棉花類固醇C22α-羥化酶基因GhCYP90B1在改良番茄品質(zhì)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種棉花類固醇C22α-羥化酶基因GhCYP90B1在改良番茄品質(zhì)中的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明的應(yīng)用主要通過(guò)制備高表達(dá)GhCYP90B1基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株實(shí)現(xiàn)；利用組成型植物啟動(dòng)子CaMV 35S控制GhCYP90B1基因在番茄中表達(dá)，可以促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄種子萌發(fā)以及根的生長(zhǎng)。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)增大，單果重量增加，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中可溶性糖、可溶性蛋白和Vc含量都明顯增加。GhCYP90B1基因可應(yīng)用于改良番茄果實(shí)品質(zhì)的育種。
【專利說(shuō)明】棉花類固醇C22a-羥化酶基因 GhCYP90B1在改良番茄品質(zhì) 中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種棉花類固醇C22 a-羥化酶基因 GhCYP90Bl在改良番茄品質(zhì)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 油菜素類固醇類物質(zhì)（Brassinosteroids，BRs)是廣泛存在于植物體中的一種類 固醇植物激素。BRs在植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多生理過(guò)程中都具有重要的作用，而且濃度極低 (nmol · Γ1)的BRs就能表現(xiàn)出極高的生理活性，因此油菜素類固醇類物質(zhì)被認(rèn)為是繼生長(zhǎng) 素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯之后的第六大植物激素。
[0003] 在模式植物擬南芥上的研究表明，BRs合成和信號(hào)傳導(dǎo)途徑的缺失突變體表現(xiàn)出 極度矮化的表型，同時(shí)出現(xiàn)葉片變小、開(kāi)花數(shù)少、結(jié)實(shí)率極低等表型。在擬南芥中超量表達(dá) BRs基因能有效提高植物體中油菜素內(nèi)酯的含量，同時(shí)植株表現(xiàn)出葉片舒展、葉柄變長(zhǎng)、花 序軸變長(zhǎng)、花序軸數(shù)量增多、果莢數(shù)增多、種子產(chǎn)量增加等表型。這些結(jié)果表明，BRs對(duì)植物 生長(zhǎng)發(fā)育有非常重要的作用，BRs的合成或者信號(hào)傳導(dǎo)途徑受阻會(huì)顯著影響植物的正常生 長(zhǎng)發(fā)育，極大的降低植物的育性以及生物總量；反之，提高植物體中BRs的含量能有效提高 植物生物總量，增加果實(shí)數(shù)和種子數(shù)，促進(jìn)光合產(chǎn)物從源到庫(kù)的流動(dòng)。這說(shuō)明BRs在提高植 物的營(yíng)養(yǎng)組織的生物產(chǎn)量和果實(shí)種子產(chǎn)量和品質(zhì)上有較大的潛力。
[0004] 目前人工合成的BRs類似物已經(jīng)一定程度上在生產(chǎn)中得到應(yīng)用，其結(jié)果表明，BRs 類似物能有效提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀。利用"天豐素"（一種人工合成的油菜素內(nèi) 酯）對(duì)水稻種子浸種，不但發(fā)芽率可以提高10%以上，而且出芽齊，芽后的秧苗壯，根系十 分發(fā)達(dá)，不易感染病害；在生長(zhǎng)期應(yīng)用可促進(jìn)光合作用，植株壯，平均每株分蘗多1. 5?3個(gè) 小枝；在花前噴施對(duì)提高花粉活性、促進(jìn)授粉十分有利；灌漿期噴施可以促進(jìn)籽粒飽滿，明 顯提高千粒重，減少敗育粒。用BR做10種蔬菜的增產(chǎn)試驗(yàn)，普遍都有增產(chǎn)，幅度在10%? 30%之間；分析營(yíng)養(yǎng)成分后發(fā)現(xiàn)，一些對(duì)人體健康有利的成分都有不同程度的增加，而對(duì)人 體不利的有機(jī)酸類（破壞人體鈣質(zhì)）成分明顯下降；而且應(yīng)用BR后蔬菜、瓜果的表皮油亮 光滑、外觀亮麗，很少有畸型瓜果，大大提高了農(nóng)產(chǎn)品的商品性能（油菜素內(nèi)酯在農(nóng)業(yè)上的 應(yīng)用成效，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,5)。此外，BRs在糧食作物如小麥、水稻、玉米的示范試驗(yàn)中 施用BRs仍具有明顯效果。這些在生產(chǎn)應(yīng)用上的實(shí)例表明，BRs對(duì)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品 質(zhì)性狀有明顯效果，這對(duì)于提高農(nóng)作物產(chǎn)量，提高人們的生活品質(zhì)有重要意義。
