利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法，將吸水鏈霉菌新鮮斜面用甘油與吐溫80洗下，過(guò)濾，將過(guò)濾后的單孢子原液加水，加入滅菌的LiCl水溶液，在搖床作用6小時(shí)后立即取出，置于紫外燈下照射；紫外光光照射處理后，孢子液于4℃避光放置，轉(zhuǎn)入可見(jiàn)光下，稀釋涂布于LiCl的分離培養(yǎng)基平皿上，25℃培養(yǎng)；將在分離培養(yǎng)基平皿上的單菌落接種在葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基上培養(yǎng)；再經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵。本發(fā)明利用紫外光處理、光復(fù)活和暗修復(fù)等方法中菌體效價(jià)與發(fā)酵上清液效價(jià)呈中等程度以上的正相關(guān)性，提高菌株的變異幾率。在這種情況下可以用測(cè)定發(fā)酵上清液效價(jià)取代測(cè)定菌體效價(jià)來(lái)進(jìn)行初篩工作，以排除大量低產(chǎn)型菌落。
【專利說(shuō)明】利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]雷帕霉素(Rapamycin，RPM, RAPA)，又名西羅莫司(Sirolimus)，是在1975年由加拿大Ayerst研究所從吸水鏈霉菌(Strepomyces hygroscopicus)中分離出來(lái)的三烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它作為一種新型的高效免疫抑制劑引起了廣泛的關(guān)注，同時(shí)它又是一種有效的抗真菌劑并具有抗腫瘤的作用。進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)，菌種選育最重要的手段之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法。
[0004]為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種吸水鏈霉菌的誘變方法，步驟如下:
[0005]I)將吸水鏈霉菌新鮮斜面用20%甘油與0.1%吐溫80洗下，過(guò)濾，將過(guò)濾后的單孢子原液加水至10ml，按0.85%終濃度加入滅菌的LiCl水溶液，在28°C搖床作用6小時(shí)后立即取出，置于波長(zhǎng)253.7nm、功率30W的紫外燈下30cm處開(kāi)蓋振搖照射；紫外光光照射處理后，孢子液于4°C避光放置24h，轉(zhuǎn)入可見(jiàn)光下，稀釋涂布于0.5 % LiCl的分離培養(yǎng)基平皿上，于25°C培養(yǎng)20天；
[0006]2)將在分離培養(yǎng)基平皿上長(zhǎng)好的單菌落接種在葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基斜面上，于25°C培養(yǎng)15天后進(jìn)行液體發(fā)酵；
[0007]3)于250ml三角瓶?jī)?nèi)裝50ml種子培養(yǎng)基，由斜面按種后于28°C振搖培養(yǎng)48小時(shí)；
[0008]4)于500ml三角瓶?jī)?nèi)裝50_100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，由種子以5%接種量轉(zhuǎn)種后于25°C振搖培養(yǎng)96小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。
[0009]進(jìn)一步地，所述分離培養(yǎng)基組分及重量百分比為酵母膏0.1 %、牛肉膏0.1 %，水解乳蛋白0.2%、葡萄糖1.0%，瓊脂1.2%。
[0010]進(jìn)一步地，所述葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基組分及重量百分比為:天門(mén)冬素0.05%，K2HPO40.05%，葡萄糖 1.0%，瓊脂 1.2%0
[0011 ] 進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基組分及重量百分比為:黃豆餅粉2.0%，葡萄糖2.5%，淀粉 1.0%, (NH4)2S040.3%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，CaCO30.2%。
