測定癌癥對表皮生長因子受體靶向性治療反應性的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及測定癌癥對表皮生長因子受體靶向性治療反應性的方法。本發(fā)明涉及癌癥對表皮生長因子受體(EGFR)治療的反應性的方法。在優(yōu)選的實施方案中，在erbB1基因的激酶結(jié)構域中的至少一個變異的存在賦予對酪氨酸激酶抑制劑gefitinib的敏感性。因而，對于這些突變的診斷測定將允許向那些最有可能對藥物起反應的患者施用gefitinib、erlotinib和其它酪氨酸激酶抑制劑。
【專利說明】測定癌癥對表皮生長因子受體靶向性治療反應性的方法
[0001] 本申請是申請日為2005年3月31日，申請?zhí)枮?01210028631. 5的、發(fā)明名稱和 本發(fā)明相同的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 對相關申請的交叉參考
[0003] 本申請在35U.S.C. 119(e)之下要求遞交于2004年3月31日的美國臨時申請系列 號：60/558, 218,遞交于2004年4月9日的美國臨時申請系列號：60/561, 095,遞交于2004 年4月27日的美國臨時申請系列號：60/565, 753,遞交于2004年4月27日的美國臨時申 請系列號：60/565, 985,遞交于2004年5月25日的美國臨時申請系列號：60/574, 035,遞交 于2004年6月7日的美國臨時申請系列號：60/577,916和遞交于2004年7月29日的美 國臨時申請系列號：60/592, 287的權益，在此將其內(nèi)容全部并入作為參考。
[0004] 政府支持
[0005] 本發(fā)明由國立衛(wèi)生研宄院（NIH)獎助金號ROl CA 092824, P50CA 090578, POl 95281，和1K12CA87723-01支持，美國政府具有其某些權益。

【技術領域】 [0006] 和【背景技術】
[0007] 上皮細胞癌癥，例如，前列腺癌、乳癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脾癌、睪丸癌、 胸腺癌等，是特征為上皮細胞異常、加速生長的疾病。這種加速的生長最初引發(fā)腫瘤形成。 最后，還能夠發(fā)生向不同器官位點的轉(zhuǎn)移。盡管已經(jīng)在各種癌癥的診斷和治療上取得了一 些進展，但這些疾病仍然導致顯著的死亡率。
[0008] 肺癌是工業(yè)化國家中主要的癌癥死亡原因。根據(jù)細胞在顯微鏡下如何顯現(xiàn)，將在 肺中開始的癌癥分成兩種主要類型，非小細胞肺癌和小細胞肺癌。非小細胞肺癌（鱗狀細 胞癌，腺癌，和大細胞癌）一般比小細胞肺癌更慢地傳播到其它器官。大約75%的肺癌病例 被分類為非小細胞肺癌（例如，腺癌），而其它25%為小細胞肺癌。非小細胞肺癌（NSCLC) 是在美國、日本和西歐癌癥死亡的主要原因。對于患有進行性疾病的患者來說，化療在存活 上提供了最適度的益處，但代價是顯著的毒性，這強調(diào)了對治療劑的需要，所述治療劑特異 性靶向脂導腫瘤生長的關鍵遺傳損傷（Schiller JH等，N Engl J Med，346:92-98, 2002)。
[0009] 表皮生長因子受體（EGFR)是170千道爾頓（kDa)的膜結(jié)合蛋白，其表達于上皮 細胞的表面上。EGFR是蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的生長因子受體家族的成員，所述激酶是一類 細胞周期調(diào)控分子（W. J. Gullick 等，1986, Cancer Res.，46 :285-292)。EGFR 當它的配體 (EGF或TGF- α )結(jié)合細胞外結(jié)構域時被激活，導致受體細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構域的自體磷 酸化（S. Cohen 等，1980, J. Biol. Chem.，255 :4834-4842 ;Α· Β. Schreiber 等，1983, J. Biol. Chem. ，258 :846-853)。
[0010] EGFR是促進生長的癌基因，erbB或ErbBl的蛋白產(chǎn)物，但是該基因是一種家 族的成員，即原癌基因的ERBB家族，其據(jù)信在許多人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作 用。特別地，已經(jīng)在乳腺、膀胱、肺、頭、頸和胃癌以及膠質(zhì)母細胞瘤中觀察到EGFR表達的 提高。癌基因的ERBB家族編碼四種，結(jié)構相關的跨膜受體，g卩，EGFR，HER-2/neu(erbB2)， HER-3 (erbB3)和HER-4 (erbB4)。臨床上，已經(jīng)報道腫瘤中的ERBB癌基因擴增和/或受 體過表達與疾病復發(fā)和患者不良預后，以及與治療中的反應性有關（LHarris等，1999， Int.J. Biol. Markers，14 :8_15;和 J. Mendelsohn 和 J.Baselga，2000，Oncogene，19: 6550-6565)。
[0011] EGFR由三個主要結(jié)構域組成，g卩，細胞外結(jié)構域（E⑶），其被糖基化并且包含配 體結(jié)合性穴和兩個半胱氨酸富集區(qū)；一個短的跨膜結(jié)構域，和一個具有固有酪氨酸激酶 活性的細胞內(nèi)結(jié)構域。所述跨膜區(qū)將配體結(jié)合結(jié)構域連接到細胞內(nèi)結(jié)構域上。氨基酸和 DNA序列分析，以及EGFR的非糖基化形式的研宄表明EGFR的蛋白質(zhì)主鏈具有132kDa的 質(zhì)量，具有1186個氨基酸殘基氨基酸殘基（A.L. Ullrich等，1984, Nature，307 :418-425 ; J. Downward 等，1984，Nature，307 :521-527 ;C. R. Carlin 等，1986，Mol. Cell. Biol.，6 : 257-264 ;和 F. L. V. Mayes 和 M. D. Waterfield，1984, The EMBO J.，3 :531-537)。
[0012] EGF或TGF-α與EGFR結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導途徑并導致細胞增殖。EGFR的二聚體 化，構象變化以及內(nèi)化作用作用來傳遞細胞同信號，導致細胞生長調(diào)控（G. Carpenter和 S. Cohen，1979, Ann. Rev. Biochem.，48 :193-216)。影響生長因子受體功能，或?qū)е率荏w和 /或配體過表達的遺傳變化導致細胞增殖。此外，已經(jīng)確定EGFR在細胞分化、細胞運動性 增強，蛋白質(zhì)分泌，新血管形成，入侵，轉(zhuǎn)移和癌細胞對化療劑和放射的耐受性中發(fā)揮作用。 (M. -J. Oh 等，2000, Clin. Cancer Res.，6 :4760-4763) 〇
[0013] 已經(jīng)鑒定了多種EGFR的抑制劑，包括多種已經(jīng)進行臨床試驗用于治療各種癌癥。 近期的概述，見 de Bono, J.S.和 Rowinsky，E.K. (2002)，" The ErbB receptor Family: A Therapeutic Target For Cancer" , Trends in Molecular Medicine，8, S 19-26。
