堿基序列。[0033]SEQIDNO:18所示的是Me094的ORF序列下游引物Me094-F(_)的堿基序列。[0034]SEQIDNO:19所示的是Me094基因的3'端核苷酸序列。[0035]SEQIDNO:20所示的是Me094基因的5'端核苷酸序列。[0036]SEQIDNO:21所示的是疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094的EST序列?！緦＠綀D】【附圖說明】[0037]圖1:本發(fā)明啟動子序列的TAIL-PCR擴增圖譜。圖中MJPM2分別DL15000Marker和DL2000Marker，1、3、5、7、9泳道分別為引物AD1-AD5的第2輪擴增產(chǎn)物，2、4、6、8、10泳道分別為引物AD1-AD5的第3輪擴增產(chǎn)物。[0038]圖2:本發(fā)明啟動子表達(dá)載體的PCR鑒定（左）及HindIII和XbaI雙酶切鑒定(右）圖譜。圖中M為DL2000Marker，1為非轉(zhuǎn)基因植株對照，2為質(zhì)粒對照，3-8為轉(zhuǎn)基因陽性植株。[0039]圖3:本發(fā)明啟動子表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后的菌液PCR鑒定圖譜。圖中M為DL2000Marker，1-4為4個不同的農(nóng)桿菌單克隆。[0040]圖4:本發(fā)明啟動子表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥后的PCR檢測圖譜。圖中M為DL2000Marker，1為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?-8為轉(zhuǎn)基因植株。[0041]圖5:本發(fā)明啟動子表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥后的GUS化學(xué)染色圖譜。圖中1為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?為轉(zhuǎn)入空載體pBI121的對照，3-4為轉(zhuǎn)基因植株。3-4中箭頭所指是藍(lán)色較深的部位。[0042]圖6:含有Me094基因的表達(dá)載體pCAMBIA1300-BI_Me094圖譜。[0043]圖7:轉(zhuǎn)Me094基因水稻的DNA的PCR檢測陽性植株圖，圖中M為DL2000Marker，1為陽性對照，2為陰性對照，3-15為再生植株。[0044]圖8:Me094基因的半定量RT-PCR顯示圖。圖中β-Acti是內(nèi)參基因，CK、24h、48h、72h、96h、120h分別為接無菌水對照、白葉枯病病原菌處理24h、48h、72h、96h、120h的cDNA半定量RT-PCR的擴增結(jié)果?！揪唧w實施方式】[0045]以下各實施例無特殊說明均為常規(guī)方法。[0046]實驗材料：撫粒野生稻（Oryzameyeriana),白葉枯病菌Cl是中國典型的致病菌株，白葉枯病菌Y8是云南省典型的致病菌株，用所述白葉枯病菌Cl和白葉枯病菌Y8接種是利用其對水稻的侵染能力的共性從而導(dǎo)致水稻葉片形成白葉枯病病斑，因此，具有同樣致病能力的各種白葉枯病菌菌株都能達(dá)到本發(fā)明的效果。以下各實施例的實驗試劑等均為市售產(chǎn)品。[0047]實施例1-實施例2是本發(fā)明疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子的克隆、序列分析及功能驗證。實施例3-實施例7分別是疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094的表達(dá)序列標(biāo)簽的驗證和表達(dá)分析、基因Me094全長的克隆、含目的Me094基因重組農(nóng)桿菌的獲得、含目的Me094基因農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)目的Me094基因再生植株的分子生物學(xué)檢測和抗性鑒定。[0048]實施例1疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子的克隆及分析[0049](1)設(shè)計擴增Me094啟動子的引物[0050]Me094基因是本申請人:前期從疣粒野生稻受白葉枯病菌誘導(dǎo)的SSH文庫中篩選克隆出來的1個金屬硫蛋白基因，已進行了功能驗證，但其上游啟動子序列未知，從而限制了對該基因表達(dá)調(diào)控情況的研究。根據(jù)Me094基因全長cDNA序列信息，再結(jié)合TAIL-PCR技術(shù)的原理，用生物軟件Primer5.0設(shè)計引物對Me094基因啟動子進行擴增，Me094基因全長cDNA的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:12所示，設(shè)計的擴增本發(fā)明啟動子（即疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子）的引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5組成（即5條隨機簡并上游引物），引物ADl的喊基序列如SEQIDNO:2所不，引物AD2的喊基序列如SEQIDNO:3所不，弓丨物AD3的堿基序列如SEQIDNO:4所示，引物AD4的堿基序列如SEQIDNO:5所示，引物AD5的堿基序列如SEQIDN0:6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3組成（即3條嵌套的特異性下游引物），所述引物ME094-1的堿基序列如SEQIDNO:7所示，引物ME094-2的堿基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的堿基序列如SEQIDNO:9所示。