一種體外酶反應(yīng)生成異戊二烯的方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種體外酶反應(yīng)生成異戊二烯的方法及應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所提供的方法是將表達(dá)甲羥戊酸激酶基因，磷酸甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因和異戊二烯合成酶基因分別導(dǎo)入宿主菌中，發(fā)酵培養(yǎng)所得的五種重組菌，再利用超聲波分別破碎菌體獲得粗酶液，混合五種粗酶液獲得反應(yīng)酶液，再向反應(yīng)酶液中加入反應(yīng)底物溶液后體外合成異戊二烯。本發(fā)明所提供的方法實(shí)現(xiàn)了利用酶反應(yīng)在體外利用甲羥戊酸合成異戊二烯，實(shí)現(xiàn)了在體外通過(guò)精確控制代謝酶含量來(lái)合成異戊二烯。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種體外酶反應(yīng)生成異戊二烯的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種體外酶反應(yīng)生成異戊二烯的方法及應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]異戊二烯是一種重要的化工平臺(tái)化合物，其95%用于合成橡膠；也是丁基橡膠的第二單體。此外，異戊二烯還廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、香料及粘結(jié)劑等領(lǐng)域。目前，異戊二烯的來(lái)源主要是通過(guò)石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學(xué)合成法(包括異丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5餾分萃取蒸餾法。然而，隨著化石資源的日益枯竭，原料來(lái)源是利用石油基原料制備異戊二烯的重要瓶頸問(wèn)題。
[0003]隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研宄者開(kāi)始探討生物法合成異戊二烯可行性。生物體中主要存在兩種天然的代謝途徑進(jìn)行異戊二烯的生物合成，即甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)途徑。Yang jianming等在大腸桿菌內(nèi)過(guò)表外源MEP途徑，通過(guò)發(fā)酵罐發(fā)酵48h后，異戊二稀產(chǎn)量達(dá)到300mg/L，產(chǎn)率僅為1.8%。Genencor公司以大腸桿菌為宿主菌，表達(dá)外源MVA途徑相關(guān)酶及葛根異戊二烯合成酶，通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化使異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到100g/L左右，但是其發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)88h，時(shí)間產(chǎn)率僅為1.33g/L/h，由于發(fā)酵過(guò)程中碳代謝流不能精確控制，其質(zhì)量產(chǎn)率僅為8.3%。雖然通過(guò)MVA代謝途徑制備異戊二烯及其相關(guān)的萜類(lèi)化合物有了一定的進(jìn)展，但是由于缺少相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)的動(dòng)力學(xué)信息和合成途徑中代謝通量的詳盡了解，只是在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)相關(guān)酶的突變、改變酶的表達(dá)強(qiáng)度調(diào)節(jié)酶的含量以及調(diào)節(jié)各種酶的組合等復(fù)合方法來(lái)調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量(Gibson, MethodsEnzymol,498:349 - 361, 2011 ；Shao and Zhao, Nucleic Acids Res 37 (2):el6,2009 ；Parayil Kumaran Ajikumar et al.，Science, 330 (6000): 70 - 74，2010)。這些方法具有很強(qiáng)的隨機(jī)性，并不能夠精確控制各種酶的組合及用量。通過(guò)非細(xì)胞的體外反應(yīng)，可以在體外指導(dǎo)最佳的反應(yīng)體系，通過(guò)精確的控制各酶的含量及添加相關(guān)的輔助因子用量，找出整個(gè)代謝途徑中的關(guān)鍵因素，尋找關(guān)鍵步驟，確定關(guān)鍵酶。