一種使用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種使用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法，將黑曲霉菌種置三角瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2％的比例將菌絲均勻添加到濕潤為2:1的虎杖根莖中，于40℃恒溫下堆積發(fā)酵30h。本發(fā)明采用固體堆積發(fā)酵法將虎杖中虎杖苷轉(zhuǎn)化成白黎蘆醇，并對(duì)固體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。此方法既沒有強(qiáng)烈的酸堿反應(yīng)發(fā)生，又無需粗提苷，同時(shí)不需添加貴重設(shè)備，易于推廣。本發(fā)明白藜蘆醇提取得率提高至1.197％，比現(xiàn)有方法產(chǎn)率提高了30％，取得了非常顯著的技術(shù)效果。
【專利說明】
一種使用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及黑曲霉的應(yīng)用，具體涉及一種利用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]虎杖Polygonumcuspidatum的有效成分主要為二苯乙烯類和蒽醌類化合物,前者主要是白藜蘆醇及其糖苷，后者主要是大黃素及其糖苷，其中以二苯乙烯類化合物具有顯著獨(dú)特的功效。白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗過敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化和對(duì)冠心病、缺血性心臟病、高血脂癥等具有防治作用，白藜蘆醇已被列為抗心血管、抗癌最有前途的藥物之一。據(jù)報(bào)道，干燥虎杖根莖中白藜蘆醇的含量為0.1%?0.2%，而虎杖苷含量為2%左右，如何高效地把虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇已成為研究熱點(diǎn)。
[0003]目前，有人用酸堿水解或改性纖維素酶解法對(duì)虎杖苷進(jìn)行分解，但是酸堿會(huì)造成環(huán)境污染，降低產(chǎn)量，而生物酶解成本較高，工藝較為復(fù)雜，因此都不利于推廣應(yīng)用。也有采用浸沒發(fā)酵方式用產(chǎn)酶微生物直接轉(zhuǎn)化虎杖苷為白藜蘆醇的報(bào)道，但設(shè)備及操作要求高，基礎(chǔ)建設(shè)投入大。
[0004]中國專利201110374767.7公開了一種黑曲霉，保藏編號(hào):CCTCC No:M 2011358，
其生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖中白藜蘆醇含量，達(dá)到了 0.92%。但該方法還有進(jìn)一步提升的空間。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種工藝簡單、易于推廣的使用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法。
[0006]解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種使用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法，將黑曲霉菌種置三角瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的比例將菌絲均勻添加到濕潤為2:1的虎杖根莖中，于40°C恒溫下堆積發(fā)酵30h。
[0007]進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基是以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，去掉其中的蔗糖，加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為I %的過80目的虎杖粉。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0009]1、本發(fā)明采用固體堆積發(fā)酵法將虎杖中虎杖苷轉(zhuǎn)化成白黎蘆醇，并對(duì)固體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。此方法既沒有強(qiáng)烈的酸堿反應(yīng)發(fā)生，又無需粗提苷，同時(shí)不需添加貴重設(shè)備，易于推廣。
[0010]2、本發(fā)明白藜蘆醇提取得率提高至1.197%,比現(xiàn)有方法產(chǎn)率提高了 30%，取得了非常顯著的技術(shù)效果。

【具體實(shí)施方式】
[0011 ] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說明。
[0012]黑曲霉菌株堆積發(fā)酵轉(zhuǎn)化虎杖中虎杖苷的條件主要有:溫度、接種量、接種菌齡、發(fā)酵濕度。
[0013]將接種量、菌齡、濕度分別固定為2%、36h、2:1，發(fā)酵溫度設(shè)定為30、40、50、601:4
個(gè)梯度，進(jìn)行堆積發(fā)酵，每隔6h取樣分析虎杖苷轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的情況。發(fā)酵前期虎杖苷轉(zhuǎn)化速度隨發(fā)酵溫度上升而加快，轉(zhuǎn)化程度也隨之提高，但溫度高于40°C時(shí)，白藜蘆醇含量在發(fā)酵30h時(shí)達(dá)到峰值后，后逐步下降。
