生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C組成。用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因，由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3組成。將上述成套基因?qū)虢獾矸垩挎邨U菌SQR9構(gòu)建的重組解淀粉芽孢桿菌菌株SQR9-E、將上述成套基因?qū)肟莶菅挎邨U菌168構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌菌株168-E的吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量均高于受體菌株。本發(fā)明可以有效提高重組菌株中吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量。
【專利說明】生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 卩引哚-3-乙酸（Indole-3-aceticacid,簡稱IAA)是一類含有一個不飽和芳香族 環(huán)和一個乙酸側(cè)鏈的內(nèi)源激素，屬吲哚類化合物，又名茁長素、生長素、異生長素?，F(xiàn)已證 實，吲哚-3-乙酸存在于細菌、真菌、藻類和許多高等植物中。在高等植物中，它主要存在 于生長旺盛的部位，如胚芽鞘、根尖、受精后的子房和幼嫩的種子等。雖然在植物體內(nèi)含量 甚微，但參與了許多生理生化過程的調(diào)節(jié)與控制，具有十分廣泛的生理作用。從細胞水平 看，它可以影響細胞的伸長、分裂和分化；從器官水平看，它可以影響營養(yǎng)器官和生殖器官 的生長、成熟和衰老。吲哚-3-乙酸的基本作用在于調(diào)節(jié)植物的生長，不僅能促進生長，而 且具有抑制生長和器官建成的作用。吲哚-3-乙酸在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的用途，它能 促進植物生根，提高農(nóng)作物產(chǎn)量；用于木本和草本植物的扦插（插枝）生根，以加速根的形 成和提高植株生根的百分率。
[0003] 微生物具有體積小、結(jié)構(gòu)簡單、生長繁殖快、代謝旺盛等特征，如能得到高效合成 口引哚-3-乙酸的微生物，將為吲哚-3-乙酸的生產(chǎn)提供新的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何利用微生物合成吲哚-3-乙酸。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白 質(zhì)（用于生物合成吲哚-3-乙酸的蛋白組合物）。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)（用于生物合成吲 哚-3-乙酸的蛋白組合物），由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白 B和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C組成；
[0007] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A為下述A1)或A2)的蛋白質(zhì)：
[0008] A1)氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示的蛋白質(zhì)；
[0009]A2)在A1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個 氨基酸殘基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白質(zhì)；
[0010] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B為下述B1)或B2)的蛋白質(zhì)：
[0011] B1)氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示的蛋白質(zhì)；
[0012] B2)在B1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個 氨基酸殘基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白質(zhì)；
[0013] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C為下述C1)或C2)的蛋白質(zhì)：
[0014]C1)氨基酸序列如SEQIDNo. 5所示的蛋白質(zhì)；
[0015]C2)在C1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個 氨基酸殘基得到的具有相同功能的由C1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0016] 上述成套蛋白質(zhì)中，所述成套蛋白質(zhì)中各種蛋白質(zhì)分別獨立包裝。
[0017] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因 (用于生物合成吲哚-3-乙酸的基因組合物）。
[0018]本發(fā)明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因，所述成套基因由吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 組成；
[0019]所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A;
[0020]所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B;
[0021] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C。
[0022] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1為如下All)或A12)或A13)所示的核酸分子：
[0023]All)其編碼序列是SEQIDNo. 1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分 子；
[0024]A12)與All)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0025]A13)在嚴(yán)格條件下與All)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0026] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2為如下B11)或B12)或B13)所示的核酸分子：
[0027]B11)其編碼序列是SEQIDNo. 1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子；
[0028]B12)與B11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0029]B13)在嚴(yán)格條件下與B11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0030] 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3為如下C11)或C12)或C13)所示的核酸分子：
[0031]C11)其編碼序列是SEQIDNo. 1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA 分子；
[0032]C12)與C11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0033]C13)在嚴(yán)格條件下與C11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0034] 上述成套基因中，所述成套基因中各基因獨立包裝。