為細(xì)胞內(nèi)代謝途徑優(yōu)化提供參考依據(jù)。劉天罡等在用九個(gè)純化蛋白在體外構(gòu)建了 MVA代謝途徑生產(chǎn)法呢烯，根據(jù)體外反應(yīng)信息指導(dǎo)優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)法呢稀的生產(chǎn)，使法呢稀產(chǎn)量提高了 2000倍(Tiangang Liu etal., B1technol.B1eng, 9999:1 - 10,2014)。目前，尚未有報(bào)道以甲羥戊酸為底物，利用五個(gè)粗蛋白體外構(gòu)建異戊二烯合成代謝途徑的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種體外酶反應(yīng)生成異戊二烯的方法，所采取的技術(shù)方案如下:
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種體外酶反應(yīng)生成異戊二烯的方法，該方法是將表達(dá)甲羥戊酸激酶基因，磷酸甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因和異戊二烯合成酶基因分別導(dǎo)入宿主菌，發(fā)酵培養(yǎng)所得的五種重組菌，再利用超聲波分別破碎菌體獲得粗酶液，混合五種粗酶液獲得反應(yīng)酶液，再向反應(yīng)酶液中加入反應(yīng)底物溶液后體外合成異戊二烯
[0006]所述方法的步驟如下:
[0007]1)將獲得的甲羥戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19、戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因IDII和異戊二烯合成酶基因Isps4分別構(gòu)建入宿主菌表達(dá)質(zhì)粒載體中，獲得五種重組質(zhì)粒；
[0008]2)將步驟1)所得的五種重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入宿主菌，獲得五種重組菌；
[0009]3)發(fā)酵培養(yǎng)步驟2)所得五種重組菌，分別表達(dá)甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、戊烯焦磷酸異構(gòu)酶和異戊二烯合成酶；
[0010]4)收集步驟3)所培養(yǎng)的菌體，分別超聲破碎后，獲得五種粗酶液；
[0011]5)按比例混合步驟4)所得的五種粗酶液，獲得反應(yīng)酶液；
[0012]6)向步驟5)所得的反應(yīng)酶液中加入反應(yīng)底物溶液，混合反應(yīng)液；
[0013]7)將步驟6)所得的混合反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至厭氧反應(yīng)瓶中，補(bǔ)水后密封，在室溫下靜置反應(yīng)120min，獲得異戊二烯溶液。
[0014]所述基因來(lái)源為化學(xué)合成、擴(kuò)增自微生物或擴(kuò)增自重組質(zhì)粒。
[0015]優(yōu)選地，所述甲羥戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因IDII，來(lái)源于糞腸球菌、釀酒酵母、金黃色葡萄球菌或肺炎雙球菌；所述異戊二烯合成酶基因Isps4，來(lái)源于葛根或柏楊。
[0016]優(yōu)選地，所述甲羥戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登錄號(hào)為855248 ;所述磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登錄號(hào)為855260 ;所述甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19，GeneBank登錄號(hào)為100195467 ;所述異戊稀焦磷酸異構(gòu)酶基因IDII，GeneBank登錄號(hào)為855986 ;所述異戊二烯合成酶Isps4，GeneBank登錄號(hào)為AB198180。
[0017]所述宿主菌為大腸桿菌、釀酒酵母或枯草芽孢桿菌。
[0018]所述培養(yǎng)重組大腸桿菌是，將已構(gòu)建的重組大腸桿菌接種于100ml LB培養(yǎng)基中，搖床37°C 180rpm培養(yǎng)至OD600為0.6-1.0，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.1-1.0mmol.L勺，20°C培養(yǎng)12-18小時(shí)。
[0019]培養(yǎng)結(jié)束后在4°C 8000rpm條件下離心5min收集菌體，用5ml pH7.4磷酸鹽緩沖液洗滌三次，超聲波破碎:22kHz，150W, 10分鐘，破碎后4°C，15000rpm離心5min，收集上清，即為粗酶液。
[0020]所述超聲破碎，超聲頻率為22kHz,超聲功率為150W，超聲時(shí)間為lOmin。