[0014] 在癌癥的治療中對于治療性干預有希望的一組革E標包括HER-激酶axis的成員。 它們在實體上皮腫瘤，例如，前列腺、肺和乳腺腫瘤中經(jīng)常上調(diào)，并且在膠質(zhì)母細胞瘤中也 上調(diào)。表皮生長因子受體（EGFR)是HER-激酶axis的成員，并且已經(jīng)是開發(fā)幾種不同癌癥 療法的靶標選擇。EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs)是這些療法之一，因為酪氨酸殘基 的可逆性磷酸化是EGFR途徑激活所必需的。換句話說，EGFR-TKIs阻抑對促進和/或維持 細胞信號途徑負責的細胞表面受體，所述信號途徑誘導腫瘤細胸生長和分裂。具體地，據(jù)信 這些抑制劑干擾EGFR激酶結(jié)構域，稱為HER-I。更有希望的EGFR-TKIs為三個系列的化合 物：喹唑啉類、吡啶并嘧啶類和吡咯并嘧啶類。
[0015] 在臨床開發(fā)中兩種更先進的化合物包括Gefitinib (由AstraZeneca UK Ltd.開 發(fā)的化合物 ZD1839 ;商品名 IRESSA ;下文為"IRESSA")和 Erlotinib (由 Genentech， Inc. and OSI Pharmaceuticals，Inc.開發(fā)的化合物 0SI-774 ;商品名 TARCEVA ;下文 為"TARCEVA");二者都產(chǎn)生了令人鼓舞的臨床結(jié)果。用IRESSA和TARCEVA進行常規(guī)的 癌癥治療都包括每天口服不超過500mg的各自化合物。在2003年5月，當IRESSA被批準 用于治療晚期非小細胞肺癌患者時，它在這些產(chǎn)品中成為第一個進入美國市場的。
[0016] IRESSA是一種口服活性喹唑啉，其通過直接抑制EGFR分子上的酪氨酸激酶磷酸 化而起作用。它競爭三磷酸腺苷（ATP)結(jié)合位點，導致HER-激酶axis的抑制。IRESSA反 應的確切機制并不完全清楚，不過，研宄提示EGFR的存在是其作用的必要條件。
[0017] 在使用這些化合物中的顯著限制是其受體在他們開始對治療反應后可能會發(fā)展 出對它們的治療效果的耐受性，或者他們可能在任何可測量的程度上完全不對EGFR-TKIs 反應。事實上，只有10-15%的晚期非小細胞肺癌患者對EGFR激酶抑制劑反應。因而， 在靶向性治療中對于那些最可能受益于這種治療的個體來說更好地理解在對IRESSA和 TARCEVA的敏感性之下的分子機制將是極其有益的。
[0018] 本領域明顯需要癌癥的令人滿意的治療，特別是上皮細胞癌癥如肺、卵巢、乳腺、 腦、結(jié)腸和前列腺癌癥，其并入了 TKI治療的益處并克服了由患者展現(xiàn)的無反應性。這種治 療能夠?qū)€體的健康具有戲劇性的影響，特別是癌癥特別常見的老人。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 酪氨酸激酶抑制劑（TKI)療法如gefitinib ( IRESSA? )在大多數(shù)愛上述癌癥 影響的個體中并不有效。本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)EGFR激酶結(jié)構域軀體變異的存在基本 上提高了 EGFR對TKI如IRESSA，TARCEVA的敏感性。例如小于30%的患有這種癌癥的患者 易受由目前TKIs進行的治療的影響，而大于50%，更優(yōu)選60, 70,80,90%的具有EGFR激酶 結(jié)構域突變的患者是易受影響的。此外，這些突變賦予EGFR提高的激酶活性。因而，具有 這些突變的患者將可能對目前的酪氨酸激酶抑制劑（TKI)療法，例如，gefitinib有反應。
[0020] 因此，本發(fā)明提供一種確定在受癌癥影響的人類患者中表皮生長因子受體（EGFR) 靶向性治療有效性的可能性的新方法。該方法包括相對于野生型erbBl基因檢測所述患 者的erbBl基因的激酶結(jié)構域中的至少一種核酸變異的存在或缺失。至少一種變異的存 在表示EGFR靶向性治療可能有效。優(yōu)選地，所述核苷酸變異提高EGFR的激酶活性。隨后 可以用EGFR靶向性治療來治療所述患者。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述EGFR靶向性 治療是酪氨酸激酶抑制劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑是苯氨基喹唑 啉。所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨基喹唑啉。優(yōu)選地，所述合成的苯氨基喹唑啉為 gefitinib或erlotinib。在另一個實施方案中，所述EGFR革巴向性治療是不可逆的EGFR 抑制劑，包括4-二甲基氨基-but-2-烯酸[4-(3-氯-4-氟-苯氨基）-3-氰基-7-乙氧 基-喹啉-6-基]-酰胺（"EKB-569"，有時稱作"EKI-569"，見例如 W0/2005/018677 和 Torrance 等，Nature Medicine，vol. 6，No. 9，Sept. 2000，P. 1024)和 / 或 HKI-272 或 HKI-357(Wyeth;見Greenberger等，Proc. Ilth NCI EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy,Clinical Cancer Res. Vol. 6Supplement,Nov. 2000,ISSN 1078-0432； in Rabindran 等，Cancer Res. 64 :3958-3965 (2004) ;Holbro and Hynes，Ann. Rev. Pharm. Tox. 44 :195-217(2004) ;Tsou 等，j. Med. Chem.2005,48, 1107-1131 ;and Tejpar 等， J. Clin.Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. Vol. 22, No. 14S :3579 (2004))。
[0021] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述EGFR獲自有或處于發(fā)生癌癥危險中的患者的 生物樣品。EGFR(或erbBl基因）激酶結(jié)構域中的變異影響ATP結(jié)合口袋的構象結(jié)構。優(yōu) 選地，EGFR激酶結(jié)構域中的變異是框內(nèi)刪除或外顯子18、19、20或21中的取代。
[0022] 在一個實施方案中，所述框內(nèi)刪除在EGFR(erbBl)的外顯子19中。優(yōu)選地所述外 顯子19中的框內(nèi)刪除在刪除處至少由密碼子747, 748, 749,和750上的氨基酸亮氨酸、精 氨酸、谷氨酸和丙氨酸組成。在一個實施方案中，所述框內(nèi)刪除包含核苷酸2235-2249并刪 除氨基酸746-750 (序列谷氨酸，亮氨酸，精氨酸，谷氨酸和丙氨酸），見表2,表S2,圖2B，圖 4A，圖5,圖6C，和圖8C。在另一個實施方案中，所述框內(nèi)刪除包含核苷酸2236-2250并刪除 氨基酸氨基酸746-750,見表S2,圖5,和圖6C?；蛘撸隹騼?nèi)刪除包含核苷酸2240-2251， 見表2,圖2C，圖4A，圖5,或核苷酸2240-2257,見表2,表S3A，圖2A，圖4A，圖5,圖6C，和 圖8E?；蛘?，所述框內(nèi)刪除包含核苷酸2239-2247與在核苷酸2248上的半胱氨酸對鳥嘌 呤的取代，見表S3A和圖8D，或核苷酸2238-2255的刪除和核苷酸2237上的胸腺嘧啶對 腺嘌呤的取代，見表S3A和圖8F，或核苷酸2254-2277的刪除，見表S2 (SEQ ID NO :437)。 或者，所述刪除包含核苷酸 2239-2250delTTAAGAGAAGCA(SEQ ID N0:554) ;2251A>C，或 2240-2250delTAAGAGAAGCA(SEQ ID N0:720)，或 2257-2271delCCGAAAGCCAACAAG(SEQ ID NO :721)，如表S3B中所示。