[0005] 雖然外施BRs能夠有效提高農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，但是人工化學(xué)合成BRs類似物 的過(guò)程非常復(fù)雜，在合成過(guò)程中存在對(duì)環(huán)境的污染。而且合成留體母核所用的原材料豆甾 醇、麥角留醇和孕留醇酮價(jià)格比較昂貴，在合成側(cè)鏈時(shí)由于存在四個(gè)手性中心，所合成的甾 醇產(chǎn)物也會(huì)存在一些非活性構(gòu)型，從而進(jìn)一步增加了 BRs的人工合成成本。另外，由于油菜 素內(nèi)酯類物質(zhì)的生理活性極高，施用過(guò)程中濃度難以控制，由此也會(huì)導(dǎo)致施用效果不穩(wěn)定， 甚至因濃度過(guò)大對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生危害。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物體內(nèi)高生理活性BRs的含 量，在選擇適宜的轉(zhuǎn)基因株系后，能有效避免上述問(wèn)題，同時(shí)也可以獲得產(chǎn)量和品質(zhì)提高的 作物。
[0006] 在擬南芥中研究表明AtCYP90B I (AtDWF4)是一個(gè)BRs合成的關(guān)鍵限速酶，催 化油菜素類固醇物質(zhì)在C-22上的α-羥基化。研究發(fā)現(xiàn)AtDWF4的底物在植物體中大 量累積但生理活性極低，而AtDWF4的直接產(chǎn)物在植物體中含量極低，卻有很高的生理 活性。這表明AtDWF4基因的表達(dá)可能受到了很嚴(yán)密的調(diào)控，從而維持植物體內(nèi)有生理 活性的BRs在一定的濃度水平。進(jìn)一步對(duì)擬南芥dwf4突變體、野生型和超量表達(dá)DWF4 基因的擬南芥植株中BRs的檢測(cè)含量，發(fā)現(xiàn)在野生型中campestanol(DWF4的底物）比 6-Deoxocathasterone(DWF4的產(chǎn)物）含量高150倍，突變體中幾乎檢測(cè)不到或只能檢測(cè)到 極少量的DWF4的下游產(chǎn)物，而超量表達(dá)DWF4基因的擬南芥中有生理活性的BRs總量明顯 增多。這一結(jié)果表明了 DWF4基因可能是維持植物體內(nèi)有生理活性的BRs的一個(gè)關(guān)鍵酶基 因，能夠決定植物體內(nèi)有生理活性的BRs的總量。
[0007] 番爺（Lycopersicon esculentum Mill)是爺科（Solanaceae)番爺屬 (Lycopersicon)的一年生或多年生植物。作為一種世界性蔬菜，栽培面積廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較 高，是保護(hù)地內(nèi)經(jīng)濟(jì)效益較高的蔬菜之一，約占整個(gè)保護(hù)地蔬菜種植面積的30%。番茄作為 重要的果蔬植物，在國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中占有舉足輕重的地位。番茄果實(shí)是番茄的經(jīng)濟(jì)器官， 研究番茄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制對(duì)改良番茄產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要實(shí)踐意義。
[0008] 果實(shí)發(fā)育和成熟是一個(gè)周密協(xié)調(diào)的，時(shí)間和空間緊密調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。 番茄果實(shí)發(fā)育可分為4個(gè)時(shí)期，時(shí)期I包括花的發(fā)育、授粉、受精和坐果。時(shí)期II是指授粉 后7?14天細(xì)胞分裂過(guò)程。在這一時(shí)期絕大多數(shù)果實(shí)細(xì)胞已經(jīng)形成，此時(shí)的細(xì)胞數(shù)是決定 果實(shí)大小的主要因素。時(shí)期III主要包括果實(shí)細(xì)胞膨大過(guò)程，一般持續(xù)3?5周并達(dá)到最 大形態(tài)。時(shí)期IV是指果實(shí)成熟階段，表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢而代謝反應(yīng)強(qiáng)烈?？梢?jiàn)番茄果實(shí)發(fā)育 涉及許多生理生化過(guò)程。番茄果實(shí)作為一種典型的呼吸躍變果實(shí)，是研究果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和 成熟的理想材料。因此研究番茄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制不僅具有重要的實(shí)踐意義， 而且具有重要的理論價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種棉花類固 醇 C22 α -輕化酶基因 （Gossypium hirsutum. L brassinosteroids C22 a -hydroxylase) GhCYP90Bl在改良番茄品質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，提高轉(zhuǎn)基因番茄中CYP90B1 基因的表達(dá)水平，能夠有效提商番爺體內(nèi)源商生物活性BRs的水平，進(jìn)而獲得品質(zhì)性狀得 到改良的番茄。