[0021 ] 所述混合五種粗酶液，是調(diào)整甲羥戊酸激酶的濃度至60-160 μ g/L ;磷酸甲羥戊酸激酶60-160 μ g/L ;甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶60-160 μ g/L ;異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶60-160 μ g/L ;異戊二烯合成酶 60-160 μ g/L。
[0022]優(yōu)選地，所述混合五種粗酶液，是調(diào)整甲羥戊酸激酶的濃度至160yg/L，磷酸甲羥戊酸激酶80 μ g/L ;甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶80 μ g/L ;異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶60 μ g/L ;異戊二烯合成酶160 μ g/L ο
[0023]所述反應(yīng)底物溶液，含有50mM磷酸鹽緩沖溶液，4mM ATP，30mM KCl，8mM MgCl2，0.2mM MnCl2,0.0lmM ZnS04，4mM β -巰基乙醇和 2.5mM 甲羥戊酸。
[0024]所述方法用于利用甲羥戊酸為底物或中間產(chǎn)物，體外酶反應(yīng)生產(chǎn)異戊二烯以及異戊二烯基單元合成的萜類(lèi)化合物。
[0025]更進(jìn)一步，本方法還提供了一種以甲羥戊酸為中間產(chǎn)物，體外酶反應(yīng)生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法。是在精確調(diào)控各種酶及輔助因子用量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用甲羥戊酸為底物，體外酶反應(yīng)生產(chǎn)目的產(chǎn)物異戊二烯以及異戊二烯基單元合成的萜類(lèi)化合物。
[0026]所述方法的具體步驟如下:
[0027]1)將獲得異戊二烯代謝相關(guān)酶甲羥戊酸激酶基因(ERG12)、磷酸甲羥戊酸激酶基因(ERG8)、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因(ERG19)、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因(IDI1)以及異戊二烯合成酶的基因(Isps4)5’端和3’端分別引入酶切位點(diǎn)，將所述基因分別克隆到pET-30a或者pACYDUet-Ι或者pTrcHis2A或者pBAD等載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體P-ERG12、p-ERG8、p_ERG19、p_ID1、p_isps4 ;或克隆至 pTricHis2A 上，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pTric-low ；
[0028]2)分別將步驟1)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coll BL21(DE3)或者 Escherichia coli w3110 或者 Escherichia coli JM109)內(nèi)得到五株重組菌；
[0029]3)利用步驟2)得到的重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；
[0030]4)收集步驟3)得到的菌體，利用磷酸鹽緩沖液重懸，220kHz 150W超聲波破碎20min，15000rpm離心收集上清液即為粗酶液；
[0031]5)混合步驟4)得到的五種粗酶液，并調(diào)整甲羥戊酸激酶的濃度至160yg/L，磷酸甲羥戊酸激酶80 μ g/L ;甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶80 μ g/L ;異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶60 μ g/L ;異戊二烯合成酶160 μ g/L,獲得反應(yīng)酶液；
[0032]6)向步驟5)所得的反應(yīng)酶液中加入反應(yīng)底物溶液，獲得反應(yīng)混合液；
[0033]7)將步驟6)所得的混合反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至厭氧反應(yīng)瓶中，補(bǔ)水后密封，在室溫下靜置反應(yīng)120min，獲得異戊二烯溶液。
[0034]本發(fā)明通過(guò)固定四個(gè)酶的量，僅改變一個(gè)酶的用量，考察此酶的變化對(duì)異戊二烯產(chǎn)量的影響程度。三個(gè)酶MVD、ID1、PMK在改變其濃度的情況下，異戊二烯產(chǎn)量變化不明顯。而改變MVK及Isps4濃度的情況下，異戊二烯產(chǎn)量變化非常明顯，隨著濃度的不斷增加，異戊二烯產(chǎn)量出現(xiàn)大幅度的增加，說(shuō)明MVK及Isps4在異戊二烯合成過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用。
