使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用。本發(fā)明涉及通過在穩(wěn)定輔酶的存在下貯藏酶用于使酶穩(wěn)定的方法。此外，本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶及其在用于檢測(cè)分析物的測(cè)試元件中的用途。
【專利說明】使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用
[0001] 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2009年2月19日的國際申請(qǐng)PCT/EP2009/001206進(jìn)入中 國、申請(qǐng)?zhí)枮?00980105640. 6的題為"使用穩(wěn)定輔酶的脫氫酶穩(wěn)定作用"的發(fā)明專利申請(qǐng) 的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及通過在穩(wěn)定輔酶的存在下貯藏酶使酶穩(wěn)定的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及 用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶，及其在用于檢測(cè)分析物的測(cè)試元件中的用途。

【背景技術(shù)】
[0003] 生物化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)是臨床相關(guān)的分析方法的重要組成成分。本文優(yōu)先考慮的事是 測(cè)量分析物例如代謝物或底物，其借助于酶直接或間接進(jìn)行測(cè)定。分析物在這種情況下借 助于酶_輔酶復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)變，并且隨后進(jìn)行定量。這需要待測(cè)定的分析物與合適的酶和 輔酶接觸，其中酶通常以催化量使用。輔酶通過酶促反應(yīng)得到改變，例如被氧化或還原。這 個(gè)過程可以直接，或通過介質(zhì)電化學(xué)或光度測(cè)定地進(jìn)行檢測(cè)。校準(zhǔn)提供量度和待測(cè)定的分 析物濃度之間的正相關(guān)關(guān)系。
[0004] 輔酶是與酶共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，并且通過分析物的轉(zhuǎn)變而改變的有機(jī)分子。輔酶 的突出例子分別是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，由 其通過還原分別產(chǎn)生NADH和NADPH。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中已知的測(cè)量系統(tǒng)因?qū)τ谟邢迺r(shí)間段穩(wěn)定，以及為了達(dá)到這種穩(wěn)定性對(duì) 環(huán)境的特定需求例如冷卻貯藏或干燥貯藏而著稱。對(duì)于具體應(yīng)用，例如由最終用戶自身執(zhí) 行的測(cè)試，例如在血糖的自我監(jiān)控中，通過不正確、不引人注意的錯(cuò)誤貯藏發(fā)生不正確的結(jié) 果因此是可能的。通過主要包裝打開太長時(shí)間的干燥劑耗盡特別可能導(dǎo)致錯(cuò)誤測(cè)量，這對(duì) 于一些系統(tǒng)幾乎不會(huì)被用戶鑒別出。
[0006] 用于增加生物化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)的穩(wěn)定性的一種已知措施是使用穩(wěn)定的酶，例如使用 來自嗜熱生物的酶。進(jìn)一步的可能性是通過化學(xué)修飾例如交聯(lián)或通過誘變使酶穩(wěn)定。此 夕卜，還可以添加酶穩(wěn)定劑例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白，或可以在聚合物網(wǎng)絡(luò) 中例如通過光聚合而封入酶。
[0007] 還已進(jìn)行通過使用穩(wěn)定的介質(zhì)來改善生物化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)的穩(wěn)定性的嘗試。因此， 通過使用具有盡可能低的氧化還原電位的介質(zhì)，測(cè)試的特異性增加，并且在反應(yīng)過程中的 干擾被消除。然而，酶/輔酶復(fù)合物的氧化還原電位形成對(duì)于介質(zhì)的氧化還原電位的下限。 低于這些電位，與介質(zhì)的反應(yīng)減慢或甚至停止。
[0008] 可替代可能性也是使用不含介質(zhì)的生物化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)，其中例如存在輔酶例如輔 酶NADH的直接檢測(cè)。然而，此種測(cè)量系統(tǒng)的一個(gè)缺點(diǎn)是輔酶例如NAD和NADP是不穩(wěn)定的。
