編碼重組惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的dna分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及編碼重組惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的DNA分子。所述的DNA分子采用了酵母偏好的密碼子，并采用計算機DNA軟件對本發(fā)明的重組蛋白基因進行檢測，排除在基因中不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列。
【專利說明】編碼重組惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的DNA分子
[0001] 本發(fā)明是申請?zhí)枮?00610118947. 8的發(fā)明專利申請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及DNA重組技術和基因工程疫苗領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種源自 惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的重組蛋白；編碼所述重組蛋白的DNA序列；含所述DNA序 列的載體；含所述載體的宿主細胞；含所述重組蛋白的疫苗；用基因工程制備該重組蛋白 的方法；以及該重組蛋白在制備抗瘧疾疫苗方面的應用。

【背景技術】
[0003] 瘧疾是人類最古老的傳染病之一，目前仍嚴重影響人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO)的最新調(diào)查，約世界人口的40%仍處在瘧疾威脅之中，分布于100多個國家。目前世 界上每年有3至5億人罹患瘧疾，其中約300萬人死亡。更為嚴重的是，由于瘧原蟲及蚊媒 抗藥性的產(chǎn)生和迅速擴散，瘧疾不僅沒有得到有效控制，反而有卷土重來之勢。因此，開展 全球遏制皰疾計劃已成為WHO在新世紀兩個重點研宄領域之一。
[0004] 人們在瘧疾防治中依靠或期望獲得突破的主要有三個途徑：抗瘧藥、瘧疾疫苗和 蚊媒防制。但抗瘧藥及蚊媒防制面臨著巨大的困難和挑戰(zhàn)，這是因為瘧原蟲及蚊蟲抗藥性 的產(chǎn)生和擴散。盡管目前尚未有應用價值的瘧疾疫苗問世，但普遍認為發(fā)展瘧疾疫苗是人 類控制乃至消滅瘧疾的重要途徑。
[0005] 大量研宄表明，瘧疾是可以通過研制有效的疫苗而實現(xiàn)預防的。如用滅活子孢子 免疫的志愿者能完全保護后來的攻擊感染。再如用鼠瘧原蟲的重組抗原免疫小鼠，亦能完 全保護后來同種瘧原蟲的攻擊感染。此外，瘧疾流行病學研宄也顯示，死于瘧疾的主要是無 瘧疾免疫力的人群，如：在瘧區(qū)的兒童和非瘧區(qū)人群進入瘧區(qū)，而在瘧區(qū)的成人很少因瘧疾 而死亡。如給這些無免疫力的人群接種有效的疫苗，使其達到與瘧區(qū)成人同樣的免疫力，這 樣就能實現(xiàn)預防瘧疾和降低瘧疾死亡率的目標。因此，瘧疾疫苗研制已成為當今世界性熱 點課題。
[0006] 瘧疾疫苗的研宄已進行了 20多年，但至今仍無可應用的有效瘧疾疫苗問世。目前 正在研宄開發(fā)的瘧疾疫苗有3種，S卩：抗子孢子疫苗，紅內(nèi)期疫苗和阻斷傳播的疫苗。然而， 這些疫苗均因為效力低下、持續(xù)時間短、或不穩(wěn)定等原因，應用受到限制。
[0007] 此外，研制由瘧原蟲紅外期和紅內(nèi)期等抗原組成的多價多期疫苗是瘧疾疫苗研 發(fā)的趨勢。本 申請人:已經(jīng)研制了含有主要裂殖子表面抗原（MSPl)和裂殖子頂端膜抗原 (AM-I)的融合蛋白的疫苗（也稱為PfCP-2. 9)，其是一種紅內(nèi)期瘧疾疫苗。為提高疫苗的 免疫保護效力，需要尋找合適的紅外期抗原與其聯(lián)合應用，以達到全面且良好的防治瘧疾 的效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的就是提供源自惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的重組蛋白。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組蛋白，所述重組蛋白具有以下結構：
[0010] 元件B-連接肽-元件A ;或
[0011] 元件A-連接肽-元件B ;
[0012] 其中，
[0013] 元件A為惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)；
[0014] 元件B為無，或惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中除C端免疫區(qū)以外的免疫反應表 位區(qū)域；
[0015] 連接肽為無，或長度為1-30氨基酸的肽，所述的連接肽對于元件A和元件B的構 象基本上無影響。
[0016] 并且，所述的重組蛋白不具有惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的氨基酸序列，更優(yōu) 選的，所述的重組蛋白不具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0017] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)是惡 性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中位于中心重復區(qū)與錨定區(qū)之間、且不包括中心重復區(qū)與錨定 區(qū)的氨基酸序列。
[0018] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)包 括：惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白第二區(qū)域（RII區(qū)域）和C-末端內(nèi)的T、B細胞表位。