[0035] 上述成套基因中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向 進化和點突變的方法，對本發(fā)明的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1或吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 基因2或吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，與 本發(fā)明分離得到的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且 編碼所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A，或與吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2的核苷酸序列 具有75%或者更高同一性且編碼所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B，或與吲哚-3-乙酸 合成相關(guān)基因3的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且編碼所述的吲哚-3-乙酸合成相 關(guān)蛋白C，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0036] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的SEQIDNo. 1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或 85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列；與本發(fā)明的SEQIDNo. 1 的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75 %或更高，或85 %或更高，或 90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列；與本發(fā)明的SEQIDNo. 1的第2587-4074 位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或 95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機 軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之 間的同一'I"生。
[0037] 上述成套基因中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每 次 15min〇
[0038] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0039] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因 相關(guān)的遺傳材料。
[0040] 本發(fā)明所提供的與用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套基因相關(guān)的遺傳材料，為 下述1)至8)中的任一種；所述成套基因由所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3組成；
[0041] 1)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的表達盒；
[0042] 2)用于生物合成吲哚-3-乙酸的表達盒組合物，為21)或22):
[0043] 21)由21a)、21b)和21c)組成的表達盒組合物：
[0044] 21a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 2和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的表達盒；
[0045] 21b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的表達盒；
[0046] 21c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2的表達盒；
[0047] 22)由22a)、22b)和22c)組成的表達盒組合物：
[0048] 22a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的表達盒；
[0049] 22b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2的表達盒；
[0050] 22c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1的表達盒；
[0051] 3)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的重組載體；
[0052] 4)用于生物合成吲哚-3-乙酸的重組載體組合物，為41)或42):
[0053] 41)由41a)、41b)和41c)組成的重組載體組合物：
[0054] 41a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 2和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的重組載體；
[0055] 41b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的重組載體；
[0056] 41c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2的重組載體；
[0057] 42)由42a)、42b)和42c)組成的重組載體組合物：
[0058] 42a)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的重組載體；
[0059] 42b)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2的重組載體；
[0060] 42c)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 不含所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1的重組載體；
[0061] 5)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的重組微生物；
[0062] 6)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0063] 7)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0064] 8)含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0065] 上述與所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)的成套基因相關(guān)的遺傳材料中，所述表達盒是 指能夠在宿主細胞中表達相應(yīng)蛋白質(zhì)的DNA，該DNA不但可包括啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的啟動 子，還可包括終止相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的終止子，如1)所述含有所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的表達盒是指能 夠在宿主細胞中表達所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B 和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C的DNA，該DNA的啟動子可為P43啟動子。進一步，所 述表達盒還可包括增強子序列。
[0066] 可用現(xiàn)有的載體構(gòu)建含有上述表達盒的重組載體。上述與所述吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)的成套基因的相關(guān)遺傳材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上 述與所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)的成套基因的相關(guān)遺傳材料中，3)所述重組載體可含有 SEQIDNo. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA;進一步3)所述重組載體具體可為 PUBC19-P43-E;所述pUBC19-P43-E為將pUBC19-P43載體的Kpnl和PstI識別位點間的序 列替換為SEQIDNo. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列，保持其它 序列不變，得到表達SEQIDNo. 3所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、SEQIDNo. 4所示 的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和SEQIDNo. 5所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三 種蛋白質(zhì)的重組載體。