[0010] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種棉花類固醇C22ci-羥化酶基因 GhCYP90Bl在改善番茄品質(zhì)性狀中的應(yīng)用，通過(guò)高表達(dá)GhCYP90Bl基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株 實(shí)現(xiàn)，所述的品質(zhì)性狀包括種子萌發(fā)率，幼苗生長(zhǎng)速度，植株生長(zhǎng)速度，果實(shí)的發(fā)育，果實(shí)品 質(zhì)（可溶性糖、可溶性蛋白和Vc含量）方面。
[0011] 所述的高表達(dá)GhCYP90Bl基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株的具體制備步驟如下：
[0012] 1)提取棉花的cDNA或棉花DNA為模板，運(yùn)用引物GhCYP90Bl-l和GhCYP90Bl-2， 擴(kuò)增獲得GhCYP90Bl基因；所述的引物GhCYP90Bl-l序列如SEQ ID NO. 5所示，所述的引物 GhCYP90Bl-2 的序列如 SEQ ID NO. 6 所示；
[0013] 2)將GhCYP90Bl基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，獲得GhCYP90Bl基因植物表達(dá)載 體；
[0014] 3)將GhCYP90Bl基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404,獲得含GhCYP90Bl 基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株；然后通過(guò)葉片感染的方法導(dǎo)入番茄中，獲得高表達(dá) GhCYP90Bl基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株。
[0015] 步驟1)中所述的GhCYP90Bl基因?yàn)榫哂邢率龊塑账嵝蛄兄唬?br> [0016] (1)如 SEQ ID NO. 1 所示的 cDNA 序列；
[0017] (2)如 SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3 所示的 gDNA 序列；
[0018] (3)與（1)或⑵所述的核苷酸序列具有85%以上同源性，且編碼相同功能蛋白 質(zhì)的DNA序列；或
[0019] (4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與（1)或（2)所述的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；其中 所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在6XSSC或6XSSPE，0. 1% SDS，2XDenhardt溶液于65°C條件下雜交； 在0· 1XSSC，0. 1% SDS溶液于5°C條件下洗膜。
[0020] 步驟2)中所述的植物表達(dá)載體中包含的啟動(dòng)子為增強(qiáng)型、組成型、組織特異型和 /或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0021] 步驟3)中所述的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入方法為電激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入。
[0022] 本發(fā)明所述的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列為編碼棉花BRs合成酶基因 GhCYP90Bl 的 cDNA序列，SEQ ID NO. 2和 SEQ ID NO. 3所示的兩個(gè)核苷酸序列 gGhCYP90Bl-l 和gGhCYP90Bl-2為gDNA(基因組）序列。cDNA序列為編碼序列，gDNA序列除編碼序列外 還含有外顯子和內(nèi)含子序列。