[0012]進(jìn)一步地，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分及重量百分比為:黃豆餅粉3.0%，葡萄糖2.5%, (NH4)2S040.5%，ΚΗ2Ρ040.3%，CaCO30.3%，液化淀粉 2.0%,消沫劑:0.02%，豆油:0.5%, pH 8.0。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0014]本發(fā)明利用紫外光處理、光復(fù)活和暗修復(fù)等方法中菌體效價(jià)與發(fā)酵上清液效價(jià)呈中等程度以上的正相關(guān)性，提高菌株的變異幾率。在這種情況下可以用測(cè)定發(fā)酵上清液效價(jià)取代測(cè)定菌體效價(jià)來(lái)進(jìn)行初篩工作，以排除大量低產(chǎn)型菌落。

【具體實(shí)施方式】
[0015]將吸水鏈霉菌新鮮斜面用20%甘油與0.1%吐溫80洗下，過(guò)濾，將過(guò)濾后的單孢子原液加水至10ml，按0.85%終濃度加入滅菌的LiCl水溶液，在28°C搖床作用6小時(shí)后立即取出，置于波長(zhǎng)253.7nm、功率30W的紫外燈下30cm處開(kāi)蓋振搖照射；紫外光光照射處理后，孢子液于4°C避光放置24h，轉(zhuǎn)入可見(jiàn)光下，稀釋涂布于0.5% LiCl的分離培養(yǎng)基平皿上，于25°C培養(yǎng)20天。分離培養(yǎng)基組分及重量百分比為酵母膏0.1%、牛肉膏0.1%，水解乳蛋白0.2%、葡萄糖1.0%，瓊脂1.2%。
[0016]將在分離培養(yǎng)基平皿上長(zhǎng)好的單菌落接種在葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基斜面上，于25°C培養(yǎng)15天后進(jìn)行液體發(fā)酵。葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基組分及重量百分比為:天門(mén)冬素0.05%, K2HPO40.05%，葡萄糖 1.0%，瓊脂 1.2% 0
[0017]于250ml三角瓶?jī)?nèi)裝50ml種子培養(yǎng)基，由斜面按種后于28 °C振搖培養(yǎng)48小時(shí)；種子培養(yǎng)基組分及重量百分比為:黃豆餅粉2.0%，葡萄糖2.5%，淀粉1.0%，(NH4) 2S040.3 %，KH2PO40.05 %，MgSO40.05 %，CaCO30.2 %。
[0018]于500ml三角瓶?jī)?nèi)裝50_100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，由種子以5 %接種量轉(zhuǎn)種后于25°C振搖培養(yǎng)96小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分及重量百分比為:黃豆餅粉3.0%，葡萄糖 2.5%, (NH4)2S040.5%，KH2P040.3%，CaCO30.3%，液化淀粉 2.0%,消沫劑:0.02%,豆油:0.5%, pH 8.0。
[0019]菌液分析:
[0020]雷帕霉素的TLC分析:發(fā)酵液離心后菌絲用三倍體積的95%乙醇浸泡2— 3小時(shí)，在硅膠板上點(diǎn)樣，用丙酮:正已烷2:3展開(kāi)，溶媒揮發(fā)后在含白色念珠菌檢定平板上鋪板顯跡。用雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。
[0021]波拉霉素(po1ramycin)的TLC分析:發(fā)酵液離心后菌絲加95 %乙醇至原體積，浸泡2— 3小時(shí)，在硅膠板上點(diǎn)樣。用異丁醇:水4:1展開(kāi)，溶媒揮發(fā)后在含枯草桿菌檢定平板上鋪板顯跡。用波拉霉素粗品作為對(duì)照。
[0022]HPLC 分析:用島津 Lc 一 6A, Shirnadzu shim-pack ODS 柱,檢測(cè)波長(zhǎng)為 277nm,流動(dòng)相80%甲醇,流速lml/min。
[0023]還原糖的測(cè)定:蒽酮比色定糖法。
[0024]氨基氮的測(cè)定:甲醛法。
[0025]發(fā)酵液總蛋白含量的測(cè)定=Folin-酚法。