[0051](2)以接種白葉枯病菌處理的疣粒野生稻葉片提取總DNA[0052]對疣粒野生稻葉片用白葉枯病菌Cl和Y8進行接菌處理，分別于24h、48h、72h、96h、120h5個時期取樣，然后將樣品等量混合后用CTAB法提取其葉片DNA，具體如下：[0053]1)取0.2g疣粒野生稻接菌后的混合樣品加液氮研磨至粉末狀，加入Iml提取緩沖液（2%CTAB，100mMTris-cLPH8·0,20mMEDTAPH8·0，l·4MNaCl)置于65°C保溫60-90min，其間不斷搖勻；[0054]2)取出后12000rpm離心10min(4°C);[0055]3)離心結(jié)束后將上清液轉(zhuǎn)到另一干凈離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24:1)，其間不斷搖勻；[0056]4)靜置片刻后12000rpm離心10min(4°C)，取出上清液加入2/3體積的異丙醇置于-20°C進行沉淀約30min;[0057]5)5000印111離心5111；[11(41€)，棄去上清液，加入1111175%的酒精洗漆沉淀，重復(fù)二次；[0058]6)然后將離心管在室溫?zé)o菌風(fēng)干至透明狀，加入50μITE(K)OmMTris-clΡΗ4.0,ImMEDTA)或CldH2O溶解沉淀，加入2μIRNA酶；[0059]7)取3μ1上清液，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并用分光光度計測定其濃度。[0060](3)疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因ΜΕ094啟動子的擴增[0061]以步驟⑵所提取的DNA作為PCR反應(yīng)的模板，濃度稀釋到0.Iyg/μ1，以步驟1中設(shè)計的引物作為PCR反應(yīng)引物，即分別以3條下游引物：引物ΜΕ094-1、引物ΜΕ094-2和引物ΜΕ094-3和5條上游隨機引物：引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5配對，做3輪TAIL-PCR擴增反應(yīng)，擴增疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子。[0062]①第1輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：10XLAPCRBuffer(Mg2+Plus)2μ1，dNTPMixture(2.5mMeach)1.6yl，模板DNA25ng，特異弓丨物（Me094-l)0.2uM，隨機引物（AD1-AD5)各4uM，LATaq聚合酶I.0U，CldH2O補足到20μ1。反應(yīng)條件：93°Clmin,95°Clmin，然后5個循環(huán)（94°C30s，6(TClmin，72°C2min)，94°C30s，3(TC3min，Rampingto72°C(0.2t：/s)2min。最后15個循環(huán)（94°C30s，62°Clmin，72t：2min;94°C30s，62°Clmin，72°C2min;94°C30s，44°Clmin，72°C2min)，72°ClOmin。[0063]②第2輪PCR反應(yīng)：[0064]將第I輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為第2輪PCR的模板。反應(yīng)體系同步驟⑶①，只是模板改為第1輪PCR產(chǎn)物稀釋液1μ1，特異引物改為Me094-2,隨機引物改為2μM。反應(yīng)條件：15個循環(huán)（94°C30s，6(TClmin，72°C2min;94°C30s，6(TClmin，72°C2min;94°C30s，44°Clmin，72°C2min)，72°ClOmin。[0065]③第3輪PCR反應(yīng)：[0066]將第2輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為第3輪PCR的模板，反應(yīng)體系同步驟（3)②，模板改為第2輪PCR產(chǎn)物稀釋液1μ1，特異引物改為Me094-3。反應(yīng)條件：15個循環(huán)（94°C30s，61°Clmin,72〇C2min；94〇C30s,61°Clmin,72〇C2min；94〇C30s,44°Clmin,72〇C2min),72°C10min〇[0067](4)Me094基因啟動子片段的回收[0068]圖1為本發(fā)明啟動子的PCR擴增結(jié)果，結(jié)果顯示除引物AD3外，其它引物的第3輪PCR產(chǎn)物都有較特異的條帶，將它們用I%瓊脂糖凝膠電泳，然后進行凝膠回收，具體方法如下：[0069]1)在紫外燈下將目的條帶切下，盡量除去不含DNA片段的凝膠，置于I.5ml的離心管中，稱重；[0070]2)按每IOOmg膠塊加入300μ1溶膠液的比例加入溶膠液，置于50°C水浴中IOmin,期間不斷搖動混勻；[0071]3)膠塊完全溶解后將溶膠液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫，8000rpm離心30s，去掉廢液；[0072]4)向吸附柱中加入500μ1漂洗液，室溫，9000rpm離心30s，去掉廢液；[0073]5)重復(fù)步驟4,9000rpm離心Imin,倒掉廢液；[0074]6)將吸附柱移至干凈的I.5ml離心管中，室溫放置5min左右，使殘余漂洗液中的乙醇揮發(fā)；[0075]7)向吸附柱中央加入15-4(^1提前預(yù)熱至601：的洗脫緩沖液，室溫放置1-21^11，9000rpm離心Imin洗脫DNA，即獲得疣粒野生稻受白葉枯病菌脅迫表達(dá)的基因Me094的啟動子片段，即為本發(fā)明所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子。