[0023] 由上述GhCYP90Bl基因編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，將SEQ ID NO. 4的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘 基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO. 4的氨基酸殘基序列相同生物活性的由SEQ ID NO. 4衍生的蛋白質(zhì)序列也同樣屬于上述范圍。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供的植物或微生物表達(dá)載體，其至少含編碼油菜素內(nèi) 酯合成酶基因 GhCYP90Bl的核苷酸和啟動(dòng)子序列，所述植物或微生物表達(dá)載體通過(guò)將編碼 BRs合成酶基因 GhCYP90Bl、啟動(dòng)子序列與植物表達(dá)載體可操作地連接而構(gòu)建。為了篩選 和表達(dá)的需要，還可選地在表達(dá)載體中包含篩選基因序列、報(bào)告基因序列以及其它的為基 因工程操作的需要而插入的各種內(nèi)切酶位點(diǎn)，篩選基因和報(bào)告基因可以從本領(lǐng)域常用的基 因序列中選擇，優(yōu)選地，本發(fā)明的植物表達(dá)具有如圖1所示的結(jié)構(gòu)。例如，可以在所述表達(dá) 載體中加入在植物或微生物中能表達(dá)的編碼可發(fā)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如 GUS基因、GFP基因、熒光素酶等；具有抗性的抗生素標(biāo)記物，如抗慶大霉素標(biāo)記物、抗卡拉 霉素標(biāo)記物等；抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因，如抗除早劑基因等。
[0025] 用于構(gòu)建本發(fā)明植物表達(dá)載體的啟動(dòng)子可以是任意一種啟動(dòng)子，包括增強(qiáng)型、組 成型、組織特異型以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，所述啟動(dòng)子可以單獨(dú)使用，還可以 和其它植物啟動(dòng)子或微生物啟動(dòng)子結(jié)合使用。用于構(gòu)建本發(fā)明植物表達(dá)載體的啟動(dòng)子優(yōu) 選組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子，更優(yōu)選來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物組成型啟動(dòng)子 CaMV35S。通常，將GhCYP90Bl基因構(gòu)建在CaMV35S的下游。
[0026] 用于構(gòu)建本發(fā)明植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可以是任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或者 可用于微彈轟擊的載體。
[0027] 在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案中，將GhCYP90Bl基因正向插入植物表達(dá)載體 pCambia-35S-MCS-N0S-NPT II中，用CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，構(gòu)建了含有GhCYP90Bl基因 的植物表達(dá)載體pCambia-35S-GhCYP90Bl-N0S-NPT II，其具有如圖3所示的結(jié)構(gòu)，該表達(dá) 載體同時(shí)包含了報(bào)告基因序列，篩選基因序列和用于基因操作的各內(nèi)切酶位點(diǎn)，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以理解的是，上述報(bào)告基因、篩選基因好各基因操作序列均是可以替換的，本發(fā)明 并不對(duì)此進(jìn)行限制。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種轉(zhuǎn)化體，通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物或微生 物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法，將含有本發(fā)明 GhCYP90Bl基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染番茄或微生物宿主而獲得轉(zhuǎn)化體。被轉(zhuǎn)化的宿主是番茄。
[0029] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0030] 本發(fā)明提供了 GhCYP90Bl基因在提高番茄果實(shí)品質(zhì)中的新用途，成功地構(gòu)建了包 含GhCYP90Bl基因和啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，并以該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄獲得轉(zhuǎn)基因番茄， 在轉(zhuǎn)基因番茄中GhCYP90Bl基因被超量表達(dá)。超量表達(dá)的GhCYP90Bl基因明顯了促進(jìn)番茄 植株的生長(zhǎng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄種子萌發(fā)以及根的生長(zhǎng)。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)增大，單果重 量增加，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中可溶性糖、可溶性蛋白和Vc含量都明顯增加。因此GHCYP90B1 基因可應(yīng)用于改良番茄果實(shí)品質(zhì)的育種。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1 :含GhCYP90Bl基因的植物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)圖，其中：35S，代表CaMV35S啟動(dòng) 子；GhCYP90Bl，代表GhCYP90Bl基因 cDNA ;term，代表終止子；LB，代表T-DNA左邊界；RB，代 表T-DNA右邊界。