[0035]本發(fā)明獲得的有益效果如下:
[0036]1.本發(fā)明構(gòu)建的方法能夠在體外利用酶反應(yīng)將甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為異戊二烯；
[0037]2.利用本發(fā)明方法，精確調(diào)控各酶及輔助因子的用量，確定了在異戊二烯合成途徑中的關(guān)鍵酶異戊二烯合成酶及甲羥戊酸激酶；
[0038]3.構(gòu)建一個(gè)可控的調(diào)控體系，控制異戊二烯的合成，同時(shí)為細(xì)胞內(nèi)的異戊二烯合成代謝調(diào)控提供依據(jù)。
[0039]4.本發(fā)明不僅可用于異戊二烯合成，本發(fā)明還可以用于異戊二烯基單元合成的萜類(lèi)化合物。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1為異戊二烯氣相圖譜。
[0041]圖2為粗濾液濃度與異戊二烯產(chǎn)量的關(guān)系。

【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0043]以下實(shí)施例所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。
[0044]實(shí)施例中所用的甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、異戊稀焦磷酸異構(gòu)酶為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MVA代謝相關(guān)的酶基因以及來(lái)自葛根(Kudzu)異戊二稀合成酶基因分別連接到大腸桿菌表達(dá)載體上pET-30a(+)上轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3);得到的陽(yáng)性克隆培養(yǎng)至0D600為0.6?0.8，加IPTG終濃度為0.5mmol，20°C培養(yǎng)12?18小時(shí)獲得。
[0045]實(shí)施例中所用的甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、異戊二烯合成酶五個(gè)酶共表達(dá)的混合粗酶是將如上述所提到的五個(gè)酶的基因全部連接到大腸桿菌表達(dá)載體pTricHis2B上轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3);得到的陽(yáng)性克隆培養(yǎng)至OD600為0.6?0.8，加IPTG終濃度為0.5mmol，20°C培養(yǎng)12?18小時(shí)獲得。
[0046]實(shí)施例1
[0047](1)取100ml表達(dá)上述五個(gè)酶的大腸桿菌培養(yǎng)液7000rpm, 4°C離心5min，棄上清液，用50mM、PH 7.4磷酸鹽buffer洗滌兩次，最后使用5ml磷酸鹽buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz，150w)，破碎后15000rpm 4°C離心5min，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測(cè)定蛋白含量。
[0048](2)為考察各酶在催化反應(yīng)中的作用強(qiáng)度，將步驟(1)所得到的磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、異戊二烯合成酶濃度固定為120 μ g/L,只改變甲羥戊酸酶的用量，其濃度分別為ο μ g/L,62.5 μ g/L,80 μ g/L、100 μ g/L、120 μ g/LU40 μ g/LU60 μ g/L,做六個(gè)反應(yīng)，最終反應(yīng)體系為:50mM磷酸鹽buffer，4mM ATP,30mMKCl，8mM MgC12,0.2mM MnC12,0.0lmM ZnS04，4mM β -巰基乙醇，2.5mM 甲羥戊酸。
[0049](3)將步驟⑵混合液加至10ml厭氧反應(yīng)瓶中，設(shè)計(jì)1ML反應(yīng)體系，用水補(bǔ)齊，用密封塞封口，室溫靜置反應(yīng)120min。GC檢測(cè)異戊二烯，如圖1所示。最終異戊二烯濃度與酶增加量之間的趨勢(shì)關(guān)系如圖2所示，隨著甲羥戊酸激酶的增加，其異戊二烯的產(chǎn)量增加幅度較大。
[0050]實(shí)施例2
[0051](1)取100ml表達(dá)上述五個(gè)酶的大腸桿菌培養(yǎng)液7000rpm, 4°C離心5min，棄上清液，用50mM、PH 7.4磷酸鹽buffer洗滌兩次，最后使用5ml磷酸鹽buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz，150w)，破碎后15000rpm 4°C離心5min，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測(cè)定蛋白含量。