[0023] 在另一個實施方案中，所述取代在EGFR的外顯子2中。所述外顯子2中的取代包 含至少一個氨基酸。在一個實施方案中，所述外顯子2中的取代在核苷酸2573上包含一個 鳥嘌呤對胸腺嘧啶的取代，見圖4A和圖5。這種取代導致氨基酸取代，其中野生型亮氨酸 在氨基酸858上被精氨酸所替換，見圖5,表2,表S2,表S3A，圖2D，圖6A，圖8B，和SEQ ID NO :512?；蛘撸鐾怙@子2中的取代在核苷酸2582上包含一個腺嘌呤對胸腺嘧啶的取 代，見圖4A和圖5。這種取代導致了氨基酸取代，其中野生型亮氨酸在氨基酸861上被谷 氨酰胺所替換，見圖5 (分別是SEQ ID NOS 740-762,以出現(xiàn)的順序），表2 (分別是SEQ ID NOS 730-739,以出現(xiàn)的順序），圖2E，表S3B(分別是SEQ ID NOS 554&720-729,以出現(xiàn)的順 序），和 SEQ ID NO :512。
[0024] 所述取代還可以在EGFR的外顯子18中。在一個實施方案中，所述外顯子18中的 取代是在核苷酸2155上胸腺嘧啶對鳥嘌呤的取代，見圖4A和圖5。這種取代導致了氨基酸 取代，其中野生型甘氨酸在密碼子719上被半胱氨酸所取代，見圖5, SEQ ID NO :512。在另 一個實施方案中，所述外顯子18中的取代是在核苷酸2155上腺嘌呤對鳥嘌呤的取代，導致 氨基酸取代，其中野生型甘氨酸在密碼子719上被絲氨酸所取代，見表S2,圖6B，圖8A，圖5 和 SEQ ID NO :512。
[0025] 在另一個實施方案中，所述取代是在如圖5所示的核苷酸2316之后和核苷酸2317 之前鳥嘌呤，鳥嘌呤和胸腺嘧啶（GGT)的插入（23162317ins GGT)。這也可以描述為纈氨酸 (V)在氨基酸772上的插入（P772_H733insV)。其它的突變顯示于表S3B中并包括，例如， 在如圖5所示的的核苷酸2309之后和核苷酸2310之前CAACCCGG的插入和在如圖5所示 的的核苷酸2311之后和核苷酸2312之前GCGTGGACA的插入。所述取代還可以在外顯子20 中并且在一個實施方案中為在核苷酸2334和2335上的AA對于GG的取代，見表S3B。
[0026] 總之，在優(yōu)選的實施方案中，erbBl基因的核酸變異是在如圖5所示的核苷酸 2155上胸腺嘧啶對鳥嘌呤或腺嘌呤對鳥嘌呤的取代，在如圖5所示的核苷酸2235-2249， 2240-2251，2240-2257, 2236-2250, 2254-2277,或 2236-2244 的刪除，在如圖 5 所示的核苷 酸2316之后和在核苷酸2317之前核苷酸鳥嘌呤，鳥嘌呤，和胸腺嘧啶（GGT)的插入，以及 在如圖5所示的核苷酸2573上鳥嘌呤對胸腺嘧啶或在2582上腺嘌呤對胸腺嘧啶的取代。
[0027] 通過擴增編碼受體的核酸片段可以測定至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測。 待擴增的片段為1000核苷酸長，優(yōu)選地，500核苷酸長，最優(yōu)選100核苷酸長或更小。待擴 增的片段可以包括多種變異。
[0028] 在另一個實施方案中，至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測提供了將包含變異 位點的EGFR核酸與至少一種核酸探針接觸。所述探針優(yōu)選地與包括變異位點并且在變異 位點包含互補核苷酸的核酸序列在選擇性雜交條件下雜交。雜交可以用可檢測的標記進行 檢測。
[0029] 在又一個實施方案中，至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測包括對至少一個核 酸序列進行測序并將獲得的序列與已知的erbBl核酸序列比較。或者，至少一個核酸變異 的存在或缺失包含至少一個核酸序列的質(zhì)譜測定。
[0030] 在優(yōu)選的實施方案中，至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測包括進行聚合酶鏈 式反應（PCR)。擴增包含假定變異的erbBl核酸序列并測定擴增的核酸的核苷酸序列。測 定擴增的核酸的核苷酸序列包括對至少一個核酸片段進行測序。或者，通過利用任何能夠 根據(jù)其大小分離擴增產(chǎn)物的方法，包括自動的和手動的凝膠電泳等等可以分析擴增產(chǎn)物。
[0031] 或者，至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測包括測定基因中多種變異的單倍 型。
[0032] 在另一個實施方案中，通過分析erbBl基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）t可以檢測EGFR變異 的存在或缺失。在這種實施方案中，使用特異性結(jié)合變異EGFR的探針。在優(yōu)選的實施方案 中，所述探針是優(yōu)選結(jié)合到變異EGFR上的抗體。變異EGFR的存在預示著EGFR靶向性治療 有效的可能性。或者，所述探針可以是抗體片段，嵌合性抗體，人源化抗體或適體。
[0033] 本發(fā)明進一步提供一種探針，其在選擇性結(jié)合條件下特異性結(jié)合到在EGFR基因 (erbBl)中包含至少一個核酸變異的核苷酸序列上。在一個實施方案中，所述變異是在 erbBl的激酶結(jié)構域中的突變，其賦予ATP結(jié)合性口袋的結(jié)構變化。
[0034] 本發(fā)明的探針可以包含大約500個核苷酸堿基的核苷酸序列，優(yōu)選大約100個核 苷酸堿基，最優(yōu)選大約50個核苷酸堿基或大約25個核苷酸堿基或更小的長度。所述探針 可以由DNA，RNA，或肽核酸（PNA)組成。另外，所述探針可以包含可檢測的標記，如例如，熒 光或酶學標記。
[0035] 本發(fā)明另外提供一種在受癌癥影響的患者中測定表皮生長因子受體（EGFR)靶向 性治療有效的可能性的新方法。所述方法包括測定來自患者的生物樣品中的EGFR的激酶 活性。與正常對照相比，在用EGFR配體刺激之后激酶活性的提高表明EGFR靶向性治療很 可能是有效的。
[0036] 本發(fā)明進一步提供一種治療具有或處于形成癌癥的危險之中的患者的新方法。所 述方法包括確定患者的EGFR的激酶結(jié)構域是否包含至少一種核酸變異。優(yōu)選地，EGFR位 于腫瘤或癌癥的位點上并且所述核酸變異是軀體性的。這種變異的存在表示EGFR靶向性 治療將是有效的。如果所述變異存在，向患者施用酪氨酸激酶抑制劑。
[0037] 如上，向經(jīng)鑒定的患者施用的酪氨酸激酶抑制劑可以是苯氨基喹唑啉或不可逆的 酪氨酸激酶抑制劑，如例如，EKB-569, HKI-272和/或HKI-357 (Wyeth)。優(yōu)選地，所述苯氨 基喹挫啉是合成的的苯氨基喹挫啉并且最優(yōu)選地所述合成的的苯氨基喹挫啉是gefitinib 和 erlotinib。
[0038] 要通過本發(fā)明的方法治療的癌癥包括，例如，但不限于，胃腸癌、前列腺癌、卵巢 癌、乳癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰癌、生 殖-泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌。在優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是非小細胞肺癌。
[0039] 還包括實施本發(fā)明的PCR方法的試劑盒。所述試劑盒包括至少一對設計來退火到 基因邊界核酸區(qū)上的簡并引物對，所述基因編碼EGFR激酶結(jié)構域的ATP結(jié)合口袋。此外， 所述試劑盒包含實施PCR擴增所必需的產(chǎn)品和試劑，以及說明書。