[0032] 圖2 :組成型啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控下的棉花GhCYP90Bl基因表達(dá)載體的構(gòu)建流程 圖，其中：GRP-GusPlus-His6,代表⑶SPlus報(bào)告基因，該基因在N端融合了 GRP信號(hào)肽， 在C端融合了 His6序列標(biāo)簽；NPTII，代表新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，具有卡拉霉素抗性； Nosterm，Nos終止子；CaMV 35S，來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動(dòng)子；LB，T-DNA左 邊界；RB, T-DNA右邊界。pUC-GhCYP90Bl載體為對(duì)GhCYP90Bl基因進(jìn)行TA克隆時(shí)獲得的 載體，植物表達(dá)載體為改造的PCambia載體，即pCambia-35S-MCS-N0S-NPT II (詳見(jiàn)實(shí)施例 2)。pUC-GhCYP90Bl載體用KpnI和XbaI酶切后，回收GhCYP90Bl片段。改造的pCambia載 體用KpnI和XbaI酶切后回收載體?；厥盏妮d體片段和目的基因片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 獲得超量表達(dá)GhCYP90Bl基因的植物表達(dá)載體pCambia-35S-GhCYP90Bl-N0S-NPT II。
[0033] 圖3 :本發(fā)明的植物表達(dá)載體pCambia-35S-GhCYP90Bl-N0S-NPT II的結(jié)構(gòu)圖。
[0034] 圖4 :轉(zhuǎn)基因番茄植株的分子鑒定和組織化學(xué)鑒定，其中：A為轉(zhuǎn)基因番茄植株的 分子鑒定；M，核苷酸片段分子量標(biāo)準(zhǔn)；+，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因番茄的植物表達(dá)載體為模板；CK，野 生型番茄；W，以水為PCR擴(kuò)增模板；0D4-1?0D4-5,超量表達(dá)GhCYP90Bl轉(zhuǎn)基因番茄中1至 5號(hào)株系；B為轉(zhuǎn)基因番茄植株的組織化學(xué)鑒定；CK，野生型番茄；0D4-1?0D4-3,超量表達(dá) GhCYP90Bl轉(zhuǎn)基因番茄中1至3號(hào)株系。
[0035] 圖5 :超量表達(dá)GhCYP90Bl轉(zhuǎn)基因番茄株系中GhCYP90Bl基因的表達(dá)分析圖，其 中：A為半定量RT-PCR分析；LeTUB，番茄微管蛋白基因，作為內(nèi)標(biāo)；B為實(shí)時(shí)定量RT-PCR分 析。CK :野生型番茄；0D4-3?0D4-14 :超量表達(dá)GhCYP90Bl轉(zhuǎn)基因番茄中4至14號(hào)株系。
[0036] 圖6 :超量表達(dá)GhCYP90Bl基因促進(jìn)種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)，其中：A為轉(zhuǎn)基因番茄 和野生型番茄幼苗。超量表達(dá)GhCYP90Bl基因促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄幼苗下胚軸的伸長(zhǎng)；B:為轉(zhuǎn) 基因番茄和野生型番茄植株。超量表達(dá)GhCYP90Bl基因促進(jìn)轉(zhuǎn)基因番茄植株生長(zhǎng)，株高增 力口，節(jié)間變長(zhǎng)，葉片增大；C為轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄種子萌發(fā)；D為轉(zhuǎn)基因番茄和野生型 番茄種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)。CK :野生型番茄；0D4-6 :超量表達(dá)GhCYP90Bl轉(zhuǎn)基因番茄6號(hào)株系。
[0037] 圖7 :轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的大小和成熟情況，其中：A :轉(zhuǎn) 基因番茄和野生型番茄果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的大小和著色；B :轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄不 同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)縱切；C :轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄果實(shí)單果重量統(tǒng)計(jì)。CK :野生型番茄； 0D4-6 :超量表達(dá)GhCYP90Bl轉(zhuǎn)基因番茄6號(hào)株系。