[0019] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在所述元件A的氨基酸序列中，消除了糖基化位點的 氨基酸序列。更優(yōu)選的，將所述的惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的第382位的Asn轉(zhuǎn)變?yōu)?Ala，從而消除糖基化位點。
[0020] 更佳地，所述的元件A具有SEQ ID NO: 2中第5-116位的氨基酸序列。
[0021] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，除了連接、克隆、表達或純化相關位點以外，所述重組 蛋白上的其它區(qū)域均來源于惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白。
[0022] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述元件B是惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中心重復 區(qū)的部分或全部的氨基酸序列。
[0023] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的中心重復區(qū)的氨基酸序列為：(NANP)n，其中，η =3_34〇
[0024] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的中心重復區(qū)的氨基酸序列為：(NANP) 15。
[0025] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述元件B還包括惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白RI區(qū) 的部分或全部的氨基酸序列。
[0026] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白含有：
[0027] SEQ ID NO:2中第5-116位所示的氨基酸序列；或
[0028] SEQ ID NO:4中第5-205位所示的氨基酸序列。
[0029] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白中不含有連接肽。
[0030] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白的N端還包含：釀酒酵母α -因子信號 肽切割序列。
[0031] 在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的DNA分子，該DNA分子選自：
[0032] ⑴編碼所述的重組蛋白的DNA分子；或
[0033] (ii)與⑴中的DNA分子互補的DNA分子。
[0034] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的DNA分子編碼具有SEQ ID N0:2中第5-116位 所示的氨基酸序列或SEQ ID N0:4中第5-205位所示的氨基酸序列的蛋白。
[0035] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的DNA分子具有：
[0036] SEQ ID NO: 1中第13-360位所示的核苷酸序列；或
[0037] SEQ ID NO:3中第13-627位所示的核苷酸序列。
[0038] 在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的DNA分子。
[0039] 在本發(fā)明的第四方面，提供一種宿主細胞，它含有所述的載體；或它的基因組中整 合有所述的多核苷酸。
[0040] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞為畢赤酵母細胞。
[0041] 在本發(fā)明的第五方面，提供一種抗瘧疾組合物，它含有：
[0042] 所述的重組蛋白或所述的DNA分子；以及
[0043] 藥學上可接受的載體。
[0044] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的抗瘧疾組合物還含有：
[0045] (a)主要裂殖子表面抗原（MSPl)和裂殖子頂端膜抗原（AMA-I)的融合蛋白，或
[0046] (b)編碼（a)所述融合蛋白的DNA分子。
[0047] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有所述的重組蛋白以及MSPl與AMA-I 的融合蛋白。
[0048] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物為疫苗。
[0049] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物中還含有ISA720佐劑。
[0050] 在本發(fā)明的第六方面，提供一種產(chǎn)生所述的重組蛋白的方法，包括步驟：
[0051] 在適合表達所述重組蛋白的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細胞從而表達出所述的重組 蛋白；分離所述的重組蛋白。
[0052] 另一方面，本發(fā)明還提供一種預防瘧疾的方法，給需要的對象施用免疫有效量的 所述的蛋白。
[0053] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0054] 圖1顯示了全長惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白（PfCSP)以及重組蛋白PfCSP-C和 PfCSP-RC的示意圖。其中，SP :信號肽；RI !Region I區(qū)；重復區(qū)：NANP重復區(qū)；RII !Region II區(qū)。此外，273Asn為PfCSP的C端免疫區(qū)的起始點氨基酸、384Ser為PfCSP的C-末端 錨定區(qū)起始點的前一個氨基酸、86Leu為RI區(qū)域的起始點氨基酸、112Pro為RI區(qū)域末端的 氨基酸，211Asn為本發(fā)明的重組蛋白PfCSP-RC的中心重復區(qū)的起始點氨基酸（對應于SEQ ID NO:4 中第 32 位）。