[0040] 在優(yōu)選的實施方案中，包含在試劑盒中的引物對選自SEQ ID NO :505, SEQ ID NO: 506，SEQ ID N0:507,和SEQ ID N0:508。在實施例中的表6和7中列出的引物也是優(yōu)選 的。
[0041] 在又一個實施方案中，本發(fā)明公開了一種選擇化合物的方法，所述化合物抑制變 異表皮生長因子受體（EGFR)的催化性激酶活性。作為第一步，將變異EGFR與可能的化合 物接觸。隨后檢測所述變異EGFR得到的激酶活性并選擇抑制變異EGFR的激酶活性的化合 物。在一個實施方案中，所述變異EGFR包含在細胞中。
[0042] 還可以使用所述方法選擇變異EGFR的激酶活性的化合物，所述變異EGFR在激酶 結(jié)構域中具有次發(fā)突變，其賦予對TKI，例如gefitinib或erlotinib的耐受性。
[0043] 在一個實施方案中，對所述變異EGFR進行標記。在另一個實施方案中，將EGFR結(jié) 合到固體支持物上。在優(yōu)選的實施方案中，所述固體支持物是蛋白質(zhì)芯片。
[0044] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，公開了一種抑制變異表皮生長因子受體（EGFR) 的催化性激酶活性的藥物組合物。抑制變異EGFR的催化劑激酶活性的化合物選自抗體、抗 體片段、小分子、肽、蛋白質(zhì)、反義核酸、核酶、PNA、siRNA、寡核苷酸適體，和肽適體。
[0045] 還公開了一種治療患有EGFR介導性疾病的患者的方法。按照該方法，對患者施用 抑制變異表皮生長因子受體（EGFR)的催化性激酶活性的藥物組合物。
[0046] 在一個實施方案中，所述EGFR介導性疾病是癌癥。在優(yōu)選的實施方案中，所述癌 癥是上皮起源的。例如，所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、頭頸癌、肺癌、非小細 胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰癌、生殖 _泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌。在 優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是非小細胞肺癌。
[0047] 在另一個實施方案中，公開了一種預測在erbBl基因的激酶結(jié)構域中獲得次發(fā)突 變（或選擇突變）的方法。將表達erbBl的變異形式的細胞與有效的，然而是亞致死劑量 的酪氨酸激酶抑制劑接觸。選擇抗酪氨酸激酶抑制劑生長阻滯作用的細胞并對erbBl核酸 分析erbBl激酶結(jié)構域中其它突變的存在。在一個實施方案中，所述細胞是體外的。在另 一個實施方案中，所述細胞獲自轉(zhuǎn)基因動物。在一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因動物是小鼠。 在此小鼠模型中，待研宄的細胞獲自腫瘤活檢組織。通過本發(fā)明選擇的在erbBl激酶結(jié)構 域中包含次發(fā)突變的細胞可以用在以上方法中以選擇化合物，所述化合物抑制在激酶結(jié)構 域中具有次發(fā)突變的變異EGFR的激酶活性。
[0048] 在預測在erbBl基因的激酶結(jié)構域中獲得次發(fā)突變的另一個實施方案中， 首先將表達erbBl基因變異形式的細胞與效量的誘變劑接觸。所述誘變劑是，例 如，甲磺酸乙酯（EMS)，N-乙基-N-亞硝基脲（ENU)，N-甲基-N-亞硝基脲（MNU)， phocarbaxine hydrochloride (Prc)，甲橫酸甲醋（MeMS)，苯丁 酸氣芥（Chl)，美法侖， porcarbazine hydrochloride，環(huán)磷酰胺（Cp)，硫酸二乙醋（Et2SO4),丙稀酰胺單體（AA)， 三亞乙基密胺（TEM)，氮芥，長春新堿，二甲基亞硝胺，N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍 (MNNG)，7,12二甲基苯并（a)蒽（DMBA)，環(huán)氧乙燒，六甲基磷酰胺，bisulfan，或ethyl methanesulforate (EtMs)。隨后將細胞與有效的，但亞致死劑量的酪氨酸激酶抑制劑接觸。 選擇抗酪氨酸激酶抑制劑生長阻滯作用的細胞并對erbBl核酸分析erbBl激酶結(jié)構域中其 它突變的存在。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 圖1A-1B顯示在頑固性非小細胞肺癌（NSCLC)中Gefitinib反應的代表性圖示。 病例6的胸腔CT掃描（表I)，顯示（圖1A)用gefitinib治療前在右肺中的大的質(zhì)量，（圖 1B)在開始Gefitinib治療后的六周出現(xiàn)顯著的改善。
[0050] 圖2顯示Gefitinib反應性腫瘤中的EGFR突變。
[0051] 圖2A-2C顯示腫瘤樣本中EGFR基因的核苷酸序列，在激酶結(jié)構域內(nèi)具有雜合的框 內(nèi)刪除（雙峰）（出現(xiàn)順序分別為SEQ ID N0S643-644和690-699)。在有義和反義方向的 追蹤顯示證明了刪除的兩人斷裂點；野生型核苷酸序列以大寫字母顯示，而突變序列以小 寫字母顯示。delL747-T751insS突變的Y斷裂點的前面為T-C取代，其并不改變編碼的 氨基酸。
[0052] 圖2D和圖2E顯示雜合的錯義突變（箭頭），導致在酪氨酸激酶結(jié)構域內(nèi)的氨基酸 取代（SEQ ID NOS 701&703)。雙峰代表雜合突變位點上的兩個核苷酸。為了進行比較，還 顯示了相應的野生型序列（SEQ ID NOS 700&702)。
[0053] 圖2F是二聚EGFR分子被EGF配體結(jié)合的流程圖。突出了細胞外結(jié)構域（包含兩 種受體配體[L]-結(jié)構域和furin-like結(jié)構域），跨膜區(qū)，和細胞質(zhì)結(jié)構域（包含催化性激 酶結(jié)構域）。指出了用途受體激活標記的自體磷酸化位點的酪氨酸 1CI68(Y-1068)的位置，以 及由EGFR自體磷酸化激活的下游效應劑（STAT3，MAP激酶（MAPK)，和AKT)。顯示了腫瘤相 關突變的定位，都在酪氨酸激酶結(jié)構域中。
[0054] 圖3表明突變EGFR的增強的EGF依賴型激活和突變EGFR對Gefitinib提高的敏 感性。
[0055] 圖3A顯示野生型EGFR相比，在添加 EGF到血清饑餓細胞中后delL747-P753insS 和L858R突變體的配體誘導的激活時間過程。EGFR自體磷酸化被用作受體激活的標記，與 Cos-7細胞中表達的EGFR總體水平（對照；右板）相比，使用用特異性識別EGFR的磷酸化 酪氨酸1(168殘基的抗體的蛋白質(zhì)印跡（左板）。在加入EGF(10ng/ml)的時間間隔上測量 EGFR的自體磷酸化。
[0056] 圖3B是野生型和突變型受體磷酸化作用的EGF誘導的圖示（見版A)。利用NIH 圖像軟件對來自三個獨立實驗的放射自顯影進行量化；將EGFR磷酸化作用的強度規(guī)格化 為總體蛋白質(zhì)表達，并顯示為受體的百分比激活，帶有標準偏差。
[0057] 圖3C顯示由Gefitinib產(chǎn)生的EGFR激活的劑量依賴型抑制。通過表達野生型 或突變型受體的Cos-7細胞的蛋白質(zhì)印跡分析證明EGFR的酪氨酸 1(168的自體磷酸化，并用 100ng/ml的EGF刺激30min。如所示對細胞不處理（U)或用提高濃度的Gefitinib預處理 3hrs (左板）。表達的EGFR蛋白總量顯示為對照（右板）。