[0067] 上述與所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)的成套基因的相關(guān)遺傳材料中，5)所述的微 生物可為細菌、酵母、藻或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述 革蘭氏陽性細菌可為芽孢桿菌屬細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為埃希氏菌屬細菌。進一 步所述芽孢桿菌屬細菌為解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。所述埃希氏菌屬細菌可為 大腸桿菌（Escherichiacoli)。所述解淀粉芽孢桿菌可為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis) 168 和所述大腸桿菌 (Escherichiacoli)可為大腸桿菌（Escherichiacoli)BL21〇
[0068]上述與所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)的成套基因的相關(guān)遺傳材料中，所述遺傳材料 不包括繁殖材料。
[0069] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA。
[0070] 本發(fā)明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因 1、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3連接而成；所述用于生物 合成吲哚-3-乙酸的DNA編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相 關(guān)蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。
[0071] 所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA為如下D1)或D2)或D3)所示的核酸分 子：
[0072]D1)其核苷酸序列是SEQIDNo. 1的DNA分子或cDNA分子
[0073]D2)與D1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述的吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0074]D3)在嚴(yán)格條件下與D1)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述的吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)蛋白A、所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C 這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0075] 上述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采 用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的用于生物合成吲哚-3-乙酸的 DNA的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，與本發(fā)明分離得到的用于生物合成吲 哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列具有75%或者更高同一性且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相 關(guān)蛋白A、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋 白質(zhì)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0076] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的SEQIDNo. 1具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一 性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多 個序列之間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0077] 上文中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2 次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1 %SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次15min。
[0078] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0079] 本發(fā)明所提供的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相關(guān)的遺傳材料，為E1)_E6) 中任一種：
[0080]E1)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的表達盒；
[0081]E2)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的重組載體、或含有E1)所述表達 盒的重組載體；
[0082]E3)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的重組微生物、或含有El)所述表 達盒的重組微生物、或含有E2)所述重組載體的重組微生物；
[0083]E4)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的轉(zhuǎn)基因植物細胞系、或含有E1) 所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系、或含有E2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0084]E5)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有E1)所 述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有E2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0085]E6)含有所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有E1)所 述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有E2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0086] 所述用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相關(guān)的遺傳材料中，E1)所述用于生物合 成吲哚-3-乙酸的DNA的表達盒是指能夠在宿主細胞中表達所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋 白A和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋 白質(zhì)的DNA，該DNA不但可包括啟動所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸 合成相關(guān)基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止所述吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和所述吲哚-3-乙酸合成相 關(guān)基因3轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。具體的，所述啟動子可 為P43啟動子。
[0087] 可用現(xiàn)有的載體構(gòu)建含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA表達盒的重組載體。 上述與用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相關(guān)遺傳材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌 體或病毒載體。所述重組載體的構(gòu)建方法具體可為將PUBC19-P43載體的Kpnl和PstI識 別位點間的序列替換為SEQIDNo. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序 列，保持其它序列不變，得到表達SEQIDNo. 3所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、SEQID No.4所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和SEQIDNo.5所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋 白C這三種蛋白質(zhì)的重組載體。