[0055] 圖2顯示了重組蛋白基因 PfCSP-RC和PfCSP-C的合成示意圖。其中，圖2A為 PfCSP-RC基因的合成：627bp PfCSP-RC基因分成8個寡核苷酸片段，用不對稱PCR法分步 進行基因拼接?；?'和3'分別加上XhoI和EcoRI位點用于基因片段的克隆。各合成 片段克隆在pBluscript載體進行序列分析。圖2B為PfCSP-C基因的合成：設計一對引物 分別位于PfCSP-RC的C末端起始處（Pa)和3'末端（Pb)，用PCR方法擴增獲得。
[0056] 圖3顯示了 pPIC9k/PfCSP-C重組表達質(zhì)粒的圖譜。
[0057] 圖4顯示了 pPIC9k/PfCSP_RC重組表達質(zhì)粒的圖譜。
[0058] 圖 5 顯示了 SDS-PAGE 檢測 PfCSP-C(圖 5A)和 PfCSP-RC(圖 5B)的表達。其中， 圖5A :在誘導前Ohr (泳道1)及誘導后21 (泳道2)、31 (泳道3)、46 (泳道4)、54 (泳道5)、 60 (泳道6)和70 (泳道7)小時分別取培養(yǎng)上清15 μ 1進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍 染色。在16. 5KD處出現(xiàn)一條PfCSP-C目的蛋白。圖5Β:在誘導前Ohr (泳道1)及誘導后 18 (泳道2)、28 (泳道3)和41 (泳道4)小時分別取培養(yǎng)上清15 μ 1進行SDS-PAGE電泳和 考馬斯亮藍染色。在31KD處出現(xiàn)一條目的蛋白。
[0059] 圖6顯示了免疫印跡法檢測PfCSP-C和PfCSP-RC表達的電泳圖。其中，泳道1代 表PfCSP-C的電泳結果，泳道2代表PfCSP-RC的電泳結果。用PfCSP免疫兔血清進行檢測。
[0060] 圖7顯示了純化的PfCSP-C和PfCSP-RC重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。表達上清 分離后，用離子交換柱和分子篩兩步純化，經(jīng)SDS-PAGE測定獲得目的蛋白純度大于95%。 泳道 I :PfCSP-RC，5 μ g ;泳道 2 :PfCSP-C，5 μ g。
[0061] 圖8顯示了用ELISA法測定聯(lián)合疫苗免疫兔血清抗NANP重復多肽IgG的水平。 各組分別為 ISA720 佐劑；ISA720 佐劑 +PfCP-2. 9 ;ISA720 佐劑 +PfCSP-C ;ISA720 佐劑 +PfCSP-RC ;ISA720 佐劑 +PfCSP-RC+PfCP-2. 9。

【具體實施方式】
[0062] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研宄，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，含有惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表 面蛋白的C端免疫區(qū)（元件A)的重組蛋白在表達后形成的構象非常接近PfCSP的C末端 的天然構象，將其作為抗原可非常有效地引起免疫應答，在動物體內(nèi)可產(chǎn)生高水平的特異 性抗體。并且，將所述的C端免疫區(qū)蛋白與由MSPl和AM-I融合而成的融合蛋白（參見中 國專利申請CN 01105292. 9,也稱為PfCP-2. 9)共同作為抗原進行免疫，可產(chǎn)生良好的聯(lián)合 免疫效果，因此所述的C端免疫區(qū)蛋白可以作為抗瘧疾多價聯(lián)合疫苗的組成成分?；诖?完成了本發(fā)明。
[0063] 如本發(fā)明所用，所述的"惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)"（或簡稱為 "C端免疫區(qū)"或"C端免疫區(qū)蛋白"）是指惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中位于中心重復 區(qū)與錨定區(qū)之間、且不包括中心重復區(qū)與錨定區(qū)的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述的"C端免疫 區(qū)"包括：惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的RII區(qū)和C-末端內(nèi)T、B細胞表位。
[0064] 如本發(fā)明所用，所述的"連接、克隆、表達或純化相關位點"是指：為了便于構建、表 達、純化所述重組蛋白或促進所述重組蛋白的免疫原性，而設計于所述重組蛋白上的結構， 這些結構本身不構成免疫反應的表位。
[0065] 惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白
[0066] 如本發(fā)明所用，"惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白（PfCSP) "是指與天然的或變異 的瘧原蟲PfCSP具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然瘧原蟲PfCSP基本上相 同的抗原活性的蛋白。所述的"惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白"的氨基酸序列比如可參見 GenBank 登錄號：X15363〇
[0067] PfCSP覆蓋在整個子孢子的表面，為子孢子正常發(fā)育和入侵肝細胞所必需，經(jīng)基因 敲除技術缺失PfCSP基因的伯氏瘧原蟲子孢子不能在蚊蟲卵囊內(nèi)正常發(fā)育。
[0068] 在蛋白結構上，PfCSP分子由N端、中心重復區(qū)以及C末端組成，其中心重復區(qū)由4 個氨基酸組成，即NANP，不同株間的變異表現(xiàn)為NANP重復次數(shù)的差異。在該重復區(qū)的兩側 分別含有兩個種間高度保守的區(qū)域，稱為RI區(qū)和RII區(qū)。PfCSP的C末端除RII區(qū)域外，還 含有其它的T、B細胞表位。