[0058] 圖3D顯示來自對圖版3C所述的兩種實驗的結(jié)果的量化（NIH圖像軟件）。將磷酸 化的EGFR濃度規(guī)格化為蛋白質(zhì)表達水平并表示為受體的百分比激活。
[0059] 圖4顯示了在EGFR的ATP-結(jié)合性口袋內(nèi)關鍵位點上的突變的聚類。
[0060] 圖4A顯示在多種NSCLC情況下（SEQ ID NOS 495-504 (DNA) )，EGFR基因的外顯 子19中重疊的框內(nèi)刪除和外顯子21的錯義突變的位置。對每種外顯子顯示部分核苷酸序 列，通過虛線標記刪除并突出和對錯義突變下劃線；顯示野生型EGFR核苷酸和氨基酸序列 (SEQ ID NOS 493&494(DNA)&509-510(氨基酸））。
[0061] 圖4B顯示EGFR ATP裂口的立體結(jié)構，兩翼是激酶結(jié)構域的氨基（N)和羧基（C)凸 起部（源自I3DBlMH的等同物，并利用Cn3D軟件展示）。抑制劑Gef itinib，圖示占據(jù)ATP 裂口。顯示了兩種錯義突變的定位，在激酶的激活性環(huán)內(nèi)；三個框內(nèi)刪除都存在于另一個環(huán) 內(nèi)，在ATP裂口側(cè)翼。
[0062] 圖4C顯示EGFR激酶結(jié)構域的特寫，顯示與結(jié)合ATP或抑制劑相關的氨基酸殘基。
[0063] 具體地，4-苯氨基喹唑啉化合物如gefitinib通過占據(jù)ATP結(jié)合位點抑制催化， 其中它們與甲硫氨酸793 (M793)和半胱氨酸775 (C775)殘基形成氫鍵，而它們的苯胺環(huán)接 近甲硫氨酸766(M766)，賴氨酸（K745)，和亮氨酸788(L788)殘基。預測突變所靶向的環(huán)內(nèi) 的框內(nèi)刪除相對于抑制劑改變這些氨基酸的位置。顯示突變的殘基在酪氨酸激酶的激活環(huán) 內(nèi)。
[0064] 圖5顯示erbBl基因的核苷酸和氨基酸序列。所述氨基酸被描述為本領域技術人 員已知的單個字母。通過患者數(shù)目來突出激酶結(jié)構域中的核苷酸變異，見表2。如圖5所示 的包括核苷酸1到3633。SEQ IDNO :512包括氨基酸1到1210。
[0065] 圖6A-6C :在EGFR和B-Raf激酶結(jié)構域內(nèi)的選定區(qū)的序列比對。人NSCLC中EGFR 突變的描繪。iEGFR(gb:X00588;)NSCLC腫瘤中的突變以灰色突出顯示。在多種腫瘤類型 (5)中的B-Raf (gb:M95712)突變以黑色突出顯示。星號表示殘基EGFR和B-Raf之間保守 的殘基。圖6A描繪了激活環(huán)中的L858R突變（SEQ ID N0S477-479)。圖6B描繪了 P環(huán)中 的G719S突變（SEQ ID NOS 480-482)。圖6C描繪了 EGFR外顯子19中的刪除突變（SEQ ID NOS 483-489)〇
[0066] 圖7 :EGFR激酶結(jié)構域的三維結(jié)構中的錯義突變G719S和L858R和Del-I刪除的位 置。激活環(huán)以黃色顯示，P環(huán)以藍色顯示并指出C端凸起和N端凸起。由突變或刪除靶向的 殘基以紅色突出顯示。Del-I突變靶向密碼子746-750的殘基ELREA。突變定位在激酶內(nèi)高 度保守的區(qū)域中并發(fā)現(xiàn)于P環(huán)和激活環(huán)中，其包圍著ATP并且也是gefitinib和erlotinib 預測結(jié)合的區(qū)域。
[0067] 圖8A-8F.來自正常組織和來自腫瘤組織的EGFR DNA的代表性色譜。鑒定的突變 的定位如下。圖8A描繪了外顯子18激酶結(jié)構域P環(huán)（SEQ ID NOS 704-705)。圖8B描繪 了外顯子21激酶結(jié)構域A-環(huán)（SEQ ID NOS 706-707)。圖8C描繪了外顯子19激酶結(jié)構 域 Del-1(SEQ ID NOS 708-710)。圖 8D 描繪了外顯子 19 激酶結(jié)構域 Del-3 (SEQ ID NOS 711-713)。圖8E描繪了外顯子19激酶結(jié)構域Del-4 (SEQ ID NOS 714-716)。圖8F描繪了 外顯子 19 激酶結(jié)構域 Del-5 (SEQ ID NOS 717-719)。
[0068] 圖9 :EGFR和BCR-ABL多肽的序列比對和賦予藥物耐受性表型的殘基的定位。將由 GenBank編號NM005228中公開的核苷酸編碼的EGFR多肽（SEQ ID N0:492)和由Gen Bank 編號M14752中公開的核苷酸序列編碼的BCR-ABL多肽（SEQ ID NO :491)進行比對并用陰 影標注保守性殘基。通過星號表示賦予對酪氨酸激酶抑制劑imatinib(STI571，Glivec/ Gleevec)耐受性的BCR-ABL突變。
[0069] 圖10顯示對于患有轉(zhuǎn)移性NSCLC患者來說決定進行EGFR測試的過程。
[0070] 圖IlEGFR外顯子18-24的圖（未給出比例尺）。箭頭描述了鑒定突變的定位。星 號表明在每個位置上具有突變的患者的數(shù)目。單相交圖描繪了外顯子19刪除的重疊，以及 具有每個刪除的患者的數(shù)目（如圖5所示的的核苷酸2233-2277和SEQ ID NO :512的殘基 745-749)。注意這些結(jié)果并沒有包括目前所有的EGFR突變。

【具體實施方式】
[0071] 本發(fā)明提供一種確定在受癌癥影響的人類患者中表皮生長因子受體（EGFR)靶向 性治療有效的可能性的新方法。該方法包括檢測所述患者的erbBl基因的激酶結(jié)構域中的 至少一種核酸變異的存在或缺失。至少一種變異的存在表示EGFR靶向性治療可能有效。優(yōu) 選地，所述核苷酸變異提高EGFR的激酶活性。隨后可以用EGFR靶向性治療來治療所述患 者。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述EGFR靶向性治療是酪氨酸激酶抑制劑。在優(yōu)選的實 施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑是苯氨基喹唑啉。所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨 基喹挫啉。優(yōu)選地，所述合成的苯氨基喹挫啉為gefitinib或erlotinib。
[0072] 定義：
[0073] 術語"ErbBl"，"表皮生長因子受體"，和"EGFR"在本文中相互交換使用 并指如，例如，在Carpenter等Ann. Rev. Biochem. 56 :881-914(1987)中公開的天然序列 EGFR，包括其變體（例如如在Humphrey等PNAS(USA)87 :4207-4211 (1990)中的刪除突變 EGFR)。ErbBl指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因。
[0074] 本文所用的術語"提高激酶活性的核苷酸變異"指基因的核苷酸序列中的變異 (即突變），其導致提高的激酶活性。提高的激酶活性是在所述核酸中的變異的直接結(jié)果并 且所述基因編碼的蛋白質(zhì)相關聯(lián)。
[0075] 本文所用的術語"藥物"或"化合物"指施用給個體以治療或預防或控制疾病 或狀況的化學實體或生物學產(chǎn)品，或化學實體或生物學產(chǎn)品的組合。優(yōu)選地，但并非必需 地，所述化學實體或生物學產(chǎn)品是低分子量化合物，但是也可以是較大的化合物，例如， 核酸的寡聚體，氨基酸，或糖類，包括但不限于蛋白質(zhì)，寡核苷酸，核酶，DNA酶，糖蛋白， siRNAs，脂蛋白，適體，及其改進和組合。