[0038] 圖8 :轉(zhuǎn)基因番爺和野生型番爺果實(shí)品質(zhì)檢測(cè)，其中：A :可溶性固形物的含量；B : Vc含量；C :總蛋白含量；D :可溶性總糖含量。CK :野生型番茄；0D4-1?0D4-8 :超量表達(dá) GhCYP90Bl轉(zhuǎn)基因番茄中1至8號(hào)株系。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0040] 本發(fā)明實(shí)例中的試劑藥品未做具體說(shuō)明的均為普通市售，材料方法未做具體說(shuō) 明的均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（Sambrook和Russell, 2001)。
[0041] 在本發(fā)明的下述實(shí)例中，所用的棉花實(shí)驗(yàn)材料為徐州142 (Gossypium hirsutum cv. Xuzhoul42)，所用的番爺實(shí)驗(yàn)材料為臺(tái)灣圣女（紅寶石）。
[0042] 實(shí)施例lGhCYP90Bl基因序列的克隆
[0043] 1、棉花RNA的提取
[0044] 選取約3g新鮮棉花材料，在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末，裝入50mL離心管，加入 15ml 65°C預(yù)熱的 RNA提取液（2% CTAB (W/V)，2% PVP (W/V)，lOOmmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)， 0.5g/L Spermidine，2.0mol/L NaCl，2%巰基乙醇（V/V，使用前加入）），顛倒混勻。65°C水 浴3?lOmin，期間混勻2?3次。氯仿：異戊醇（24:1)抽提2次（10, 000r/min，室溫， 5min)。取上清，加入1/4體積lOmol/L LiCl溶液，4°C放置6h，以氯仿：異戊醇（25:24:1) 各抽提1次（10, 〇〇〇r/min，室溫，5min)。加2倍體積的無(wú)水乙醇，在-70°C冰箱沉淀30min以 上。12, 000r/min，4°C離心20min，棄上清。沉淀用200 μ L的DEPC處理水溶解。酚（pH4. 5): 氯仿：異戊醇（25:24:1)、氯仿：異戊醇（24:1)各抽提1次（10, 000r/min，室溫，5min)。 加1/10體積3mol/L NaAc溶液和2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，在-70°C冰箱沉淀30min以上。 12, OOOrAiind1O離心20min，棄上清。沉淀用70 %的酒精漂洗一次，風(fēng)干。加200μ L的 DEPC處理水溶解。用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量。
[0045] 2、cDNA合成和GhCYP90B 1基因 cDNA序列的PCR擴(kuò)增
[0046] 利用擬南芥DWF4基因 cDNA序列，在NCBI中查找棉花中同源性高的EST序列，根 據(jù)EST序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行染色體爬行獲得GhCYP90Bl的cDNA5'和3'端序列，設(shè)計(jì)5'端引 物 GhCYP90Bl-l(SEQ ID N0.5) :TTTAAGTAGCTGCCGCAAGTG 和 3' 引物 GhCYP90Bl-2(SEQ ID NO. 6) :CTGCCTGCTGAGATGTCTGTT。提取棉花 IOdpa 的纖維總 RNA，用試劑盒（Fermentas)合 成cDNA -鏈后，利用PCR的方法獲得GhCYP90Bl的cDNA全長(zhǎng)序列（SEQ ID NO. 1)。具體方 法如下：
[0047] (DcDNA -鏈合成
[0048] 取約 10 μ g 總 RNA 到 DEPC-處理的擴(kuò)增管中，加入 1 μ L 2. 5 μ mol/L 01ig〇-dT， 加 DEPC處理的水至終體積12μ L，70°C水浴5min使RNA變性后，立即冰浴3min。然后 向擴(kuò)增管中依次加入 4 μ L 5Xreaction buffer，2 μ L 10mmol/L dNTPs，1 μ L RNase inhibitor(20U)，37°C 處理 5min。加入 IyLAMV Rtase(5U)后，保溫程序?yàn)?42°C，60min; 70°C，5min ;5°C，5min。程序結(jié)束后，一鏈產(chǎn)物于-20°C凍存。
[0049] (2)擴(kuò)增
[0050] 25 μ L 的 cDNA 擴(kuò)增體系含 2. 5 μ L 10 X Ex PCR buffer (Mg2+free)，2 μ L2. 5mmol/ LdNTPs，2μL25mmol/LMgCl2，lμL特異引物GhCYP90Bl-l(SEQIDN0·5)(5μmol/L)， IyL GhCYP90Bl-2(SEQ ID N0.6)(5ymol/L)，0.2yL Ex Taq DNA聚合酶，IyL cDNA-鏈 產(chǎn)物。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C，5min ;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，l. 5min，30 個(gè)循環(huán)；72°C延 伸 10min。