[0088] 上述與用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相關(guān)遺傳材料中，E3)所述的微生物 可為細菌、酵母、藻或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述革 蘭氏陽性細菌可為芽孢桿菌屬細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為埃希氏菌屬細菌。進一 步所述芽孢桿菌屬細菌為解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。所述埃希氏菌屬細菌可為 大腸桿菌（Escherichiacoli)。所述解淀粉芽孢桿菌可為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis) 168 和所述大腸桿菌 (Escherichiacoli)可為大腸桿菌（Escherichiacoli)BL21〇
[0089] 上述與用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA相關(guān)遺傳材料中，所述遺傳材料不包括 繁殖材料。
[0090] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述I-V中任一種應(yīng)用：
[0091] I、所述的成套蛋白質(zhì)在生物合成吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用；
[0092] II、所述的成套基因在生物合成吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用；
[0093]III、所述的成套基因的相關(guān)遺傳材料在生物合成吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用；
[0094]IV、所述的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA在生物合成吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用；
[0095]V、所述的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的相關(guān)遺傳材料在生物合成吲 哚-3-乙酸中的應(yīng)用。
[0096] 上文中，序列表中SEQIDNo. 1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子（吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)基因1)編碼氨基酸序列為序列表中SEQIDNo. 3的蛋白質(zhì)（吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白A);序列表中SEQIDNo. 1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子（吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)基因2)編碼氨基酸序列為序列表中SEQIDNo. 4的蛋白質(zhì)（吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白B);序列表中SEQIDNo. 1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子（吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)基因3)編碼氨基酸序列為序列表中SEQIDNo. 5的蛋白質(zhì)（吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)蛋白C);序列表中SEQIDNo. 1所示的DNA分子（由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3連接而成）編碼氨基酸序列 為序列表中SEQIDNo. 3的蛋白質(zhì)（吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A)、序列表中SEQIDNo. 4 的蛋白質(zhì)（吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B)和序列表中SEQIDNo. 5的蛋白質(zhì)（吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白C)這三種蛋白質(zhì)。
[0097] 實驗證明，將本申請的成套基因?qū)虢獾矸垩挎邨U菌SQR9構(gòu)建的重組解淀粉芽 孢桿菌菌株SQR9-E、將本申請的成套基因?qū)肟莶菅挎邨U菌168構(gòu)建的重組枯草芽孢桿 菌菌株168-E均能夠表達出吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B 和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量是其 受體菌株SQR9菌株的4. 2倍，是空載體對照菌株SQR9-CK菌株的4倍（SQR9-E菌株的吲 哚-3-乙酸產(chǎn)量為42±2. 41mg/L發(fā)酵液，SQR9菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為9. 8± 1. 31mg/ L發(fā)酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為10. 5± 1. 08mg/L發(fā)酵液）；168-E菌株的吲 哚-3-乙酸的產(chǎn)量是其受體菌株168菌株的10倍，是空載體對照菌株168-CK菌株的10倍 (168-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為22 ± 2. 32mg/L發(fā)酵液，168菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為 2. 2±0. 30mg/L發(fā)酵液，168-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為2. 2±0. 26mg/L發(fā)酵液）。本發(fā) 明的用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)及其相關(guān)生物材料可以有效提高重組菌株 中吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0098] 圖1為重組載體pUBC19-P43-E示意圖。
[0099]圖2為重組菌株蛋白差異分析的變性聚丙烯酰胺凝膠。泳道1和泳道8為蛋白分 子量標(biāo)準(zhǔn)15-170KDa的Ladder，泳道2為168-CK菌株蛋白條帶，泳道3為168-E菌株蛋白 條帶，泳道4為BL21-CK菌株蛋白條帶，泳道5為BL21-E菌株蛋白條帶，泳道6為SQR9-CK 菌株蛋白條帶，泳道7為SQR9-E菌株蛋白條帶。

【具體實施方式】
[0100] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0101] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0102] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0103]下述實施例中的解淀粉芽抱桿菌SQR9(BacillusamyloliquefaciensSQR9)(Xu Z，ShaoJ，LiB，YanX，ShenQ，ZhangR. 2013.ContributionofBacillomycinDin BacillusamyloliquefaciensSQR9toAntifungalActivityandBiofilmFormation. Appl.Environ.Microbiol. 79:808 - 815.)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃 研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。解淀粉 芽抱桿菌SQR9(BacillusamyloliquefaciensSQR9)在下文中簡稱SQR9。
[0104] 下述實施例中的枯草芽抱桿菌168(Bacillussubtilis168)(Kunst F,OgasawaraN,MoszerI,etal.1997.Thecompletegenomesequenceofthe Gram-positivebacteriumBacillussubtilis.Nature390:249 - 256.)公眾可從中國農(nóng) 業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用， 不可作為其它用途使用?？莶菅挎邨U菌168(Bacillussubtilis168)在下文中簡稱168。