[0014]菌齡不同的菌株體內(nèi)酶系發(fā)育情況不同，適應(yīng)環(huán)境的能力也不同。將接種量、溫度、濕度分別固定為2%、40°C、2:1，菌齡設(shè)定為24、36、48、60h，4個(gè)梯度，進(jìn)行堆積發(fā)酵，每隔6h取樣分析虎杖苷轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的情況。對(duì)于霉菌液體培養(yǎng)而言，發(fā)酵24h往往是菌株對(duì)數(shù)生長前期，而發(fā)酵60h則菌體進(jìn)入次級(jí)代謝初期，因培養(yǎng)基配比及發(fā)酵條件變化，略有出入。當(dāng)用菌齡為24h菌株發(fā)酵，最大白藜蘆醇含量僅為0.75%，而用菌齡為60h菌株發(fā)酵，菌內(nèi)酶系濃度雖然高，但菌繁殖速度慢，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化程度低于菌齡為36h和48h的菌。綜合菌繁殖和菌產(chǎn)酶能力，選擇將菌齡為48h的菌接種入虎杖進(jìn)行堆積發(fā)酵為宜。
[0015]將菌齡、溫度、濕度分別固定為48h、40°C、2:1，發(fā)酵接種量設(shè)定為1%、2%、3%、4% 4個(gè)梯度，進(jìn)行堆積發(fā)酵，每隔6h取樣分析虎杖內(nèi)虎杖苷轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的情況。接種量在堆積發(fā)酵過程中的影響如同液體浸沒發(fā)酵，即接種量小，則發(fā)酵遲滯期延長，對(duì)發(fā)酵而言意味著生產(chǎn)強(qiáng)度降低和發(fā)酵染菌風(fēng)險(xiǎn)提高；但接種量過大，意味著作為種子培養(yǎng)增加，成本也增加，因此接種量選擇2%為宜。
[0016]將接種量、溫度、菌齡分別固定為2%、40°C、48h，發(fā)酵添加水與虎杖干質(zhì)量的比例設(shè)定為1.8:1.2:1、2.2:1、2.5:1共4個(gè)梯度，堆積發(fā)酵，每隔6h取樣分析虎杖內(nèi)虎杖苷轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的情況。發(fā)酵過程中水活度增加，即濕度提高，有助于菌體生長和外泌酶的擴(kuò)散，因此濕度增加能夠加快虎杖苷的酶解和提高白藜蘆醇提取率；但另一方面，濕度提高卻增加白藜蘆醇提取過程的能耗，使分離純化過程成本上升。因而在堆積發(fā)酵時(shí)，濕度必然有一最適值。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濕度由1.8:1提高至2:1時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)白藜蘆醇含量提高幅度較大；而進(jìn)一步提高濕度時(shí)，白藜蘆醇含量增幅減緩。因此，選擇濕度為2:1，虎杖發(fā)酵較為理本巨
ο
[0017]將黑曲霉菌種置三角瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)基是以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，去掉其中的蔗糖，加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%的過80目的虎杖粉。待菌絲長好后，與適量水及虎杖根莖混勻。水與虎杖根莖的質(zhì)量比為2:1，代菌絲的菌株接種量為虎杖干重的2%。在40°C恒溫下堆積發(fā)酵30h。
[0018]發(fā)酵的樣品提取白藜蘆醇時(shí)，先通風(fēng)干燥發(fā)酵好的虎杖，后加入定量的乙醇，恒溫加熱提取一定時(shí)間，抽濾。取一定量的提取液分別用乙醚、乙酸乙酯萃取，分離得到白藜蘆醇、虎杖苷。
[0019]米用紫外分光光度法作定量分析，白藜蘆醇在306nm、白藜蘆醇苷在325nm處有最大吸收。提取液用有機(jī)溶劑萃取分離后，用756MC型紫外可見分光光度計(jì)分別在各有效成分的最大吸收波長處測定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各有效成分的質(zhì)量濃度，從而計(jì)算出提取率。通過計(jì)算，白藜蘆醇提取得率提高至1.197%，該提取率較現(xiàn)有技術(shù)中0.92%的提取率提高了 30%，取得了非常顯著的技術(shù)效果。
【權(quán)利要求】
1.一種使用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法，其特征在于，將黑曲霉菌種置三角瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的比例將菌絲均勻添加到濕潤為2:1的虎杖根莖中，于40°C恒溫下堆積發(fā)酵30h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用黑曲霉發(fā)酵提高白藜蘆醇收率的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，去掉其中的蔗糖，加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%的過80目的虎杖粉。
【文檔編號(hào)】C12P7/22GK104388478SQ201410681191
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】金京勛 申請(qǐng)人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司