[0052](2)為考察各酶在催化反應(yīng)中的作用強(qiáng)度，將步驟⑴所得到的甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、異戊二烯合成酶濃度固定為120 μ g/L，只改變磷酸甲輕戊酸酶的用量，其濃度分別為ο μ g/L、62.5 μ g/L、80 μ g/L、100 μ g/L、120 μ g/LU40 μ g/LU60 μ g/L,做六個(gè)反應(yīng)，最終反應(yīng)體系為:50mM磷酸鹽buffer，4mM ATP,30mMKCl，8mM MgC12,0.2mM MnC12,0.0lmM ZnS04，4mM β -巰基乙醇，2.5mM 甲羥戊酸。
[0053](3)將步驟⑵混合液加至10ml厭氧反應(yīng)瓶中，設(shè)計(jì)1ML反應(yīng)體系，用水補(bǔ)齊，用密封塞封口，室溫靜置反應(yīng)120min。GC檢測(cè)異戊二烯。最終異戊二烯濃度與酶增加量之間的趨勢(shì)關(guān)系如圖2所示，隨著磷酸甲羥戊酸激酶的增加，其異戊二烯的產(chǎn)量隨著酶量的增加而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。
[0054]實(shí)施例3
[0055](1)取100ml表達(dá)上述五個(gè)酶的大腸桿菌培養(yǎng)液7000rpm, 4°C離心5min，棄上清液，用50mM、PH 7.4磷酸鹽buffer洗滌兩次，最后使用5ml磷酸鹽buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz，150w)，破碎后15000rpm 4°C離心5min，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測(cè)定蛋白含量。
[0056](2)為考察各酶在催化反應(yīng)中的作用強(qiáng)度，將步驟(1)所得到的甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、異戊二烯合成酶濃度固定為120 μ g/L，只改變甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的用量，其濃度分別為ο μ g/L,62.5 μ g/L,80 μ g/L、100 μ g/L、120 μ g/LU40 μ g/LU60 μ g/L,做六個(gè)反應(yīng)，最終反應(yīng)體系為:50mM磷酸鹽buffer，4mM ATP,30mMKCl，8mM MgC12,0.2mM MnC12,0.0lmM ZnS04，4mM β -巰基乙醇，2.5mM 甲羥戊酸。
[0057](3)將步驟⑵混合液加至10ml厭氧反應(yīng)瓶中，設(shè)計(jì)1ML反應(yīng)體系，用水補(bǔ)齊，用密封塞封口，室溫靜置反應(yīng)120min。GC檢測(cè)異戊二烯。異戊二烯濃度與酶增加量之間的趨勢(shì)關(guān)系如圖2所示，隨著甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的增加，其異戊二烯的產(chǎn)量變化不大。
[0058]實(shí)施例4
[0059]1)取100ml表達(dá)上述五個(gè)酶的大腸桿菌培養(yǎng)液7000rpm, 4°C離心5min，棄上清液，用50mM、PH 7.4磷酸鹽buffer洗滌兩次，最后使用5ml磷酸鹽buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz，150w)，破碎后15000rpm 4°C離心5min，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測(cè)定蛋白含量。
[0060](2)為考察各酶在催化反應(yīng)中的作用強(qiáng)度，將步驟(1)所得到的甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、異戊二烯合成酶濃度固定為120 μ g/L，只改變異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶的用量，其濃度分別為ο μ g/L,62.5 μ g/L,80 μ g/L、100 μ g/L、120 μ g/LU40 μ g/LU60 μ g/L,做六個(gè)反應(yīng)，最終反應(yīng)體系為:50mM磷酸鹽buffer，4mM ATP,30mMKCl，8mM MgC12,0.2mM MnC12,0.0lmM ZnS04，4mM β -巰基乙醇，2.5mM 甲羥戊酸。
[0061](3)將步驟⑵混合液加至10ml厭氧反應(yīng)瓶中，設(shè)計(jì)1ML反應(yīng)體系，用水補(bǔ)齊，用密封塞封口，室溫靜置反應(yīng)120min。GC檢測(cè)異戊二烯。異戊二烯濃度與酶增加量之間的趨勢(shì)關(guān)系如圖2所示，隨著異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶的增加，其異戊二烯的產(chǎn)量變化不大。