[0051] 3、cDNA片段回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a
[0052] (1)電泳
[0053] 將cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物在I. 0% (W/V)瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離。
[0054] ⑵回收
[0055] 使用回收試劑盒：回收步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，回收片段在瓊脂糖凝膠上電 泳定量。
[0056] (3)克隆和測(cè)序
[0057] 回收的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳定量。按試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)回收片段與克隆載體 的連接、連接產(chǎn)物的大腸桿菌轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性菌落的培養(yǎng)和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，將回收片段克隆到 pUCm-T (上海Sangon)載體上。序列測(cè)定由英駿公司完成。
[0058] 回收的片段與pUCm-T (上海生工）載體建立如下連接體系：
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種棉花類固醇C22 a -羥化酶基因GhCYP90Bl在改良番茄品質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在 于：通過(guò)制備高表達(dá)GhCYP90Bl基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株實(shí)現(xiàn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花類固醇C22 a -羥化酶基因GhCYP90Bl在改良番茄品質(zhì) 中的應(yīng)用，其特征在于：所述的高表達(dá)GhCYP90Bl基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株的具體制備步驟 如下： 1) 提取棉花的cDNA或棉花DNA為模板，運(yùn)用引物GhCYP90Bl-l和GhCYP90Bl-2,擴(kuò) 增獲得GhCYP90Bl基因；所述的引物GhCYP90Bl-l序列如SEQ ID NO. 5所示，所述的引物 GhCYP90Bl-2 的序列如 SEQ ID NO. 6 所示； 2) 將GhCYP90Bl基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，獲得GhCYP90Bl基因植物表達(dá)載體； 3) 將GhCYP90Bl基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404,獲得含GhCYP90Bl 基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株；然后通過(guò)葉片感染的方法導(dǎo)入番茄中，獲得高表達(dá) GhCYP90Bl基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的棉花類固醇C22 a -羥化酶基因GhCYP90Bl在改良番茄品質(zhì) 中的應(yīng)用，其特征在于：步驟1)中所述的GhCYP90Bl基因?yàn)榫哂邢率龊塑账嵝蛄兄唬?(1) 如SEQ ID NO. 1所示的cDNA序列； (2) 如 SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3 所示的 gDNA 序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的棉花類固醇C22 a -羥化酶基因GhCYP90Bl在改良番茄品質(zhì) 中的應(yīng)用，其特征在于：步驟2)中所述的植物表達(dá)載體中包含的啟動(dòng)子為增強(qiáng)型、組成型、 組織特異型和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的棉花類固醇C22 a -羥化酶基因GhCYP90Bl在改良番茄品質(zhì) 中的應(yīng)用，其特征在于：步驟3)中所述的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入方法為電激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK104404060SQ201410676426
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】羅明, 李芳 , 葉樹(shù)娥, 李先碧, 裴炎 申請(qǐng)人:西南大學(xué)