[0069] 盡管已知PfCSP可以作為一種開發(fā)瘧疾疫苗的候選抗原，然而，全長的PfCSP由于 序列較長，結構特殊比如含有34個中心四肽重復區(qū)，因此在真核表達系統(tǒng)進行分泌表達、 產(chǎn)生結構穩(wěn)定并兩個末端完整的重組蛋白等均比較困難。全長的序列表達產(chǎn)量不高，這給 疫苗生產(chǎn)制備帶來困難且疫苗成本高。此外，全長的PfCSP作為抗原，其主要的免疫保護區(qū) 如中心重復區(qū)等引起的免疫應答水平有限，而且有可能影響聯(lián)合疫苗中其它抗原的免疫應 答。
[0070] 開發(fā)瘧疾疫苗需要克服的一個問題是人體MHC分子多態(tài)性。由于人體MHC分子的 多態(tài)性，使得一些抗原不能與某些機體MHC分子結合，導致抗原遞呈受阻，出現(xiàn)免疫個體無 反應現(xiàn)象。因此，需在現(xiàn)有瘧原蟲抗原中鑒定出能識別多數(shù)人MHC分子的多反應表位，制成 疫苗，從而確保疫苗可在絕大多數(shù)個體中得到有效遞呈。
[0071] 重組蛋白及其編碼基因
[0072] 本發(fā)明提供了一種重組蛋白，所述重組蛋白具有以下結構：
[0073] 元件B-連接肽-元件A ;或
[0074] 元件A-連接肽-元件B ;
[0075] 其中，
[0076] 元件A為惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)；
[0077] 元件B為無，或惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中除C端免疫區(qū)以外的免疫反應表 位區(qū)域；
[0078] 連接肽為無，或長度為1-30氨基酸的肽，所述的連接肽對于元件A和元件B的構 象基本上無影響。
[0079] 作為一種更優(yōu)選的方式，所述的元件B是惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中心重復 區(qū)的部分或全部的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述中心重復區(qū)含有3-34個重復的NANP。更優(yōu)選 的，所述的中心重復區(qū)的氨基酸序列為：(NANP) 15。通常，所述的中心重復區(qū)的C端與所述的 C ?而免疫區(qū)的N ?而相連接。
[0080] 作為一種更優(yōu)選的方式，所述的元件B是惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白RI區(qū)的部 分或全部的氨基酸序列。通常，所述的RI區(qū)的C端與中心重復區(qū)的N端相連接。
[0081] 較優(yōu)選的，本發(fā)明人在所述的重組蛋白中，消除了糖基化位點的氨基酸序列。更優(yōu) 選的，本發(fā)明人將所述的惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的第382位的Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳la，從而 消除糖基化位點。
[0082] 此外，在本發(fā)明的重組蛋白的N端或C末端還可添加其它不影響該重組蛋白免疫 原性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列為有利于本發(fā)明的重組蛋白的表達 (如信號肽）或純化（如6XHis序列、釀酒酵母α-因子信號肽切割位點（Glu-Lys-Arg))， 或可促進本發(fā)明的重組蛋白的免疫原性（例如IL-2、GM-CSF等細胞因子的序列）。
[0083] 作為本發(fā)明的優(yōu)選實例，提供了重組蛋白PfCSP-C，它具有SEQ ID NO: 2所示的氨 基酸序列；以及重組蛋白PfCSP-RC，它具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
[0084] 本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的重組蛋白的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人 工合成，也可用PCR擴增或合成的方法獲得。
[0085] 為了提尚宿主細胞的表達量，可以對本發(fā)明的重組蛋白的編碼序列進彳丁改造，例 如采用宿主細胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列。在本發(fā)明的一個實施 例中，采用了酵母偏好的密碼子，并采用計算機DNA軟件對本發(fā)明的重組蛋白基因進行檢 測，排除在基因中不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列，包括內(nèi)含子剪切位點，轉(zhuǎn)錄終止序列等。
[0086] 在獲得了編碼本發(fā)明新重組蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，再 轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的重組 蛋白。
[0087] 如本文所用，術語"載體"包括質(zhì)粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。
[0088] 在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載 體，然后將編碼本發(fā)明新重組蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋 白表達載體。