[0076] 在本發(fā)明的背景中術語"基因型"指基因的特定等位形式，其可以用在特定位點 存在于核酸序列中的特定核苷酸來定義。
[0077] 術語"基因的變異形式"，"基因的形式"，或"等位基因"指基因在群體中的 一種特定形式，所述特定形式與相同基因的其它形式在所述基因序列中的至少一個，經(jīng)常 是大于一個變異位點的序列上有所不同。在基因的不同等位基因之間差異的這些變異位點 上的序列稱作"基因序列變異"或"變異"或"變體"。本領域已知的其它等同術語包括 突變和多態(tài)性，盡管突變經(jīng)常用來指與有害表型相關聯(lián)的等位基因。在本發(fā)明的優(yōu)選方面， 所述變異選自由本文變異表中所列出的變異。
[0078] 在本發(fā)明的背景下，術語"探針"指能夠可檢測地區(qū)分結(jié)構不同的靶分子的分 子。根據(jù)所用探針的類型和靶分子的類型，檢測可以以多種不同方式實現(xiàn)。因而，例如，檢 測可以基因靶分子的活性水平的區(qū)別，但優(yōu)選基于特異性結(jié)合的檢測。這種特異性結(jié)合的 例子包括抗體結(jié)合和核酸探針雜交。因而，例如，探針可以包括酶底物，抗體和抗體片段，優(yōu) 選核酸雜交探針。
[0079] 如本文所用的，術語"有效"和"有效性"包括藥學有效性和生理安全性。藥學 有效性指治療在患者中導致所需的生物學作用的能力。生理安全性指在細胞，組織和/或 生物水平上的毒性，或其它有害生理作用的水平（通常稱為副作用），其是由治療的施用而 產(chǎn)生的。"有效性較小的"指治療導致藥學有效性的治療上明顯較低的水平和/或有害生 理作用的治療上較高的水平。
[0080] 術語"引物"正如本文所用的，是指這樣一種寡核苷酸：S卩，當這種寡核苷酸被置 于催化合成與多核苷酸互補的引物延伸產(chǎn)物的條件下時，它能夠用作沿互補鏈進行多核苷 酸合成的起始點。這些條件包括在適當?shù)木彌_液（"緩沖液"包括作為輔因子或影響PH、 離子強度等的成份）中，和在適當?shù)臏囟认麓嬖谒姆N不同的三磷酸核苷酸或核苷類似物以 及一種或多種用于聚合的試劑例如DNA聚合酶和/或反轉(zhuǎn)錄酶。引物必須長得足以在用于 聚合酶的試劑存在時引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。典型的引物含有長至少大約5個核苷酸的基本 上與靶序列互補的序列，但是在某種程度上較長的引物是優(yōu)選的。引物通常含有大約15-26 個核苷酸，但也可以采用更長的引物。
[0081] 引物總是含有基本上與靶序列，即引物可以與之退火的待擴增的特異性序列，互 補的序列。除了與靶序列互補的序列之外，引物還可任選地包含其它序列。術語"啟動子 序列"定義了由RNA聚合酶特異性識別的核酸序列單鏈，所述RNA聚合酶結(jié)合到所識別的 序列上并引發(fā)產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄過程。原則上，可以采用任何啟動子序列，只要對于該 啟動子具有已知的可獲得的能夠識別起始序列的聚合酶即可。已知的有用啟動子是那些被 某些噬菌體聚合酶，如噬菌體T3、T7或SP6識別的啟動子。
[0082] "微陣列"是在固體支持物表面上形成的具有優(yōu)選不連續(xù)區(qū)域，每一區(qū)域具有限 定的面積，的線性或二維陣列。由單個固體支持物的表面上待檢測的靶多核苷酸的總數(shù) 來確定微陣列上不連續(xù)區(qū)域的密度，優(yōu)選的是至少大約50/cm 2,更優(yōu)選的是至少大約100/ cm2,甚優(yōu)選的是至少大約500/cm2,并且更甚優(yōu)選的是至少大約l，000/cm 2。正如本文所用 的，DNA微陣列是置于芯片或其它表面上的用來擴增或克隆靶多核苷酸的寡核苷酸引物陣 列。由于每個特定引物組在陣列中的位置是已知的，因此基于靶多核苷酸與微陣列中特定 位置的結(jié)合，可以確定它們的特性。
[0083] 術語"標記物"是指能夠產(chǎn)生指示測定樣品中存在靶多核苷酸的可檢測信號的 組合物。適宜的標記物包括放射性同位素、核苷酸發(fā)色團、酶、底物、熒光分子、化學發(fā)光部 分、磁性顆粒、生物發(fā)光部分以及類似物質(zhì)。于是，標記物是可以由分光的、光化學的、生物 化學的、免疫化學的、電子的、光學的或化學的工具檢測的任何組合物。
[0084] 術語："支持物"是指常規(guī)的支持物，如珠、顆粒、棒、纖維、過濾器、膜以及硅烷 或硅酸鹽支持物，如玻片。
[0085] 術語"擴增"廣義上是指產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，所述擴增產(chǎn)物可包括例如其它靶分子， 或者靶樣分子或者與靶分子互補的分子，所述分子是由樣品中靶分子的存在而產(chǎn)生的。在 靶物是核酸的情形中，利用DNA或RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄酶可以酶促產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。
[0086] 如本文所用的，"生物學樣品"指從個體中分離的組織或液體的樣品，它包括但 不限于，例如，血液、血漿、血清、腫瘤活檢組織、尿液、糞便、痰、脊髓液、胸水、乳頭吸取物、 淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、淚液、唾液、乳液、細胞（包括但不限 于血細胞）、腫瘤、器官，也包括體外細胞培養(yǎng)組分的樣品。在優(yōu)選的實施方案中，樣品來 自切除術、支氣管活檢組織，或原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的核心針活檢組織，或來自胸水的細胞 團。此后，使用細針吸取樣品。樣品可以是石蠟包埋或冷凍的組織。
[0087] 術語"抗體"意為一種免疫球蛋白，其能夠結(jié)合抗原。如本文所用的抗體意為包 括能夠結(jié)合目標抗原或抗原片段的抗體片段，例如F(ab' )2, Fab'，F(xiàn)ab。優(yōu)選地，所述抗 體結(jié)合抗原抑制EGFR的變異形式的活性。
[0088] 術語"人源化抗體"在本文用于描述完全的抗體分子，即由兩條完全的輕鏈和兩 種完全的重鏈組成，以及只由抗體片段，例如Fab，F(xiàn)aV，F(xiàn) (ab) 2,和Fv組成，其中⑶Rs源 自非人來源而剩余的Ig分子的部分或其部分源自人抗體，優(yōu)選地產(chǎn)生自編碼人抗體的核 酸序列。
[0089] 術語"人抗體"和"人源化抗體"在本文用來描述一種抗體，該抗體分子的所有 部分都源自編碼人抗體的核酸序列。這些人抗體是適于用在抗體療法中，因為這些抗體將 在人患者中引發(fā)小的或不引發(fā)免疫反應。
[0090] 術語"嵌合性抗體"在本文中用于描述抗體分子以及抗體片段，如上面在術語" 人源化抗體"的定義中所述。術語"嵌合性抗體"表達人源化抗體。嵌合性抗體具有源自 第一種哺乳類物種的重鏈或輕鏈氨基酸序列的至少一部分以及源自第二種不同的哺乳類 物種的重鏈或輕鏈氨基酸序列的另一部分。
[0091] 優(yōu)選地，所述可變區(qū)源自非人哺乳類物種并且恒定區(qū)源自人類物種。具體地，嵌合 性抗體優(yōu)選產(chǎn)自非人哺乳動物的編碼可變區(qū)的9個核苷酸序列以及來自人的編碼抗體恒 定區(qū)的核苷酸序列。
[0092] 表2是與本發(fā)明中所述方法相關的erbBl的激酶結(jié)構域中的DNA序列變異的部分 列表。這些變化由本發(fā)明人在來自對gefitinib起反應的患有NSCLC的患者以及不接觸 g e f i t i n i b的患者的生物學樣品的研宄中鑒定。