[0105]下述實施例中的pUBC19(ZhangX-Z，CuiZ-L,HongQ,LiS-P. 2005.High-Level ExpressionandSecretionofMethylParathionHydrolaseinBacillussubtilis WB800.Appl.Environ.Microbiol. 71:4101 - 4103.)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與 農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使 用。
[0106] 實施例1、生物合成吲哚-3-乙酸
[0107] -、高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組菌體細胞的制備
[0108] 高產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組菌體細胞的構(gòu)建方法，包括向受體細胞中導(dǎo)入用于生物 合成吲哚-3-乙酸的DNA，得到產(chǎn)吲哚-3-乙酸的重組菌體細胞的步驟。其中，用于生物合 成吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3連接而成；用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列 為序列表中SEQIDNo. 1。具體方法如下：
[0109] 將PUBC19載體的BamHI和PstI識別位點間的序列替換為SEQIDNo. 2所示的 P43啟動子的核苷酸序列保持其它序列不變，得到重組載體pUBC19-P43。
[0110] 將重組載體PUBC19-P43的Kpnl和PstI識別位點間的序列替換為SEQIDNo. 1 所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列，保持其它序列不變，得到重組載體 PUBC19-P43-E(圖1)。pUBC19-P43-E可表達SEQIDNo. 3所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋 白A、SEQIDNo. 4所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和SEQIDNo. 5所示的吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。SEQIDNo. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA 編碼SEQIDNo. 3所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、SEQIDNo. 4所示的吲哚-3-乙酸 合成相關(guān)蛋白B和SEQIDNo. 5所示的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。SEQ IDNo. 1中，第1-1164位為吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A的編碼序列，第1165-2586位為 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B的編碼序列，第2587-4074位為吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白 C的編碼序列。
[0111] 采用化學(xué)方法將PUBC19-P43-E導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌SQR9菌株中，得到含有SEQ IDNo. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名 為重組解淀粉芽孢桿菌SQR9-E(下文中簡稱SQR9-E菌株）；將pUBC19-P43-E導(dǎo)入枯草芽 孢桿菌168菌株中，得到含有SEQIDNo. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核 苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組枯草芽孢桿菌168-E(下文中簡稱168-E菌株）； 將PUBC19-P43-E導(dǎo)入大腸桿菌BL21菌株中，得到含有SEQIDNo. 1所示的用于生物合成吲 哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組大腸桿菌BL21-E(下文 中簡稱BL21-E菌株）；將pUBC19-P43導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌SQR9菌株中，得到不含有SEQID No. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為 重組解淀粉芽孢桿菌SQR9-CK(下文中簡稱SQR9-CK菌株），該菌株是SQR9-E的空載體對照 菌株；將PUBC19-P43導(dǎo)入枯草芽孢桿菌168菌株中，得到不含有SEQIDNo. 1所示的用于生 物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組枯草芽孢桿菌 168-CK(下文中簡稱168-CK菌株），該菌株是168-E的空載體對照菌株；將pUBC19-P43導(dǎo)入 大腸桿菌BL21菌株中，得到不含有SEQIDNo. 1所示的用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA 的核苷酸序列的重組菌株，將該菌株命名為重組大腸桿菌BL21-CK(下文中簡稱BL21-CK菌 株），該菌株是BL21-CK的空載體對照菌株。
[0112] 二、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)的提取及分析
[0113] 1、不同處理的菌體細胞收集
[0114]將步驟一的BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株分別接種于含 有3mL液體LB培養(yǎng)基的試管（卡那霉素的濃度為20yg/mL)中，過夜培養(yǎng)作為種子液，分 別得到BL21-CK、BL21-E、168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株的種子液。將上述種子液 分別以1 %體積比的接種量接種于l〇〇mL含3mM色氨酸的Landy培養(yǎng)基（在Landy培養(yǎng)基 中加入色氨酸，使色氨酸的含量為3mM得到的液體即為含3mM色氨酸的Landy培養(yǎng)基）中 (LandyM,WarrenGH,RosenmanMSB,ColioLG. 1948.Bacillomycin:anantibioticfrom BacillussubtilisactiveagainstpathogenicFungi.Exp.Biol.Med. 67:539-541.), 22°C，90rpm避光培養(yǎng)72小時后在4°C，8000g離心收集菌體，分別得到BL21-CK、BL21-E、 168-CK、168-E、SQR9-CK和SQR-E菌株的菌體。
[0115] 2、用于生物合成吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)的提取
[0116] 將收集到的菌體用0. 2MpH6. 8磷酸緩沖液洗滌，4°C，8000g離心10min收集菌 體，共進行上述操作三次。將收集到的菌體采用B-PER?BacteriaProteinExtraction Reagent(ThermoScientific)試劑盒提取菌體蛋白。具體流程如下：離心沉淀的菌體用lOmL B-PERReagent重懸，并且加入2iiL100mg/mL溶菌酶；其中BL21-CK和BL21-E菌體置于 室溫反應(yīng)l〇_15min，得到BL21-CK菌體裂解液和BL21-E菌體裂解液；SQR9-CK、SQR9-E、 168-CK和168-E菌株置于室溫反應(yīng)45min，得到SQR9-CK菌體裂解液、SQR9-E菌體裂解液、 168-CK菌體裂解液和168-E菌體裂解液，將各裂解液15000g離心5min，所獲上清液即為 菌株的蛋白粗提液，獲得BL21-CK蛋白粗提液、BL21-E蛋白粗提液、SQR9-CK蛋白粗提液、 SQR9-E蛋白粗提液、168-CK蛋白粗提液和168-E蛋白粗提液。將各菌株的蛋白粗提液置 于-70°C冰箱中保存。
[0117] 3、BCA法測定蛋白總量