[0062]實(shí)施例5
[0063]1)取100ml表達(dá)上述五個(gè)酶的大腸桿菌培養(yǎng)液7000rpm, 4°C離心5min，棄上清液，用50mM、PH 7.4磷酸鹽buffer洗滌兩次，最后使用5ml磷酸鹽buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz，150w)，破碎后15000rpm 4°C離心5min，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測(cè)定蛋白含量。
[0064](2)為考察各酶在催化反應(yīng)中的作用強(qiáng)度，將步驟(1)所得到的甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶濃度固定為120 μ g/L，只改變異戊二烯合成酶的用量，其濃度分別為ο μ g/L,62.5 μ g/L,80 μ g/L、100 μ g/L、120 μ g/LU40 μ g/LU60 μ g/L,做六個(gè)反應(yīng)，最終反應(yīng)體系為:50mM磷酸鹽buffer，4mM ATP,30mMKCl，8mM MgC12，0.2mM MnC12,0.0lmM ZnS04，4mM β -巰基乙醇，2.5mM 甲羥戊酸。(3)將步驟(2)混合液加至10ml厭氧反應(yīng)瓶中，設(shè)計(jì)1ML反應(yīng)體系，用水補(bǔ)齊，用密封塞封口，室溫靜置反應(yīng)120min。GC檢測(cè)異戊二烯。異戊二烯濃度與酶增加量之間的趨勢(shì)關(guān)系如圖2所示，隨著異戊二烯焦合成酶的增加，其異戊二烯的產(chǎn)量變化明顯。
[0065]實(shí)施例6
[0066](1)分取100ml表達(dá)上述五個(gè)酶的五個(gè)大腸桿菌培養(yǎng)液以及共表達(dá)五個(gè)酶的大腸桿菌培養(yǎng)液7000rpm, 4°C離心5min，棄上清液，用50mM、PH 7.4磷酸鹽buffer洗滌兩次，最后使用5ml磷酸鹽buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz, 150w)，破碎后15000rpm4°C離心5min，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10 %甘油，按試劑盒方法測(cè)定蛋白含量。
[0067](2)根據(jù)上述五個(gè)實(shí)施例中所是到的結(jié)果，確定體外反應(yīng)中五個(gè)酶的最佳用量:分別將步驟(1)中所得到的甲羥戊酸激酶160yg/L，磷酸甲羥戊酸激酶80yg/L，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶80 μ g/L,異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶60 μ g/L,異戊二烯合成酶160 μ g/L混合，加入相應(yīng)的反應(yīng)物質(zhì)。同時(shí)，根據(jù)步驟(1)中所得到的共表達(dá)五個(gè)酶的酶液1000 μ g/L，保證酶液過(guò)量，底物濃度與混合酶反應(yīng)中的相同。最終反應(yīng)體系為:50mM磷酸鹽buffer，4mMATP，30mM KCl，8mM MgCl2，0.2mM MnCl2,0.0lmM ZnS04，4mM β -巰基乙醇，2.5mM 甲羥戊酸。
[0068](3)將步驟(2)混合液加至10ml厭氧反應(yīng)瓶中，設(shè)計(jì)1ML反應(yīng)體系，用水補(bǔ)齊，用密封塞封口，室溫靜置反應(yīng)120min。GC檢測(cè)異戊二烯，五個(gè)酶定量加入時(shí)的產(chǎn)量為0.018g/L,而五個(gè)酶共表達(dá)時(shí)混合加入后異戊二烯產(chǎn)量?jī)H為0.0009g/Lo
[0069]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)五個(gè)酶用量進(jìn)行調(diào)控的反應(yīng)中異戊二烯產(chǎn)量較五個(gè)酶共表達(dá)后體外反應(yīng)所得異戊二烯產(chǎn)量提高約20倍。
[0070]雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種體外酶反應(yīng)生成異戊二烯的方法，其特征在于，將表達(dá)甲羥戊酸激酶基因，磷酸甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因和異戊二烯合成酶基因分別導(dǎo)入宿主菌，發(fā)酵培養(yǎng)所得的五種重組菌，再利用超聲波分別破碎菌體獲得粗酶液，混合五種粗酶液獲得反應(yīng)酶液，再向反應(yīng)酶液中加入反應(yīng)底物溶液后體外合成異戊二烯。