[0089] 如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影 響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的 分泌，那么信號肽（分泌前導序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列 的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置 時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰近，而對于分泌前 導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0090] 在本發(fā)明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動 物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳地是酵母細胞。
[0091] 在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細胞后，可在適合表達本發(fā)明重組蛋白的條件下培養(yǎng)該細胞， 從而表達出重組蛋白。然后再分離出表達的重組蛋白。
[0092] 連接肽
[0093] 如本文所用，術語"連接肽"（linker)指位于元件A和元件B之間的、起連接作用 的短肽。連接肽的長度沒有特別限制。連接肽的長度也可為0,此時元件A和元件B直接 相連。通常，連接肽不影響或不顯著影響元件A和元件B氨基酸序列形成正確的折疊和空 間構象。一些連接肽的例子包括（但并不限于）：
[0094] (a)疏水性氨基酸Gly和Pro構成的3-15個氨基酸序列，例如 Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:7)；
[0095] (b)多克隆位點所編碼的氨基酸序列。該序列通常為2-20個，較佳地2-10個氨基 酸；
[0096] (c)由（a)或（b)組合形成的氨基酸序列。
[0097] 重組蛋白的用途
[0098] 本發(fā)明提供了所述重組蛋白的用途，其可被用于制備防治瘧疾的組合物，例如疫 苗。
[0099] 在本發(fā)明的實例中，本發(fā)明人合成了包含PfCSP的C端免疫區(qū)的氨基酸序列 的PfCSP-C、以及同時包含PfCSP的C端免疫區(qū)氨基酸序列和中心重復區(qū)氨基酸序列的 PfCSP-RC，并在畢氏酵母中分泌表達出蛋白。采用這兩個重組蛋白作為抗原免疫小鼠后，小 鼠血清能夠識別惡性瘧原蟲子孢子。而且，PfCSP-RC的免疫血清中含有高水平針對NANP重 復區(qū)的抗體（圖8)，而這種抗體具有抑制子孢子入侵肝細胞的作用。這些實例證明，本發(fā)明 的重組蛋白對于瘧疾的防治是非常有用的。
[0100] 疫苗
[0101] 本發(fā)明還提供了含有所述的重組蛋白作為免疫原的組合物。優(yōu)選的，本發(fā)明的組 合物是疫苗。所述的疫苗可以是預防性的（即預防感染）。
[0102] 這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸（如 核糖核酸或脫氧核糖核酸），通常與"藥學上可接受的載體"組合，這些載體包括本身不誘導 產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的 大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物（如 油滴或脂質(zhì)體）以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外， 這些載體可起免疫刺激劑（"佐劑"）作用。
[0103] 增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于：（1)鋁鹽（alum)，如氫氧化鋁、 憐酸錯、硫酸錯等；（2) ISA720佐劑；（3)福氏佐劑等。
[0104] 疫苗組合物（包括抗原，藥學上可接受的載體和/或佐劑），通常含有稀釋劑，如 水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等可存在于這 類運載體中。此外，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物可含有在藥學上可接受載體中 的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
[0105] 更具體地，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以 及上述其它所需的組分。"免疫有效量"指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或預 防是有效的。該用量根據(jù)所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別（如非人 靈長類等）、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療 狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實驗 來確定。
[0106] 通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還 可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在 脂質(zhì)體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。
[0107] 常規(guī)方法是從腸胃外（皮下或肌內(nèi)）途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其 它給藥方式的其它配方包括口服、栓劑和透皮應用等。治療劑量可以是單劑方案或多劑方 案。疫苗可以結合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予。
[0108] -種疫苗方式是DNA疫苗，即含有編碼本發(fā)明重組蛋白的編碼序列的DNA疫苗。
[0109] 聯(lián)合免疫
[0110] 瘧原蟲生活史復雜，在人體內(nèi)先后寄生于肝細胞和紅細胞內(nèi)，進行裂體增殖。其子 孢子在進入人體后，隨血侵入肝細胞，攝取肝細胞內(nèi)應用進行發(fā)育并裂體增殖，形成紅外期 裂殖體。紅外期裂殖子從肝細胞釋放出來后，進入血流后很快侵入紅細胞，進行紅內(nèi)期裂體 增殖。