[0009] NAD和NADP是對(duì)堿不穩(wěn)定的分子，其降解途徑在文獻(xiàn)中得到描述 (N. J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes,Academic Press New York, London 1982,編輯 J. Everese，B. Anderson，K. You，第 3 章，第 56-65 頁）。NAD 和 NADP 的 降解通過切割核糖和吡啶單位之間的糖基鍵分別基本上導(dǎo)致ADP-核糖。另一方面還原型 NADH和NADPH是對(duì)酸不穩(wěn)定的：例如，表異構(gòu)化是一種已知的降解途徑。在兩種情況下， NAD/NADP和NADH/NADPH的不穩(wěn)定性都來源于核糖單位和吡啶單位之間的糖基鍵的不穩(wěn)定 性。然而，即使在不急劇的條件下，例如在水溶液中，輔酶NAD和NADP分別僅通過環(huán)境水分 而水解。這種不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致分析物測(cè)量中的不精確。
[0010] 許多 NAD/NADP 衍生物例如在 B. M. Anderson in The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982,編輯 J. Everese，B. Anderson，K. You， 第4章中得到描述。然而，這些衍生物中的大多數(shù)不由酶良好接受。迄今為止因此已用于 診斷測(cè)試的唯一衍生物是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（乙酰NAD)，其在1956年首次得到 描述（N. 0. Kaplan，J. Biol.Chem. (1956)，221，823)。這種輔酶也顯示由酶的弱接受和氧化 還原電位中的改變。
[0011] W0 01/94370描述了具有經(jīng)修飾的吡啶基團(tuán)的進(jìn)一步NAD衍生物的使用。然而，煙 酰胺基團(tuán)的修飾一般而言對(duì)催化反應(yīng)具有直接影響。在大多數(shù)情況下，這種影響是負(fù)面的。
[0012] 在關(guān)于穩(wěn)定作用的進(jìn)一步想法中，核糖單位已進(jìn)行改變，以從而影響糖基鍵的穩(wěn) 定性。這個(gè)程序不直接干擾煙酰胺基團(tuán)的催化反應(yīng)。然而，一旦酶顯示出與核糖單位的 強(qiáng)烈和特異性結(jié)合，就可能存在間接影響。Kaufmann等人在這方面在W0 98/33936和US 5,801，006以及冊(cè)01/49247中分別公開了許多硫代核糖（也1〇1^13〇86)-隱0衍生物。然 而，迄今為止仍未顯示出煙酰胺-核糖單位的修飾和衍生物在酶促反應(yīng)中的活性之間的聯(lián) 系。
[0013] 不含糖基鍵的衍生物CarbaNAD在1988年首次得到描述（J. T. Slama， Biochemistry 1989, 27，183 和 Biochemistry 1989, 28, 7688)。其中的核糖由碳環(huán)糖單位 替換。盡管carbaNAD描述為脫氫酶的底物，但它的活性迄今為止仍未在臨床上在生物化學(xué) 檢測(cè)方法中得到證實(shí)。
[0014] 類似方法隨后由G. M. Blackburn，Chem. Comm.，1996, 2765進(jìn)行描述，以用亞甲 基雙膦酸鹽化合物代替天然的焦磷酸鹽制備carbaNAD。亞甲基雙膦酸鹽顯示對(duì)于磷酸 酶增加的穩(wěn)定性并且用作ADP-核糖基環(huán)化酶的抑制劑。水解穩(wěn)定性中的增加不是目的 (J. T. Slama，G. M. Blackburn) 〇
[0015] WO 2007/012494 和 US 11/460, 366 分別公開了穩(wěn)定的 NAD/NADH和 NADP/NADPH衍 生物，這些衍生物的酶復(fù)合物及其在生物化學(xué)檢測(cè)方法和試劑盒中的用途。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明所基于的目的是提供用于使酶穩(wěn)定，特別是用于酶的長期穩(wěn)定作用的方 法。
[0017] 這個(gè)目的通過用于使酶穩(wěn)定的方法來達(dá)到，其中酶在穩(wěn)定輔酶的存在下進(jìn)行貯 藏。已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)借助于穩(wěn)定輔酶，在高相對(duì)濕度或甚至在液相中和在升高的溫度下 幾周或幾月的長期穩(wěn)定作用是可能的。這個(gè)認(rèn)識(shí)是令人驚訝的，因?yàn)橐阎M管在天然輔 酶的存在下酶具有數(shù)小時(shí)的增加的短期穩(wěn)定性（Bertoldi等人，Biochem. J. 389,（2005)， 885-898 ;van den Heuvel 等人，（J.Biol. Chem. 280(2005)，32115-32121;和 Pan 等人， (J. Chin. Biochem. Soc.第3卷（1974)，第1-8頁），但它們顯示在較長時(shí)間段期間的較低穩(wěn) 定性（Nutrition Reviews 36 (1978)，251-254)。
[0018] 與對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)來說的這些認(rèn)識(shí)相比較，令人驚訝的是，酶在穩(wěn)定輔酶的存在下 具有比酶在天然輔酶的存在下顯然增加的長期穩(wěn)定性，這尤其是因?yàn)榉€(wěn)定輔酶對(duì)于酶具有 比天然輔酶更低的結(jié)合常數(shù)。
