分子的糖基化的制作方法【專利摘要】本文描述的是可用于產(chǎn)生目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式的方法和遺傳工程化細(xì)胞。還描述用于治療多種病癥例如代謝紊亂的方法和N-糖基化改變的分子。【專利說明】分子的糖基化[0001]本申請是基于申請日為2008年4月3日，優(yōu)先權(quán)日:為2007年4月3日，申請?zhí)枮?00880018736.4(PCT/IB2008/001814)，發(fā)明名稱為："分子的糖基化"的專利申請的分案申請。【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0002]本發(fā)明涉及獲得糖基化的分子，特別是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子的方法。[0003]置量[0004]高效表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)大多數(shù)目前正在開發(fā)中的生物藥物（例如，重組蛋白）所需要的。許多這些生物藥物的生物學(xué)活性依賴于它們的修飾（例如，磷酸化或糖基化）。一種基于酵母的表達(dá)系統(tǒng)將遺傳操作和微生物發(fā)酵的簡易性與分泌和修飾蛋白的能力相結(jié)合。然而，酵母細(xì)胞中產(chǎn)生的重組糖蛋白主要展現(xiàn)為異質(zhì)性的高甘露糖和超甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)（high-mannoseandhyper-mannoseglycanstructures)，其可能對蛋白質(zhì)功能、下游加工和后續(xù)治療用途有害，特別是在糖基化扮演重要的生物學(xué)角色的情況下。[0005]概沭[0006]本發(fā)明至少部分基于：（a)發(fā)現(xiàn)解脂西洋蓍霉（YarrowiaIypolitica)細(xì)胞中的單個基因缺失（外部鏈延長（OuterCHainelongation)(OCHl)缺失）導(dǎo)致基本上均質(zhì)產(chǎn)生在Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖1)骨架上具有α-1，2_連接的甘露糖殘基的糖基化蛋白質(zhì)；(b)發(fā)現(xiàn)靶向解脂西洋蓍霉細(xì)胞（具有和不具有OCHl缺失的兩種細(xì)胞）ER的經(jīng)工程化的α-1，2-甘露糖苷酶的過表達(dá)導(dǎo)致基本上均質(zhì)產(chǎn)生具有Man5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)式IV;圖1)的糖基化蛋白；（c)發(fā)現(xiàn)使解脂西洋蓍霉細(xì)胞中天冬酰胺連接的糖基化3(ALG3)酶活性失活導(dǎo)致糖基化聚糖水平的高度增加；和（d)發(fā)現(xiàn)解脂西洋蓍霉細(xì)胞中解脂西洋蓍霉基因（MNM)的過表達(dá)導(dǎo)致α-1，2-連接的甘露糖殘基的超磷酸化（hyperphosphorylation)。如此，遺傳工程化的細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉（Yarrowialipolytica)、Arxulaadeninivorans，或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性酵母細(xì)胞）可以在產(chǎn)生如下目標(biāo)分子的方法中使用，所述目標(biāo)分子如與在未經(jīng)遺傳工程化的相同種類的細(xì)胞中產(chǎn)生的目標(biāo)分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。向患有代謝紊亂（例如，溶酶體IC積?。╨ysosomalstoragedisorder))的患者施用N-糖基化的目標(biāo)分子（例如，N-糖基化蛋白）已被證明可改善所述病癥的癥狀，所描述的方法和細(xì)胞可用于制備N-糖基化的目標(biāo)分子用于治療，包括但不限于，代謝紊亂，例如溶酶體貯積病。[0007]本發(fā)明還至少部分基于解脂西洋蓍霉和巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)HACl基因的剪接形式的發(fā)現(xiàn)。由HACl基因編碼的蛋白質(zhì)Haclp是轉(zhuǎn)錄激活因子，其通過與稱為未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答（UnfoldedProteinResponse)(UPR)元件的DNA序列基序結(jié)合而激活數(shù)個靶基因的轉(zhuǎn)錄。在Haclp靶基因之中包括編碼侶伴蛋白、折疊酶（foldase)和負(fù)責(zé)脂質(zhì)和肌醇代謝的蛋白質(zhì)的那些。由于經(jīng)剪接形式Haclp是比由未經(jīng)剪接的HAClmRNA所編碼的形式更強(qiáng)力的轉(zhuǎn)錄激活因子，所以Haclp轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)剪接形式的過表達(dá)能夠?qū)е绿烊缓彤愒吹鞍妆磉_(dá)水平的增加，以及在ER膜中的增加。由此，Haclp的經(jīng)剪接形式能夠用于在多種真核細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉或任何其它本文描述的酵母細(xì)胞）、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞（例如，哺乳動物細(xì)胞如人的細(xì)胞）中通過同時激活UPR和表達(dá)目標(biāo)分子來增加膜蛋白和分泌蛋白的產(chǎn)生。[0008]本發(fā)明還基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在解脂西洋蓍霉中表達(dá)時，麗Sl甘露糖苷酶的突變形式能夠?qū)an8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖4)、Man6GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式V;圖4)和Man7GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VI;圖4)。