[0111] 瘧原蟲的抗原具有明顯的期特異性，由期特異抗原產(chǎn)生的免疫力只對本期瘧原蟲 有作用，也就是說紅外期抗原產(chǎn)生的免疫只對子孢子和肝內(nèi)原蟲有效，而對紅內(nèi)期瘧原蟲 無效。這樣，若紅外期疫苗不能100%有效，當個別子孢子逃避紅外期疫苗保護，這些子孢子 即可產(chǎn)生大量裂殖子進入紅內(nèi)期繁殖，由于紅外期疫苗對紅內(nèi)期原蟲無效，因此紅內(nèi)期原 蟲繁殖即可致病乃至致命。因此，一個有效的疫苗最好由針對瘧原蟲多個生長環(huán)節(jié)的抗原 組成，這樣可增強疫苗的有效性和克服瘧原蟲變異性等問題。特別是將紅內(nèi)期抗原與紅外 期抗原聯(lián)合，這種聯(lián)合疫苗對紅內(nèi)期和紅外期原蟲均能產(chǎn)生殺滅作用。
[0112] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組蛋白可有效地引起針對紅外期惡性瘧原蟲的免疫應 答，其與紅內(nèi)期候選疫苗PfCP-2. 9的聯(lián)合免疫試驗中未發(fā)現(xiàn)抗原競爭性免疫抑制現(xiàn)象，并 且聯(lián)合免疫血清能夠更有效抑制瘧原蟲的生長。因此，本發(fā)明的重組蛋白與紅內(nèi)期候選疫 苗PfCP-2. 9可以作為抗瘧疾多價聯(lián)合疫苗的組成成分。
[0113] 抗體
[0114] 本發(fā)明還包括對本發(fā)明的重組蛋白或其編碼DNA具有特異性的多克隆抗體和單 克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結合于本發(fā)明的重組蛋白或其片 段。較佳地，指那些能與本發(fā)明的重組蛋白或其片段結合但不識別和結合于其它非相關抗 原分子的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的本發(fā)明的重組蛋白結合的抗 體。
[0115] 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片 段，如Fab'或（Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗 體。
[0116] 本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如， 純化的本發(fā)明的重組蛋白，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表 達本發(fā)明的重組蛋白的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以 利用雜交瘤技術來制備（見Kohler等人，Nature 256 ;495, 1975 ;Kohler等人，Eur. T. Tmmunol. 6:511，1976 ;Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6:292, 1976 ；Hammerl ing 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981)〇
[0117] 多克隆抗體的生產(chǎn)可用本發(fā)明的重組蛋白或多肽免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠 等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于福氏佐劑、ISA720佐劑等。
[0118] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0119] (1)本發(fā)明的重組蛋白作為抗原可非常有效地引起免疫應答，在動物體內(nèi)可產(chǎn)生 高水平的特異性抗體。
[0120] (2)本發(fā)明的重組蛋白與紅內(nèi)期瘧疾候選疫苗PfCP-2. 9作為聯(lián)合疫苗免疫動物 時，不發(fā)生抗原競爭性現(xiàn)象。免疫血清能識別紅內(nèi)期原蟲和子孢子，含有高水平的能抵抗子 孢子入侵的NANP四肽重復區(qū)抗體，并能抑制瘧原蟲體外生長。
[0121] (3)本發(fā)明的重組蛋白采用畢氏酵母分泌表達系統(tǒng)表達，由此產(chǎn)生的蛋白的構象 非常接近天然PfCSP的C-末端結構。
[0122] (4)本發(fā)明的重組蛋白的表達產(chǎn)物能分泌到胞外，并進入無蛋白培養(yǎng)上清，便于分 離純化。此外，根據(jù)該蛋白高等電點的特性，建立簡便高效以離子交換純化為基礎的制備工 藝純度可達95%以上。
[0123] (5)本發(fā)明的重組蛋白的表達水平高，在15L發(fā)酵罐中表達產(chǎn)量在lg/L以上。
[0124] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人的分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0125] 實施例I PfCSP-C和PfCSP-RC基因的合成
[0126] 1.重組蛋白的設計
[0127] 本發(fā)明PfCSP-C和PfCSP-RC重組蛋白的序列來自惡性瘧原蟲3D7株環(huán)子孢子表 面蛋白的氨基酸序列，其氨基酸序列見GenBank登錄號：X15363(SEQ ID N0:8)。
[0128] PfCSP-C重組蛋白由PfCSP的C末端區(qū)域（不含錨定區(qū)）組成，PfCSP-RC重組蛋 白由PfCSP的RI區(qū)、中心重復區(qū)以及C末端（不含錨定區(qū)）組成，各個功能區(qū)直接相連。圖 1顯示了本實施例構建的天然PfCSP、PfCSP-C和PfCSP-RC的蛋白結構的示意圖。
[0129] 此外，在融合抗原的N端增設XhoI克隆位點（Leu-Glu)和釀酒酵母α -因子信號 肽切割序列（Lys-Arg)。鑒定出該抗原序列中一個潛在糖基化位點（SEQ ID Ν0:2中的第 114位氨基酸，和SEQ ID NO: 4中的第203位氨基酸），并通過將氨基酸Asn轉(zhuǎn)為Ala (SEQ ID N0:2中的114Asn，和SEQ ID N0:4中的203Asn)而排除這一個糖基化位點。