[0019] 通過本發(fā)明的方法得到穩(wěn)定的酶是輔酶依賴性酶。合適的酶的例子是選自下述的 脫氫酶：葡糖脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 47)、乳酸脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 27、1. 1. 1. 28)、蘋果酸脫氫 酶（E.C. 1. 1. 1. 37)、甘油脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 6)、醇脫氫酶（E.C. 1. 1. 1. 1)、a -羥丁酸脫氫 酶、山梨糖醇脫氫酶或氨基酸脫氫酶，例如L-氨基酸脫氫酶（E.C. 1. 4. 1. 5)。進(jìn)一步合適的 酶是氧化酶，例如葡糖氧化酶（E.C. 1. 1. 3. 4)或膽固醇氧化酶（E.C. 1. 1. 3. 6)和氨基轉(zhuǎn)移 酶，分別地，例如天冬氨酸或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5'-核苷酸酶或肌酸激酶。酶優(yōu)選是葡糖 脫氫酶。
[0020] 已證明在本發(fā)明方法的背景中采用突變的葡糖脫氫酶是特別優(yōu)選的。如在本申請(qǐng) 的背景中使用的，術(shù)語"突變體"指天然酶的基因修飾變體，其盡管氨基酸數(shù)目是相同的，但 具有與野生型酶相比較經(jīng)修飾的氨基酸序列，即在至少一個(gè)氨基酸中不同于野生型酶。一 個(gè)或多個(gè)突變的引入可以位點(diǎn)特異性地發(fā)生或非位點(diǎn)特異性地發(fā)生，優(yōu)選通過使用本領(lǐng)域 已知的重組方法位點(diǎn)特異性地發(fā)生，然而，適合于具體需求和條件，發(fā)生在天然酶的氨基酸 序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸交換。與野生型酶相比較，突變體特別優(yōu)選具有增加的熱或水解 穩(wěn)定性。
[0021] 突變的葡糖脫氫酶原則上可以包括通過與相對(duì)應(yīng)的野生型葡糖脫氫酶相比較，在 其氨基酸序列中在任何位置處進(jìn)行修飾的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。突變的葡糖脫氫酶優(yōu)選包括 在野生型葡糖脫氫酶的氨基酸序列的位置96、170和252中至少一個(gè)處的突變，特別優(yōu)選具 有在位置96和位置170處的突變，以及在位置170和位置252處的突變的突變體。已證明 對(duì)于突變的葡糖脫氫酶不包括除這些突變外的進(jìn)一步突變是有利的。
[0022] 在位置96、170和252處的突變?cè)瓌t上可以包括野生型酶的任何氨基酸交換，其導(dǎo) 致穩(wěn)定作用，例如熱或水解穩(wěn)定性中的增加。在位置96處的突變優(yōu)選包括谷氨酸對(duì)于甘氨 酸的氨基酸交換，而就位置170而言，谷氨酸對(duì)于精氨酸或賴氨酸的氨基酸交換，特別地谷 氨酸對(duì)于賴氨酸的氨基酸交換是優(yōu)選的。就在位置252處的突變而言，這優(yōu)選包括賴氨酸 對(duì)于亮氨酸的氨基酸交換。
[0023] 突變的葡糖脫氫酶可以通過衍生自任何生物學(xué)來源的野生型葡糖脫氫酶的突變 而獲得，其中術(shù)語"生物學(xué)來源"在本發(fā)明的背景中包括原核生物例如細(xì)菌，和真核生物 例如哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物。野生型葡糖脫氫酶優(yōu)選衍生自細(xì)菌，特別優(yōu)選來自巨大芽孢 桿菌（Bacillusmegaterium)、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌 (Bacillusthuringiensis)特別是枯草芽孢桿菌的葡糖脫氫酶。
[0024] 在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變的葡糖脫氫酶是通過來自枯草芽孢 桿菌的野生型葡糖脫氫酶的突變獲得的葡糖脫氫酶，其具有SEQ ID NO. :l(GlucDH_E96G_ E170K)中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO. :2(GlucDH_E170K_K252L)中所示的那種。
[0025] 穩(wěn)定輔酶是通過與天然輔酶相比較已進(jìn)行化學(xué)修飾，并且具有比天然輔酶更高的 穩(wěn)定性（例如，水解穩(wěn)定性）的輔酶。穩(wěn)定輔酶優(yōu)選在測(cè)試條件下對(duì)水解是穩(wěn)定的。與天 然輔酶相比較，穩(wěn)定輔酶可以具有對(duì)于酶減少的結(jié)合常數(shù)，例如減少二分之一或更多的結(jié) 合常數(shù)。
[0026] 穩(wěn)定輔酶的優(yōu)選例子是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸磷酸（NADP/NADPH)的穩(wěn)定衍生物，或截短的NAD衍生物，例如不含AMP部分或具有非 核苷殘基，例如疏水殘基。在本發(fā)明的背景中同樣優(yōu)選作為穩(wěn)定輔酶的是式（I)的化合物
[0027]

【權(quán)利要求】