[0118] 蛋白定量采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司），具體 流程如下：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量，將試劑A(BCA堿性溶液）和試劑B(硫酸銅溶液）以 50:1(￥八）的比例混合配制此六工作液；將0、1、2、4、6、8、101^的標(biāo)準(zhǔn)85六蛋白溶液（111^/ mL)分別加入96孔板的不同孔中，并加ddH20使得每孔的體積為10yL，每個濃度設(shè)置3個 復(fù)孔。分別取10UL稀釋的待測蛋白樣品加入96孔板的不同孔中，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。 向BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔中每孔分別加入200yL配置好的BCA工作液，充分混勻 后于37C反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后將96孔板冷卻至室溫，米用酶標(biāo)僅測定各樣品的吸光度 0D562。以BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線，計算各樣品的蛋白質(zhì)含量。
[0119] 4、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)
[0120]SDS-PAGE凝膠制備：先灌制濃度為10 %的分離膠，濃度為10 %的分離膠包含 5. 3mL30 %Acr/Bis(29:l)貯存液、4.OmL下層緩沖液、0? 8mL10 %APS、0. 008mLTEMED 和6. 7mL去離子水，分離膠灌好后置于37°C凝固30min;待分離膠凝固后灌制濃度為5% 的濃縮膠，濃度為5 %的濃縮膠包含0. 75mL30 %Acr/Bis(29:1)貯存液、1. 25mL上層緩 沖液、0. 015mL10%APS、0. 005mLTEMED和3.OmL去離子水，濃縮膠灌好后置于室溫凝結(jié) 15_20min〇
[0121] 在電泳槽內(nèi)加入新鮮配置的IX電極緩沖液。根據(jù)待測蛋白濃度取適量的待測蛋 白樣品，加入10yL樣品緩沖液混合均勻，然后去離子水補齊至30i!L，各個樣品的蛋白質(zhì) 質(zhì)量濃度均相同，將樣品進行沸水浴5min，14000rpm離心5min后上樣，每個泳道的上樣體 積均相同。首先采用80V的電壓使樣品先從濃縮膠遷移至分離膠，隨后采用100V的電壓使 得樣品跑至分離膠底部。
[0122] 凝膠的染色及脫色：電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上輕輕撥下，放入已加入適量固 定液的干凈玻璃皿內(nèi)，固定30min，固定結(jié)束后倒出固定液加入適量考馬氏亮藍R-250染色 液，震蕩染色lh,然后倒出染色液加入脫色液進行震蕩脫色，每隔lOmin更換脫色液，重復(fù) 脫色洗脫四次，之后加脫色液連續(xù)脫色4-8h，期間更換脫色液3-4次，脫色完全后進行掃描 拍照。
[0123] 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A的分子量為43KDa，吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B的 分子量為53KDa和卩引哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C的分子量為54KDa，圖2中顯不含有用于 生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株BL21-E、SQR9-E和168-E均能夠 表達出吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白C。相對于不含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株， 含有用于生物合成吲哚-3-乙酸的DNA的核苷酸序列的重組菌株BL21-E、SQR9-E和168-E 表達出的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合 成相關(guān)蛋白C的含量均明顯增多，168-E菌株蛋白條帶中在約43KDa處明顯比168-CK菌株 增強，而由于菌株在55KDa大小的蛋白很多，只能推測168-E菌株與168-CK菌株相比能更 多的表達55KDa左右的蛋白；與BL21-CK菌株相比，在菌株BL21-E蛋白條帶中能清晰分辨 出在43KDa、54KDa和53KDa大小處條帶增強；在SQR9-E菌株蛋白條帶中可清晰分辨出在 43KDa、54KDa和53KDa大小處條帶比SQR9-CK菌株蛋白條帶增強。
[0124] 三、吲哚-3-乙酸產(chǎn)量檢測
[0125] 將SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株分 別接種于含有3mL液體LB培養(yǎng)基的試管（卡那霉素的濃度為20yg/mL)中，過夜培養(yǎng)作為 種子液，分別得到SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌 株的種子液。將上述種子液分別以1%體積比的接種量接種于l〇〇mL含3mM色氨酸的Landy 培養(yǎng)基（在Landy培養(yǎng)基中加入色氨酸，使色氨酸的含量為3mM得到的液體即為含3mM色 氨酸的Landy培養(yǎng)基）中，SQR9菌株、SQR9-E菌株和SQR9-CK菌株的接種量以菌體含量計 相同，168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的接種量以菌體含量計相同。在22°C，90rpm避 光培養(yǎng)72小時，分別得到SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168-E菌株和168-CK菌株的發(fā)酵液。 實驗設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)每個菌株均接入10個裝有l(wèi)OOmL含3mM色氨酸的Landy培養(yǎng)基 的容積為500mL三角瓶在上述條件下進行發(fā)酵。
[0126] 分別將各菌株的lOOmL發(fā)酵液在4°C，8000rpm離心lOmin去除菌體細胞，收集 SQR9菌株、SQR9-E菌株、SQR9-CK菌株、168菌株、168-E菌株和168-CK菌株的上清液。將 各菌株的上清液分別倒入不同的無菌三角瓶中，用2MHC1溶液調(diào)節(jié)各菌株的上清液pH值 至2. 0,然后加入與上述三角瓶中等體積的乙酸乙酯萃取三次，萃取結(jié)束后8000rpm，4°C離 心lOmin，將各菌株的乙酸乙酯相37°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品。將各菌株的旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)后的樣品分別用lmL甲醇溶解，過0.22pm濾膜，放入-20°C冰箱保存。甲醇溶解的樣 品采用HPLC進行定量分析，HPLC的分析條件為：采用AgilentTC-C18色譜柱，柱溫25°C， 流動相為A(甲醇）和B(0. 1%乙酸）的體積比為60:40,進樣量為10iiL，流速為0.4mL/ min，紫外吸收波長為220nm。HPLC分析中，以吲哚-3-乙酸（Sigma，CASNO: 87-51-4)為標(biāo) 準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性和采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法（外標(biāo)法）進行定量分析。
[0127] 試驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS12. 0(SPSSInc.，USA)統(tǒng)計軟件的獨立樣本t檢驗處理統(tǒng) 計。
[0128] 不同菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量如表1，結(jié)果表明含有用于生物合成吲哚-3-乙酸 的DNA的核苷酸序列的重組菌株SQR9-E和168-E中吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量均高于每株相應(yīng) 的受體菌株和空載體對照菌株。SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量是SQR9菌株的4. 2倍， 是SQR9-CK菌株的4倍（SQR9-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為42±2. 41mg/L發(fā)酵液，SQR9 菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為9. 8±1. 31mg/L發(fā)酵液，SQR9-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量 為10. 5±1.08mg/L發(fā)酵液）；168-E菌株合成吲哚-3-乙酸的產(chǎn)量是168菌株的10倍， 是168-CK菌株的10倍（168-E菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為22±2. 32mg/L發(fā)酵液，168 菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為2. 2±0. 30mg/L發(fā)酵液，168-CK菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量為 2.2±0.2611^/1發(fā)酵液）。