[0130] 這樣，PfCSP-C重組抗原由116個氨基酸組成，如SEQ ID NO: 2所示，而PfCSP-RC 融合抗原由205個氨基酸組成，見SEQ ID NO:4所示。
[0131] 2.重組抗原基因的設計
[0132] 選用酵母密碼子使用頻率，將PfCSP-C和PfCSP-RC氨基酸序列逆轉(zhuǎn)錄成DNA序 列，產(chǎn)生PfCSP-C和PfCSP-RC合成基因。
[0133] 并且，采用計算機DNA軟件（DNAstar)對該基因進行檢測，并排除在該基因中不利 于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列，包括內(nèi)含子剪切位點，轉(zhuǎn)錄終止序列等。
[0134] 最終獲得的PfCSP-C合成基因的全長為360bp，如SEQ ID NO: 1所示，而PfCSP-RC 為627bp，如SEQ ID N0:3所示（3'端的12個堿基是轉(zhuǎn)錄終止序列TaaTag和克隆位點 EcoRI)〇
[0135] 3.融合抗原基因的合成
[0136] PfCSP-RC基因的構建：
[0137] 627bp PfCSP-RC基因由8條寡核苷酸鏈拼接而成（Overlap PCR法）。相鄰兩條 鏈設有18?20bp的重疊區(qū)。用PCR方法將8條鏈拼接成雙鏈DNA分子，合成示意圖見圖 2A。PCR擴增條件為：95°C 10秒（變性）、55°C 30秒（退火）和72°C 1分30秒（延伸）， 每次25個循環(huán)。
[0138] PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖膠分離，并用Qiagen DNA回收試劑盒分離目的基因。用XhoI 和EcoRI雙酶切目的基因片段，酶切條件為：在20 μ 1反應體系中含有2 μ g目的基因片段， IX酶切緩沖液，XhoI及EcoRI酶各5單位，37°C反應1小時。酶切片段與經(jīng)同樣酶切的 pBluscript載體（購于Invitrogen公司）連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a大腸桿菌。抽提氨卞 青霉素抗性菌落的質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切鑒定為正確插入后進行DNA序列分析。在所測2個克 隆中，有一個克隆的序列無任何錯誤堿基。于是形成627bp全長PfCSP-RC合成基因 （SEQ ID NO:3)〇
[0139] 為使PfCSP-RC基因能在畢氏酵母中分泌表達，本發(fā)明人在設計基因時，已經(jīng)在 該基因5'端進行修飾，S卩加上編碼Lys和Arg兩個氨基酸的DNA序列，這兩個氨基酸是 a -因子信號肽切割位點的序列。在PfSCP-RC基因的5'及3'端分別含有XhoI及EcoRI 位點用于該基因克隆入表達載體。
[0140] PfCSP-C基因的構建：
[0141] 合成以下一對引物：
[0142] 5' 引物序列 Pa(SEQ ID NO:5):
[0143] ccg etc gag aaa aga aac aag aat aac caa ggt ；
[0144] 3' 引物序列 Pb (SEQ ID NO: 6):
[0145] egg gaa ttc eta tta tga gga tgc aac tac at〇
[0146] 以前述制備的PfCSP-RC基因為模板，用以上引物進行PCR反應，獲得 360bpPfCSP-C基因，合成示意圖見圖2B。
[0147] 將上述獲得的基因克隆入pBluscript載體進行序列分析。證實無錯誤序列的 PfCSP-C基因用于表達研宄。
[0148] 實施例2 PfCSP-C和PfCSP-RC基因在畢氏酵母中分泌表達
[0149] 2. 1表達載體的構建
[0150] PfCSP-C和PfCSP-RC基因通過XhoI和EcoRI位點插入到pPIC9酵母表達質(zhì)粒（購 于Invitrogen公司）。這樣，重組蛋白的N端與該載體上釀酒酵母α -因子信號肽C末端 融合。由于重組蛋白分子N端含有該信號肽切點3個特異氨基酸Glu-Iys-Arg序列。故分 泌表達釋放的目的蛋白不含信號肽序列。
[0151] PPIC9K載體的基本元件與pPIC9相同，但它帶有卡那霉素抗性基因，可用G418 進行高拷貝插入子的篩選。這樣，用BamH I和EcoR I將含PfCSP-C和PfCSP-RC片段從 pBluscript載體切出，并插入pPIC9K表達質(zhì)粒的相應位點中，構建成pPIC9K/PfCSP-C (圖 3)和 pPIC9K/PfCSP-RC (圖 4)。
[0152] 2. 2轉(zhuǎn)化畢氏酵母GS115
[0153] 用 Sal I 將 pPIC9K/PfCSP-C 和 pPIC9K/PfCSP-RC 質(zhì)粒分別線性化，IOyg 線性化 表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化GSl 15畢氏酵母（購于Invitrogen公司）。
[0154] 轉(zhuǎn)化菌先用組氨酸缺陷平板篩選His+轉(zhuǎn)化子，然后用不同濃度G418平板篩選多 拷貝插入的轉(zhuǎn)化子。
[0155] 抽提不同轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，用一對目的基因內(nèi)部引物PCR加以鑒定，表明表達 質(zhì)粒插入酵母染色體。經(jīng)鑒定有插入的轉(zhuǎn)化子用于以下表達研宄。
[0156] 2. 3 PfCSP-C 和 PfCSP-RC 表達
[0157] 轉(zhuǎn)化子先接種在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，生長24小時后，轉(zhuǎn)接到的以甲醇為碳 源的培養(yǎng)基中。進行誘導表達。每24小時取樣、檢測表達產(chǎn)物上清和細胞沉淀。