由此，表達(dá)甘露糖苷酶如MNSl的突變形式的遺傳工程化的真核細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉或任何其它本文描述的酵母細(xì)胞）、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞（例如，哺乳動物細(xì)胞如人的細(xì)胞））能夠在產(chǎn)生如下目標(biāo)分子的方法中使用，所述目標(biāo)如與在未經(jīng)遺傳工程化的相同種類的細(xì)胞中產(chǎn)生的目標(biāo)分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。因此，所描述的方法和細(xì)胞可用于制備N-糖基化的目標(biāo)分子用于治療，包括但不限于，代謝紊亂，例如溶酶體貯積?。ㄒ娤挛模?。[0009]在一個方面，本公開描述了產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法包括向細(xì)胞引入編碼目標(biāo)蛋白的核酸的步驟，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生N-糖基化形式改變的目標(biāo)蛋白，并且其中所述細(xì)胞是經(jīng)遺傳工程化而含有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞（或相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細(xì)胞）。所述方法也可包括提供經(jīng)遺傳工程化而含有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞（或相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細(xì)胞）的步驟。所述方法也可包括分離目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的步驟。[0010]在一些實施方案中，目標(biāo)蛋白可以是內(nèi)源蛋白或外源蛋白。目標(biāo)蛋白可以是哺乳動物蛋白如人的蛋白。目標(biāo)蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結(jié)合片段，或融合蛋白。融合蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細(xì)胞因子或趨化因子與抗體或其抗原結(jié)合片段的融合物。目標(biāo)蛋白可以是例如，與溶酶體貯積病（LSD)相關(guān)的蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白可以是例如，葡糖腦苷酯酶、半乳糖腦苷酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、α-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸醋酶Α、α-Ν-乙酰半乳糖胺酶（α-Ν-acteylgalactosaminidase)、天冬氨酰葡糖胺酶(aspartylglucosaminidase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸醋酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-D-葡糖醛酸酶（β-D-glucoronidase)、透明質(zhì)酸酶、α-L-甘露糖苷酶、α-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶（sphinogmyelinase)、硫酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。[0011]在一些實施方案中，改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖結(jié)構(gòu)如，例如，Man5GlcNAcrMan8GlcNAcpMan9GlcNAcrMan3GlcNAc2Xlc1Man5GlcNAc2Xlc2Man5GlcNAc20在一些實施方案中，改變的糖基化可以是，例如，Man5GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Man3GlcNAc2、Glc1Man5GlcNAc2NGlc2Man5GlcNAc20[0012]在一些實施方案中，目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式可以是均質(zhì)的或基本上均質(zhì)的。例如，含有改變的糖基化的改變的目標(biāo)分子的分?jǐn)?shù)可以是至少約20%，至少約30%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%，至少約90%，或至少約95%或更多。[0013]在一些實施方案中，細(xì)胞可以經(jīng)遺傳工程化而缺乏至少一種N-糖基化活性。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCHl活性、麗Sl活性或MNN9活性。[0014]在一些實施方案中，至少一種修飾可以是：(a)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因；(b)表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式；（c)引入或表達(dá)干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)的RNA分子；（d)表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)(例如ALG6或α-甘露糖苷酶（例如，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的α-甘露糖苷酶）。表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是由細(xì)胞中的內(nèi)源核酸編碼的蛋白質(zhì)。表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是最適pH在7.5以下的（例如，最適PH在5.1以下）的α-甘露糖苷酶。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是外源蛋白。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白（如人的蛋白）或低等真核生物的(例如，真菌、原生動物或錐蟲）蛋白。低等真核生物可以選自下組：布氏錐蟲（Typanosomabrucei)、哈茨木霉（Trichodermaharzianum)、曲霉（Aspergillus)，和任何其它本文描述的低等真核生物。[0015]在一些實施方案中，N-糖基化活性可以是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是ALG6或α-甘露糖苷酶。