[0076](5)本發(fā)明啟動子片段的克隆測序及分析[0077]將步驟（4)中獲得的Me094基因啟動子片段回收產(chǎn)物分別與pMD18-T載體連接，反應(yīng)體系為：4μ1回收產(chǎn)物，1μIpMD18-T，5μIsolutionI，16°C連接30min或過夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于添加了Amp、IPTG和X-gal的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)12-16h，進行藍(lán)白斑篩選。待培養(yǎng)基上長出單克隆后，挑取白色單克隆于3ml液體LB中（含lmg/mlAmp)，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)14h-16h，用堿裂解法提取質(zhì)粒。[0078]提取的質(zhì)粒用EcoRI和SalI進行雙酶切鑒定，反應(yīng)體系為：10XHBufferΙμ?，質(zhì)粒4yl，EcoRI和SalI各0.5μ1，補足ddH20至1(^1。371：反應(yīng)3h，結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果Me094啟動子克隆載體大多數(shù)都能切出與理論值相符的條帶，將酶切鑒定正確的克隆送到上海生工測序。[0079]對測序結(jié)果用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/進行在線分析，結(jié)果表明本實驗獲得了Me094基因1761bp的啟動子序列，序列如SEQIDNO:1所示。該啟動子序列中位于第516堿基至第565堿基，第602堿基至第651堿基，第1187堿基至第1237堿基分別為預(yù)測的基礎(chǔ)啟動子序列；位于第556堿基，第642堿基，第1228堿基分別為預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點；有4個TATA-box，分別位于第526堿基至第531堿基，第539堿基至第543堿基，第896堿基至第899堿基，第1417堿基至第1420堿基；有3個CAAT-box元件，分別位于第324堿基至第328堿基，第728堿基至第731堿基，第829堿基至第832堿基；位于第1535堿基至第1537堿基是翻譯起始密碼子ATG(詳見序列表）。[0080]說明本實驗所獲得的序列的確是撫粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因ME094的上游啟動子序列。[0081]實施例2構(gòu)建本發(fā)明Me094啟動子高效表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥研究該啟動子功能[0082]l.Me094啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建[0083]在獲得Me094啟動子序列基礎(chǔ)上構(gòu)建該啟動子表達(dá)載體，即用Me094啟動子替換載體PBI121上的35S啟動子（載體pBI121為市售）。根據(jù)pBI121上35S啟動子兩側(cè)的酶切位點和Me094啟動子的序列分析結(jié)果，用HindIII和XbaI分別酶切pBI121和Me094啟動子克隆載體，酶切體系為：[0084]【權(quán)利要求】1.疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.權(quán)利要求1所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子在驅(qū)動外源抗病基因在轉(zhuǎn)基因植物的葉片特異表達(dá)以提高轉(zhuǎn)基因植物抵御病害能力上的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的提高轉(zhuǎn)基因植物抵御病害能力上的應(yīng)用為提高轉(zhuǎn)基因水稻抵御白葉枯病害能力上的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中驅(qū)動下游基因葉片特異表達(dá)上的應(yīng)用。5.-種擴增權(quán)利要求1所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因Me094啟動子的引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5組成，引物AD1的堿基序列如SEQIDNO:2所示，引物AD2的堿基序列如SEQIDNO:3所不，引物AD3的喊基序列如SEQIDNO:4所不，引物AD4的喊基序列如SEQIDN0:5所示，引物AD5的堿基序列如SEQIDN0:6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3組成，所述引物ME094-1的堿基序列如SEQIDN0:7所示，引物ME094-2的堿基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的堿基序列如SEQIDNO:9所示?！疚臋n編號】C12N15/113GK104404043SQ201410673732【公開日】2015年3月11日申請日期:2014年11月21日優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日【發(fā)明者】李定琴,程在全,鐘巧芳,肖素勤,柯學(xué),李維蛟,余騰瓊,張敦宇,付堅,王玲仙,陳玲,陳越,蔣聰,羅紅梅,曾民,王波,黃興奇申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所