[0158] SDS-PAGE和考馬斯亮藍檢測結果顯示：在16. 5kD處有明顯的PfCSP-C表達條帶， 該表達帶只在甲醇誘導后出現(xiàn)，并隨表達時間延長，其表達產(chǎn)物明顯增加，見圖5A。在31kD 處有明顯的PfCSP-RC表達條帶，該表達帶只在甲醇誘導后出現(xiàn)，并隨表達時間延長，其表 達產(chǎn)物明顯增加，見圖5B。
[0159] 用兔抗PfCSP抗血清進行免疫印跡法檢測表達產(chǎn)物，結果可見目的蛋白印跡，見 圖6,其中，1表示PfCSP-C的印跡，2表示PfCSP-RC的印跡。
[0160] 實施例3 PfCSP-C和PfCSP-RC發(fā)酵與純化
[0161] 經(jīng)對表達條件的優(yōu)化研宄，搖瓶表達水平可達100mg/L。用15L灌進行發(fā)酵表達。 在整個發(fā)酵周期中，前期的細胞呈指數(shù)生長上升，細胞密度達〇D_= 100。到甘油添加生長 期，細胞生長呈直線上升，細胞密度達到〇D_= 560。但到了甲醇誘導表達階段，細胞總密 度基本保持不變，而目的蛋白表達是在甲醇加入后3-7hr開始，并隨時間延長，表達產(chǎn)率迅 速提高，并不斷分泌到發(fā)酵液中，這兩個重組蛋白的表達量可達lg/L以上。
[0162] PfCSP-C和PfCSP-RC表達產(chǎn)物的純化分兩步進行：由于這兩個重組蛋白的等電 點分別為7. 23和8. 66,因此第一步可以用陽離子交換柱純化。第二步是用凝膠過濾層析 純化。經(jīng)兩步純化的蛋白純度可達95%。純化的PfCSP-C(I)和PfCSP-RC(2)重組蛋白的 SDS-PAGE電泳圖見圖7。
[0163] 實施例4 PfCSP-C和PfCSP-RC免疫小鼠和家兔
[0164] 在該實施例中，用純化的PfCSP-C和PfCSP-RC為抗原，用ISA720為免疫佐劑免疫 家兔，實驗分為6組：
[0165] 第一組：ISA720+PfCP-2. 9 ;
[0166] 第二組：ISA720+PfCSP_C ;
[0167] 第三組：ISA720+PfCSP-RC ;
[0168] 第四組：ISA720+PfCP-2. 9+PfCSP-C ;
[0169] 第五組：ISA720+PfCP-2. 9+PfCSP-RC ;
[0170] 第六組：ISA720佐劑對照。
[0171] 免疫分4次進行，每次免疫分別在第0、20、40、和61天進行。每次免疫前及免疫結 束后兩周左右取血測定特異抗體水平。具體方法如下：
[0172] 重組蛋白與ISA720佐劑按3:7的比例混合，用注射器抽吸乳化至均勻。免疫劑量 為每只家兔200 μ g，為Iml體積。采用皮下多點注射。四次免疫注射時間分別在DO、D20、 D40和D61。在首次免疫后D33和D54、D75取血測定抗體ELISA及IFA滴度。
[0173] ELISA按以下程序進行：
[0174] 采用重組蛋白為抗原，每孔包被量為0. 1 μ g，加入不同稀釋度的抗血清100 μ 1， 每份稀釋血清樣本重復三孔，經(jīng)37°C反應Ihr和洗滌后，加入酶標二抗，用TMD底物顯色， 并讀取450mM OD值。用免疫前血清確定陽性閾值，大于該值的稀釋度為抗血清陽性最終滴 度。
[0175] IFA按以下程序進行：
[0176] 按國際上通用的Trager氏蠟燭缸法體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲FCC1/HN株，待生長至裂 殖體階段時取培養(yǎng)液進行涂片。自然干燥，預冷甲醇固定15分鐘。用IOmM PH7.4PBS洗片， 然后用含3%脫脂奶粉的PBS封閉30分鐘。待檢血清用封閉液從1 :20開始對倍稀釋，共 6個稀釋度；一張玻片分成8格，每格加一個稀釋度的樣品，剩余兩格加陽性血清和免疫前 血7清（皆為1 :20稀釋）。37°C孵育1小時，然后用PBS液洗片3次，5min/次。FITC標 記的抗人IgG用封閉液1:100稀釋，然后加到玻片上各個樣品所對應的反應位點上。37°C 孵育1小時，然后用PBS液洗片3次，置于暗處，晾干片子。熒光顯微鏡下讀片，先觀察陽性 對照，判斷反應體系是否正常。然后，觀察陰性對照，應該出現(xiàn)比較暗淡的背景，而不能出現(xiàn) 較為明顯的熒光裂殖子。這兩個對照正常的前提下，從最低稀釋度開始從低到高觀察樣品 反應情況，以出現(xiàn)熒光裂殖子的數(shù)目明顯多于陰性對照時的最大稀釋度為該樣品的IFA滴 度。對于針對子孢子的IFA試驗，則用惡性瘧原蟲子孢子代替紅內(nèi)期瘧原蟲。
[0177] 表1顯示了以PfCP-2. 9、PfCSP-C、PfCSP-RC或其組合作為抗原，與佐劑ISA720混 合后，單獨免疫或聯(lián)合免疫小鼠和兔后，血清中PfCP-2. 9、PfCSP-C和PfCSP-RC特異IgG的 水平。各組分別為 ISA720 佐劑；ISA720 佐劑 +PfCP-2. 9 ;ISA720 佐劑 +PfCSP-C ;ISA720 佐 劑 +PfCSP-C+PfCP-2. 9 ;ISA720 佐劑 +PfCSP-RC ;ISA720 佐劑 +PfCSP-RC+PfCP-2. 9。ELISA 結果顯示，佐劑對照組沒有產(chǎn)生特異性抗體，其余組均產(chǎn)生很高的特異性抗體水平，而且 PfCSP-C和PfCSP-RC重組蛋白單獨免疫與聯(lián)合免疫組之間沒有明顯差異。
[0178] 表 1
[0179]

【權利要求】
1. 一種分離的DNA分子，其特征在于，該DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3中第 13-627位所示。
2. -種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子。
3. -種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為畢赤酵母細胞， 它含有權利要求2所述的載體；或 它的基因組中整合有權利要求1所述的DNA分子。
【文檔編號】C12N15/81GK104480129SQ201410673734
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2006年12月1日 優(yōu)先權日:2006年12月1日
【發(fā)明者】潘衛(wèi)慶, 張青鋒 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學