α-甘露糖苷酶可以靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是融合蛋白，其包含α-甘露糖苷酶多肽和HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留肽（HDELendoplasmicreticulumretentionpeptide)。[0016]在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質(zhì)。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，例如，但不限于，葡糖苷酶11(例如，葡糖苷酶II的α和β亞基之一或二者）或變聚糖酶（mutanase)。[0017]在一些實施方案中，細(xì)胞可以經(jīng)遺傳工程化而包含至少兩種經(jīng)修飾的N糖基化活性，例如任何本文描述的經(jīng)修飾的N-糖基化活性。所述至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。[0018]在一些實施方案中，細(xì)胞可以經(jīng)遺傳工程化而包含至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，例如任何本文描述的經(jīng)修飾的N-糖基化活性。所述至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。[0019]在一些實施方案中，細(xì)胞未經(jīng)遺傳工程化而缺乏OCHl活性。[0020]在一些實施方案中，修飾可以包含表達(dá)能夠影響目標(biāo)蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物活性的變體。所述能夠影響目標(biāo)蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物活性的變體可以是1剛4、？勵1或11剛6。在一些實施方案中，糖蛋白的至少約30%的甘露糖基殘基可以是磷酸化的。[0021]在一些實施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括對糖蛋白的額外加工。額外加工可以發(fā)生在體外或體內(nèi)。額外加工可以包括將異源模塊（moiety)添加到修飾的糖蛋白。異源模塊可以是聚合物或載體。額外加工可以包括對目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式酶處理或化學(xué)處理。例如，額外加工可以包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶處理目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。額外加工可以包括用氫氟酸處理目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。額外加工可以包括目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的磷酸化。[0022]在另一方面，本公開提供產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。本方法包括如下步驟：提供經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的真核細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞）；和向細(xì)胞引入編碼目標(biāo)蛋白的核酸，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生N-糖基化形式改變的目標(biāo)蛋白。[0023]在另一方面，本公開描述了產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法包括將目標(biāo)蛋白與從解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物接觸的步驟，所述解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中將目標(biāo)蛋白與所述細(xì)胞裂解物接觸導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。[0024]在又一方面，本公開描述產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括將目標(biāo)蛋白與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸的步驟，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)獲得自經(jīng)遺傳修飾而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞，并且其中將目標(biāo)分子與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。[0025]在另一方面，本公開提供N-糖基化改變的分離的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)由任一上述方法產(chǎn)生。[0026]在又一方面，本公開提供分離的經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞（或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細(xì)胞）。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCHl活性、麗Sl活性或MNN9活性。所述修飾可以是任何本文所述的那些修飾。例如，所述修飾可以包括：(a)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因；(b)表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式；（c)引入或表達(dá)干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)的RNA分子；或（d)表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是例如，ALG6。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白，例如人的蛋白。