[0129] 表1、各菌株的吲哚-3-乙酸產(chǎn)量
[0130]

【權(quán)利要求】
1. 用于制備吲哚-3-乙酸的成套蛋白質(zhì)，所述成套蛋白質(zhì)由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋 白A、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C組成； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A為下述A1)或A2)的蛋白質(zhì)： A1)氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示的蛋白質(zhì)； A2)在A1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基 酸殘基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B為下述B1)或B2)的蛋白質(zhì)： B1)氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示的蛋白質(zhì)； B2)在B1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基 酸殘基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C為下述C1)或C2)的蛋白質(zhì)： C1)氣基酸序列如SEQ ID No. 5所不的蛋白質(zhì)； C2)在C1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基 酸殘基得到的具有相同功能的由C1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 用于制備吲哚-3-乙酸的成套基因，所述成套基因由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3組成； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1編碼權(quán)利要求1所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A ; 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2編碼權(quán)利要求1所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B ; 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3編碼權(quán)利要求1所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的成套基因，其特征在于：所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1為 如下All)或A12)或A13)所示的核酸分子： All)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第1-1164位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子； A12)與All)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子； A13)在嚴(yán)格條件下與All)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白A的cDNA分子或基因組DNA分子； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2為如下B11)或B12)或B13)所示的核酸分子： B11)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第1165-2586位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分 子； B12)與B11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子； B13)在嚴(yán)格條件下與B11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白B的cDNA分子或基因組DNA分子； 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3為如下C11)或C12)或C13)所示的核酸分子： C11)其編碼序列是SEQ ID No. 1的第2587-4074位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分 子； C12)與C11)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子； C13)在嚴(yán)格條件下與C11)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān) 蛋白C的cDNA分子或基因組DNA分子。
4.用于制備吲哚-3-乙酸的成套基因的相關(guān)遺傳材料，為下述1)至8)中的任一種； 所述成套基因由權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、權(quán)利要求2或3中所 述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3組 成； 1) 含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、權(quán)利要求2或3中所述 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的表 達盒； 2) 用于制備吲哚-3-乙酸的表達盒組合物，為21)或22): 21) 由21a)、21b)和21c)組成的表達盒組合物： 21a)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1不含權(quán)利要求2或3中 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 的表達盒； 21b)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2不含權(quán)利要求2或3中 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 的表達盒； 21c)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含權(quán)利要求2或3中 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 的表達盒； 22) 由22a)、22b)和22c)組成的表達盒組合物： 22a)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所 述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2不含權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 的表達盒； 22b)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所 述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 的表達盒； 22c)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所 述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1 的表達盒； 3) 含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、權(quán)利要求2或3中所述 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的重 組表達載體； 4) 用于制備吲哚-3-乙酸的重組載體組合物，為41)或42): 41)由41a)、41b)和41c)組成的重組載體組合物： 