[0093] 利用任一種本領域公知的技術可以將核酸分子從特定的生物學樣品中分離出 來，所選的特定分離方法適于特定的生物學樣品。例如凍融和堿裂解方法可以用于從固 體物質(zhì)中獲得核酸分子；熱和堿裂解方法可以用于從尿中獲得核酸分子；而蛋白酶K提 取可以用于從血液中獲核酸（Rolff，A 等 PCR :Clinical Diagnostics and Research， Springer(1994)。
[0094] 檢測方法
[0095] 可以用多種方式來測定在具有或處于形成癌癥的危險之中的患者中的erbBl基 因的激酶結(jié)構域中特定變異或多種變異的存在或缺失。這些測試通常利用收集自生物學樣 品的DNA或RNA樣品來進行，所述生物學樣品例如，活檢組織、尿、糞便、唾液、血液、細胞、組 織刮肩、乳腺抽吸物或其它細胞物質(zhì)，并且能夠通過多種方法進行，包括，但不限于，PCR，與 等位基因特異性探針雜交，酶學突變檢測，化學剪切錯配，質(zhì)譜分析或DNA測序，包括小型 測序。在特定的實施方案中，與等位基因特異性探針雜交能夠以兩種形式進行：（1)等位基 因特異性寡核苷酸結(jié)合到固相（玻璃、硅、尼龍膜）和溶液中標記的樣品上，正如在許多DNA 芯片應用中一樣，或（2)在溶液中結(jié)合樣品（經(jīng)常是克隆的DNA或PCR擴增DNA)和標記的 寡核苷酸（可以是等位基因特異性的或短的以便允許通過雜交進行測序）。診斷測試可以 包括一組變異，經(jīng)常在固體支持物上，其能夠進行一個以上變異的同時測定。
[0096] 在另一方面，測定erbBl基因中至少一種提高激酶活性的核酸變異的存在必需單 倍型測試。測定單倍型的方法是本領域技術人員已知的，例如，在WO 00/04194中。
[0097] 優(yōu)選地，測定至少一種提高激酶活性的核酸變異的存在或缺失包括通過聚合酶鏈 式反應（PCR)測定變異位點的序列?；蛘?，測定提高激酶活性的核酸變異的存在或缺失可 以包括鏈末端DNA測序或小型測序，寡核苷酸雜交或質(zhì)譜分析。
[0098] 本發(fā)明的方法可以用來預測在具有或處于形成癌癥的危險之中的患者中EGFR靶 向性治療有效（或無效）的可能性。優(yōu)選地，癌癥包括上皮組織起源的癌癥，包括，但不限 于，胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng) 膜癌、皮膚癌、肝癌、胰癌、生殖 _泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌。在優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是 非小細胞肺癌。
[0099] 本發(fā)明一般性地涉及erbBl基因的激酶結(jié)構域中的變異的鑒定，其是在具有或處 于形成癌癥的危險之中的患者中EGFR靶向性治療有效的指征。此外，在EGFR的激酶結(jié)構 域中特異性變異的鑒定，在效果上，能夠用作診斷或預防測試。例如，在erbBl基因的激酶 結(jié)構域中至少一個變異的存在表明患者將可能受益于用EGFR靶向化合物進行的治療，如， 例如，酪氨酸激酶抑制劑。
[0100] 用于診斷性測試的方法是本領域公知的并公開于專利申請W000/04194中，在此 并入作為參考。在一種例示性的方法中，所述診斷性測試包括擴增跨越erbBl基因序列的 激酶結(jié)構域中的一個或多個變異的DNA或RNA (-般在將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA后）片段。隨后 對這種擴增的片段進行測序和/或進行聚丙烯酰胺凝膠電泳以便鑒定擴增片段中的核酸 變異。
[0101] PCR
[0102] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種通過PCR，或，備選地，在連接鏈式反應（LCR) 中篩選erbBl基因的激酶結(jié)構域中變異的方法（見，例如，Landegran，等，1988. Science 241 :1077-1080 ;和 Nakazawa，等，1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :360-364)，后者可 以特別用于檢測EGFR基因中的點突變（見，Abravaya，等，1995.Nucl.Acids Res. 23 : 675-682)。該方法包括以下步驟：設計簡并引物用于擴增靶序列，所述引物對應于基因的一 種或多種保守性區(qū)域，利用獲自測試生物學樣品的DNA或cDNA作為模板用引物進行擴增反 應，和分析PCR產(chǎn)物。測試生物學樣品與對照樣品的PCR產(chǎn)物的比較表明測試生物學樣品 中的變異。所述變化可以是核酸變異在測試生物學樣品中的缺失或存在。
[0103] 備選的擴增方法包括：自持序列復制（見，Guatelli，等，1990.?1"〇(：.似1:1.八〇&(1· Sci.USA 87 :1874-1878)，轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)（見，Kwoh，等，1989.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 86:1173-1177) ;Qb 復制酶（見，Lizardi，等，1988. BioTechnology 6:1197)，或任何其它 核酸擴增方法，然后利用本領域技術人員公知的技術對擴增的分子進行檢測。這些檢測方 案對于核酸分子的檢測特別有用，如果這些分子以極低數(shù)目存在的話。
[0104] 利用蛋白質(zhì)的氨基酸序列或erbBl基因的激酶結(jié)構域的核酸序列作為指導設計 根據(jù)本發(fā)明的有用引物，所述序列例如SEQ ID NO :493, SEQ ID NO :494, SEQ ID NO :509， 和SEQ ID NO :510。在基因的同源性區(qū)域設計引物，其中至少兩個同源區(qū)域被可變序列的 差異區(qū)分隔開，所述序列在長度或核酸序列上是可變的。
[0105] 例如，相同的或高度同源的，優(yōu)選具有至少大約6個，優(yōu)選至少8-10個連接氨基 酸的至少80% -85%，更加優(yōu)選至少90-99 %的同源性氨基酸序列。最優(yōu)選地，所述氨基酸 序列是100%相同的。基于密碼子簡并性和在已知基因家族成員之間給定位置上各種氨基 酸的保持設計正向和反向引物。本文提到的同源性程度是基于利用標準序列比較軟件進 行的氨基酸序列分析，如使用默認設置的蛋白質(zhì)-BLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/)。
[0106] 下表3給出了簡并密碼子的用法和它們的標準符號：
[0107]

【權利要求】
1. 一種試劑盒，其包含： a. 設計來退火到EGFR激酶結(jié)構域的外顯子19或21內(nèi)部的核酸區(qū)域上的至少一種探 針； b. 進行退火反應所必需的產(chǎn)物和試劑；和 c?說明書， 其中所述探針在選擇性結(jié)合條件下特異性結(jié)合到在erbBl基因中的外顯子19或21中 包含至少一個變異的核酸序列上，其中所述變異為導致EGFR基因的外顯子19中的框內(nèi)刪 除的突變，其由導致氨基酸改變的在密碼子746-753內(nèi)的刪除組成，所述氨基酸改變包含 至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的刪除，或其中所述 變異為導致氨基酸改變的外顯子21內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的 858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)組成。