2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下: 1)將獲得的甲羥戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19、戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因IDII和異戊二烯合成酶基因Isps4分別構(gòu)建入宿主菌表達(dá)質(zhì)粒載體中，獲得五種重組質(zhì)粒； 2)將步驟I)所得的五種重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入宿主菌，獲得五種重組菌； 3)發(fā)酵培養(yǎng)步驟2)所得五種重組菌，分別表達(dá)甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶、戊烯焦磷酸異構(gòu)酶和異戊二烯合成酶； 4)收集步驟3)所培養(yǎng)的菌體，分別超聲破碎后，獲得五種粗酶液； 5)按比例混合步驟4)所得的五種粗酶液，獲得反應(yīng)酶液； 6)向步驟5)所得的反應(yīng)酶液中加入反應(yīng)底物溶液，混合均勻后獲得混合反應(yīng)液； 7)將步驟6)所得的混合反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至厭氧反應(yīng)瓶中，補(bǔ)水后密封，在室溫下靜置反應(yīng)120min，獲得異戊二烯溶液。
3.權(quán)利要求1和2所述方法，其特征在于，所述甲羥戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因IDII，來(lái)源于糞腸球菌、釀酒酵母、金黃色葡萄球菌或肺炎雙球菌；所述異戊二烯合成酶基因Isps4，來(lái)源于葛根或柏楊。
4.權(quán)利要求1和2所述方法，其特征在于，所述甲羥戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登錄號(hào)為855248 ;所述磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登錄號(hào)為855260 ;所述甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19，GeneBank登錄號(hào)為100195467 ;所述異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因IDII，GeneBank登錄號(hào)為855986 ;所述異戊二稀合成酶Isps4，GeneBank登錄號(hào)為AB198180。
5.權(quán)利要求1和2所述方法，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌、釀酒酵母或枯草芽孢桿菌。
6.權(quán)利要求1和2所述方法，其特征在于，所述超聲破碎，超聲頻率為22kHz，超聲功率為150W，超聲時(shí)間為lOmin。
7.權(quán)利要求1和2所述方法，其特征在于，所述混合五種粗酶液，是調(diào)整甲羥戊酸激酶的濃度至60-160 μ g/L ;磷酸甲羥戊酸激酶60-160 μ g/L ;甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶60-160 μ g/L ;異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶60-160 μ g/L ;異戊二烯合成酶60-160 μ g/L。
8.權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述混合五種粗酶液，是調(diào)整甲羥戊酸激酶的濃度至160 μ g/L，磷酸甲羥戊酸激酶80 μ g/L ;甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶80 μ g/L ;異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶60 μ g/L ;異戊二烯合成酶160 μ g/L O
9.權(quán)利要求1和2所述方法，其特征在于，所述反應(yīng)底物溶液，與粗酶液混合后最終濃度為 50mM 磷酸鹽緩沖溶液，4mM ATP，30mM KCl，8mM MgCl2,0.2mM MnCl2,0.0lmM ZnSO4,4mM0-巰基乙醇和2.5mM甲羥戊酸。
10.權(quán)利要求1-9所述方法，其特征在于，用于利用甲羥戊酸為底物或中間產(chǎn)物，體外酶反應(yīng)生產(chǎn)異戊二烯以及異戊二烯基單元合成的萜類(lèi)化合物。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK104480146SQ201410681473
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】咸漠, 程濤, 趙廣, 鄒慧斌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所