41a)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1不含權(quán)利要求2或3中 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 的重組載體； 41b)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2不含權(quán)利要求2或3中 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 的重組載體； 41c)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含權(quán)利要求2或3中 所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 的重組載體； 42)由42a)、42b)和42c)組成的重組載體組合物： 42a)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所 述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2不含權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3 的重組載體； 42b)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1和權(quán)利要求2或3中所 述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2 的重組載體； 42c)含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所 述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3不含權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1 的重組載體； 5) 含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、權(quán)利要求2或3中所述 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的重 組微生物； 6) 含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、權(quán)利要求2或3中所述 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的轉(zhuǎn) 基因植物細胞系； 7) 含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、權(quán)利要求2或3中所述 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的轉(zhuǎn) 基因植物組織； 8) 含有權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、權(quán)利要求2或3中所述 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因2和權(quán)利要求2或3中所述吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3的轉(zhuǎn) 基因植物器官。
5. 用于制備吲哚-3-乙酸的DNA，由吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因1、吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)基因2和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因3連接而成；所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA 編碼權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成 相關(guān)蛋白B和權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于制備吲哚-3-乙酸的DNA，其特征在于：所述用于制備吲 哚-3-乙酸的DNA為如下D1)或D2)或D3)所示的核酸分子： D1)其核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子或cDNA分子； D2)與D1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述的 吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白A、權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和權(quán)利要求 1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子； D3)在嚴(yán)格條件下與D1)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙 酸合成相關(guān)蛋白A、權(quán)利要求1所述的吲哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白B和權(quán)利要求1所述的吲 哚-3-乙酸合成相關(guān)蛋白C這三種蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
7. 權(quán)利要求5或6所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的相關(guān)遺傳材料，為El)-E6)中 任一種： E1)含有權(quán)利要求5或6所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的表達盒； E2)含有權(quán)利要求5或6所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的重組載體、或含有E1)所 述表達盒的重組載體； E3)含有權(quán)利要求5或6所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的重組微生物、或含有E1) 所述表達盒的重組微生物、或含有E2)所述重組載體的重組微生物； E4)含有權(quán)利要求5或6所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的轉(zhuǎn)基因植物細胞系、或含 有E1)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系、或含有E2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； E5)含有權(quán)利要求5或6所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有 E1)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有E2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； E6)含有權(quán)利要求5或6所述用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有 E1)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有E2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
8. 下述I - V中任一種應(yīng)用： I、 權(quán)利要求1所述的成套蛋白質(zhì)在制備吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用； II、 權(quán)利要求2或3所述的成套基因在制備吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用； III、 權(quán)利要求4所述的成套基因的相關(guān)遺傳材料在制備吲哚-3-乙酸中的應(yīng)用； IV、 權(quán)利要求5或6所述的用于制備吲哚-3-乙酸的DNA在制備吲哚-3-乙酸中的應(yīng) 用； V、 權(quán)利要求7所述的用于制備吲哚-3-乙酸的DNA的相關(guān)遺傳材料在制備吲哚-3-乙 酸中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104387456SQ201410677417
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】張瑞福, 邵佳慧, 張楠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所