1.用于使酶穩(wěn)定的方法，其特征在于所述酶在穩(wěn)定輔酶的存在下進(jìn)行貯藏，其中所 述酶是選自下述的脫氫酶：葡糖脫氫酶（E.c.I. 1. 1.47)、乳酸脫氫酶（E.C.I. 1. 1.27、 I.I. 1. 28)、蘋果酸脫氫酶（E.C.I.I. 1. 37)、甘油脫氫酶（E.C.I.I. 1. 6)、醇脫氫酶 (E.C.I.I. 1. 1)、α-羥丁酸脫氫酶、山梨糖醇脫氫酶或氨基酸脫氫酶，例如L-氨基酸脫氫 酶（E.C. 1. 4. 1. 5)，且所述穩(wěn)定輔酶是通式（II)的化合物
其中 A=腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、8-氮雜腺嘌呤或7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤，其中所述7-脫 氣變體可以任選在位置7中由齒素、C1-C6-塊基、C1-C6-鏈稀基或C1-C6-燒基取代， T=在每種情況下是0， U=在每種情況下是0Η， V =OH或磷酸基，或形成環(huán)狀磷酸基的2個(gè)基團(tuán)； W=。0順2或COCH3， X1= 0， X2= 0， Y = 0,且 Z=通式（III)的化合物，
其中在If和R5"之間存在單鍵，其中R4 =在每種情況下獨(dú)立地是H、F、Cl、CH3， R5=CH2, R5i =CH2、CHOH或NH， R5" =C(R4)2、CHOH或CHOCH3, R6=CH或CCH3，且R6' =CH或CCH3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于將葡糖脫氫酶用作酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中RY和R5"各自是CHOH。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中RY是NH，并且R5"是CH2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述穩(wěn)定輔酶是carbaNAD。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶貯藏至少2周 的時(shí)間段。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶貯藏于至少 20 °C的溫度下。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶無需干燥試劑 進(jìn)行貯藏。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶貯藏于至少 50 %的相對(duì)濕度下。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶的貯藏作為 干物質(zhì)發(fā)生。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶的貯藏在液 相中發(fā)生。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其特征在于用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶在測(cè)試元件 上發(fā)生。
13. 用穩(wěn)定輔酶穩(wěn)定的酶，其特征在于它顯示在至少20°C的溫度下，在合適時(shí)連同至 少50%的相對(duì)濕度且無需干燥試劑，貯藏至少2周后，與最初水平相比較，所述酶促活性中 的下降小于50%，其中所述酶是突變的葡糖脫氫酶，且所述突變的葡糖脫氫酶與相應(yīng)的野 生型葡糖脫氫酶相比具有增加的熱或水解穩(wěn)定性，其中所述突變的葡糖脫氫酶包括在相應(yīng) 的野生型葡糖脫氫酶的氨基酸序列的位置96、170和252中至少一個(gè)處的突變，且其中所述 穩(wěn)定輔酶是通式（II)的化合物
其中 A=腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、8-氮雜腺嘌呤或7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤，其中所述7-脫 氣變體可以任選在位置7中由齒素、C1-C6-塊基、C1-C6-鏈稀基或C1-C6-燒基取代， T=在每種情況下是0， U=在每種情況下是0H， V=OH或磷酸基，或形成環(huán)狀磷酸基的2個(gè)基團(tuán)； W=。0順2或COCH3， X1= 0， X2= 0， Y= 0,且 Z=通式（III)的化合物，
其中在If和R5"之間存在單鍵，其中R4 =在每種情況下獨(dú)立地是H、F、Cl、CH3， R5=CH2, R5i =CH2、CHOH或NH， R5" =C(R4)2、CHOH或CHOCH3, R6=CH或CCH3，且R6' =CH或CCH3。
14. 用于測(cè)定分析物的檢測(cè)試劑，其包括根據(jù)權(quán)利要求13的穩(wěn)定的酶。
15. 測(cè)試元件，其特征在于它包括根據(jù)權(quán)利要求13的穩(wěn)定的酶或根據(jù)權(quán)利要求14的檢 測(cè)試劑。
【文檔編號(hào)】C12N9/06GK104450659SQ201410680334
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2008年2月19日
【發(fā)明者】海因德爾 D., 霍恩 C., 加斯勒迪切 C., 霍內(nèi)斯 J. 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司