[0026]葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性檢測(cè):于不同時(shí)間分別取發(fā)酵液10ml，離心，棄上清，將菌體用0.9 % NaCl溶液洗兩次后，加入檸檬酸-Na2HPO4緩沖液5ml，混勻，冰浴中超聲波破碎8分鐘(10HZ，100W)，取出，4°C 12000rpm離心20min，上清即為粗酶液(稀釋后即可由Folin-酚法測(cè)定其總蛋白濃度)。將不同溶液按以下比例加入:0.58mlH20，
0.1OmlNADP-Na2 溶液，0.1OmlTris-HCI 緩沖液，0.1OmlMgCl2 溶液，0.1Oml G_6-P_Na2溶液，0.02ml粗酶液。加好后混勻，移入石英比色杯中，記下339nm的光吸收值。室溫(250C )反應(yīng),2.3min后開(kāi)始讀數(shù)。每隔一分鐘讀一次,連續(xù)讀3_5min,取平均值,據(jù)b =8095 X ΛΑ/At(U/L)計(jì)算酶活力。由酶活力除以相應(yīng)粗酶液的總蛋白濃度即知其相對(duì)活力。
[0027]菌絲干重的測(cè)定:于不同時(shí)間取定量發(fā)酵液，離心，棄上清，用無(wú)菌水洗兩次，置80 一 100°C烤干至恒重。
[0028]本發(fā)明利用紫外光處理、光復(fù)活和暗修復(fù)等方法中菌體效價(jià)與發(fā)酵上清液效價(jià)呈中等程度以上的正相關(guān)性，提高菌株的變異幾率。在這種情況下可以用測(cè)定發(fā)酵上清液效價(jià)取代測(cè)定菌體效價(jià)來(lái)進(jìn)行初篩工作，以排除大量低產(chǎn)型菌落。
[0029]以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法，其特征在于，步驟如下: 1)將吸水鏈霉菌新鮮斜面用20%甘油與0.1%吐溫80洗下，過(guò)濾，將過(guò)濾后的單孢子原液加水至101111，按0.85%終濃度加入滅菌的11(^1水溶液，在281搖床作用6小時(shí)后取出，置于波長(zhǎng)253.7=1功率301的紫外燈下30(^處開(kāi)蓋振搖照射；紫外光光照射處理后，孢子液于41避光放置2處，轉(zhuǎn)入可見(jiàn)光下，稀釋涂布于0.5% 1101的分離培養(yǎng)基平皿上，于251培養(yǎng)20天； 2)將在分離培養(yǎng)基平皿上長(zhǎng)好的單菌落接種在葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基斜面上，于251培養(yǎng)15天后進(jìn)行液體發(fā)酵； 3)于25001三角瓶?jī)?nèi)裝5001種子培養(yǎng)基，由斜面按種后于281振搖培養(yǎng)48小時(shí)； 4)于5001111三角瓶?jī)?nèi)裝50-1001111液體發(fā)酵培養(yǎng)基，由種子以5%接種量轉(zhuǎn)種后于251振搖培養(yǎng)96小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法，其特征在于，所述分離培養(yǎng)基組分及重量百分比為酵母膏0.1 %、牛肉膏0.1 %，水解乳蛋白0.2 %、葡萄糖1.0%，瓊脂 1.2%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法，其特征在于，所述葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基組分及重量百分比為:天門(mén)冬素0.05%，1(2^040.05%，葡萄糖1.0%，瓊脂 1.2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組分及重量百分比為:黃豆餅粉2.0%，葡萄糖2.5%，淀粉1.0%，(順4) 38040.3 %，狃2？040^ 05 %，1叻040^ 05 %，(^⑶辦 2 %。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素的方法，其特征在于，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分及重量百分比為:黃豆餅粉3.0 %，葡萄糖2.5 %，(^?) 28040^ 5 %，1^5040.3^,01(:030.3^,液化淀粉 2.0%，消沫劑:0.02%，豆油:0.8.0。
【文檔編號(hào)】C12N13/00GK104388492SQ201410681228
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】金京勛 申請(qǐng)人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司