2. -種試劑盒，其包含： a. 設計來退火到EGFR激酶結(jié)構域的外顯子19或21的邊界或內(nèi)部的核酸區(qū)域上的至 少一對簡并引物，其中所述引物對特異性擴增在EGFR基因中的外顯子19或21中包含至少 一個變異的核酸序列，其中所述變異為導致EGFR基因的外顯子19中的框內(nèi)刪除的突變， 其由導致氨基酸改變的在密碼子746-753內(nèi)的刪除組成，所述氨基酸改變包含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的刪除，或其中所述變異為導致氨 基酸改變的外顯子21內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸 取代亮氨酸（L858R)組成； b. 進行PCR擴增所必需的產(chǎn)物和試劑；和 c?說明書。
3. -種試劑盒，其包含： a. 設計來檢測EGFR激酶結(jié)構域的外顯子19或21中的變異的至少一種核酸探針，其中 所述核酸探針檢測EGFR基因中的外顯子19或21中的至少一個變異，其中所述變異為導致 EGFR基因的外顯子19中的框內(nèi)刪除的突變，其由導致氨基酸改變的在密碼子746-753內(nèi)的 刪除組成，所述氨基酸改變包含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨 酸和谷氨酸的刪除，或其中所述變異為導致氨基酸改變的外顯子21內(nèi)的取代，所述氨基酸 改變由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)組成，其中所述檢測基 于與核苷酸變異序列的特異性雜交； b. 進行退火反應所必需的產(chǎn)物和試劑；和 c?說明書。
4. 一種試劑盒，其包含： a. 設計來退火到EGFR激酶結(jié)構域的外顯子18的邊界或內(nèi)部的核酸區(qū)域上的至少一對 簡并引物，其中所述引物對特異性擴增在EGFR基因中的外顯子18中包含至少一個變異的 核酸序列，其中所述變異為導致氨基酸改變的外顯子18內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列 SEQ ID NO. 512的719位以半胱氨酸取代甘氨酸（G719C)組成； b. 進行PCR擴增所必需的產(chǎn)物和試劑；和 c?說明書。
5. -種試劑盒，其包含： a. 設計來檢測EGFR激酶結(jié)構域的外顯子18中的變異的至少一種核酸探針，其中所述 核酸探針檢測EGFR基因中的外顯子18中的至少一個變異，其中所述變異為導致氨基酸改 變的外顯子18內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的719位以半胱氨酸取代 甘氨酸（G719C)組成，其中所述檢測基于與核苷酸變異序列的特異性雜交； b. 進行退火反應所必需的產(chǎn)物和試劑；和 c?說明書。
6. -種探針，其在選擇性結(jié)合條件下特異性結(jié)合到在erbBl基因中的外顯子19或21 中包含至少一個變異的核酸序列上，其中所述變異為導致EGFR基因的外顯子19中的框內(nèi) 刪除的突變，其由導致氨基酸改變的在密碼子746-753內(nèi)的刪除組成，所述氨基酸改變包 含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的刪除，或其中所 述變異為導致氨基酸改變的外顯子21內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的 858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)組成。
7. 權利要求6的探針，其中所述探針包含長度為500個核苷酸堿基或更少的核酸序列。
8. 權利要求6的探針，其中所述探針包含肽核酸（PNA)。
9. 權利要求6的探針，其進一步包含可檢測標記。
10. -種核酸探針，其設計來檢測EGFR基因中的外顯子19或21中的變異，其中所述 變異為導致EGFR基因的外顯子19中的框內(nèi)刪除的突變，其由導致氨基酸改變的在密碼子 746-753內(nèi)的刪除組成，所述氨基酸改變包含至少SEQ ID NO. 512中第747、748和749位 的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的刪除，或其中所述變異為導致氨基酸改變的外顯子21內(nèi)的取 代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸取代亮氨酸（L858R)組成，其 中所述檢測基于與核苷酸變異序列的特異性雜交。
11. 權利要求10的核酸探針，其中所述核酸探針包含長度為500個核苷酸堿基或更少 的核酸序列。
12. 權利要求10的核酸探針，其中所述核酸探針包含肽核酸（PNA)。
13. 權利要求10的核酸探針，其進一步包含可檢測標記。
14. 一種核酸探針，其設計來檢測EGFR基因中的外顯子18中的變異，其中所述變異為 導致氨基酸改變的外顯子18內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的719位以 半胱氨酸取代甘氨酸（G719C)組成，其中所述檢測基于與核苷酸變異序列的特異性雜交。
15. -種引物對，其設計來退火到EGFR激酶結(jié)構域的外顯子19或21的邊界或內(nèi)部的 核酸區(qū)域上，其中所述引物對特異性擴增在EGFR基因中的外顯子19或21中包含至少一個 變異的核酸序列，其中所述變異為導致EGFR基因的外顯子19中的框內(nèi)刪除的突變，其由導 致氨基酸改變的在密碼子746-753內(nèi)的刪除組成，所述氨基酸改變包含至少SEQ ID NO. 512 中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的刪除，或其中所述變異為導致氨基酸改 變的外顯子21內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的858位以精氨酸取代亮 氨酸（L858R)組成。
16. -種引物對，其設計來退火到EGFR激酶結(jié)構域的外顯子18的邊界或內(nèi)部的核酸 區(qū)域上，其中所述引物對特異性擴增在EGFR基因中的外顯子18中的至少一個變異，其中所 述變異為導致氨基酸改變的外顯子18內(nèi)的取代，所述氨基酸改變由序列SEQ ID NO. 512的 719位以半胱氨酸取代甘氨酸（G719C)組成。
17. -種具有SEQ ID N0:512氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)，其中將選自氨基酸 746-750、747-751 和 747-753 的氨基酸刪除。
18. -種具有SEQ ID NO :512氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)，其包含在氨基酸858上用 精氨酸取代亮氨酸。
19. 一種具有SEQ ID NO :512氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)，其包含在氨基酸719上用 半胱氨酸取代甘氨酸。
【文檔編號】C12N15/11GK104480200SQ201410680729
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2005年3月31日 優(yōu)先權日:2004年3月31日
【發(fā)明者】W. 貝爾 D., A. 哈伯 D., A. 賈恩 P., E. 約翰遜 B., J. 林奇 T., 邁耶森 M., G. 佩茨 J., R. 塞勒斯 W., E. 塞特爾曼 J., 索德拉 R. 申請人:綜合醫(yī)院公司, 達納-法伯癌癥協(xié)會有限公司