所述修飾也可以包括表達(dá)能夠促進(jìn)經(jīng)修飾糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)（例如，MNM或PN01)或其生物學(xué)活性的變體。[0027]在另一方面，本公開提供治療病癥的方法，所述病癥可以通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療。所述方法包括向受試者施用如下蛋白質(zhì)的步驟，所述蛋白質(zhì)可以通過上述任何方法獲得，其中所述受試者是患有或疑似患有可通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療的疾病的患者。所述方法也可以包括如下步驟：(a)提供受試者和/或（b)測定該受試者是否患有可以通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療的疾病。所述受試者可以是哺乳動物如人。所述病癥可以是例如，癌癥，免疫病癥（例如，炎性狀態(tài)）或代謝紊亂。代謝紊亂可以是任何本文描述的那些代謝紊亂，例如，溶酶體貯積?。↙SD)如高歇爾氏病(Gaucherdisease)、泰-沙二氏病（Tay-Sachsdisease)、旁姆普氏病（Pompedisease)、尼-皮二氏病（Niemann-Pickdisease)或法布里氏?。‵abrydisease)。所述蛋白質(zhì)可以是與LSD相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如，所述蛋白質(zhì)可以是，例如，葡糖腦苷酯酶、α-半乳糖苷酶。所述蛋白質(zhì)可以是，例如，a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶（hexosaminidase)、β-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸醋酶Β、芳基硫酸醋酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶（sphinogmyelinase)、硫醋酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。[0028]在另一方面，本公開提供解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞（或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細(xì)胞）的基本上純的培養(yǎng)物，其中大量細(xì)胞是經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾（例如任何本文所述的修飾）的N-糖基化活性的。所述細(xì)胞培養(yǎng)物可以包含一種或多種細(xì)胞亞群，各亞群包含不同的經(jīng)修飾的糖基化活性。[0029]在又一方面，本公開提供：（a)包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的分離的核苷酸序列；（b)包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%相同的序列的分離的核苷酸序列；或（c)由（a)或（b)的分離的核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施方案中，分離的核酸序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。[0030]在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有：(a)在高嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1或SEQIDN0:2的補(bǔ)體雜交的核苷酸序列；或（b)核苷酸序列的補(bǔ)體。[0031]在又一方面，本公開提供：(a)包含本文所示核酸序列中任一（或由其組成）的分離的核苷酸序列；(b)包含與本為所示的核酸序列中的任一至少80%相同的序列的分離的核苷酸序列；或（c)由（a)或（b)的分離的核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施方案中，所述分離的核酸序列是本文所示的核酸序列中的任一。[0032]在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有：(a)在高嚴(yán)緊條件下與本文所示核酸序列中任一的補(bǔ)體雜交的核苷酸序列；或（b)所述核苷酸序列的補(bǔ)體。[0033]在又一方面，本公開提供：(a)包含上述核酸序列中任一的載體或（b)含有（a)的載體的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。所述載體可以是表達(dá)載體。載體中的核酸序列可以與表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。[0034]在另一方面，本公開提供產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括在允許多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞中的任一種的步驟。所述方法也可包括如下步驟：在培養(yǎng)細(xì)胞之后，從細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離多肽。所述細(xì)胞可以是例如，含有包含上述核酸序列中任一的載體的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞。[0035]本文所述的目標(biāo)分子（例如，目標(biāo)蛋白）、具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)和N-糖基化改變的分子（統(tǒng)稱為"本發(fā)明的分子"）可以是，但不需要是分離的。術(shù)語"分離的"如應(yīng)用于任何本文所述的本發(fā)明的分子是指這樣的分子或其片段，其已經(jīng)從天然與其伴隨的成分（例如，蛋白質(zhì)或其它天然存在的生物分子或有機(jī)分子）分開或純化。應(yīng)理解的是重組分子（例如，重組蛋白）將總是"分離的"。通常，當(dāng)本發(fā)明的分子按重量占制備物中全部相同類型的分子的至少60%時，例如占樣品中全部相同類型的分子的60%時，則它是分離的。例如，當(dāng)糖基化改變的蛋白質(zhì)按重量占制備物或樣品中全部蛋白質(zhì)的至少60%時，它是分離的。在一些實施方案中，制備物中的本發(fā)明的分子按重量組成至少75%，至少90%，或至少99%的制備物中全部相同類型的分子。[0036]如用于本文，目標(biāo)分子的"改變的N-糖基化形式"是由經(jīng)遺傳工程化的宿主細(xì)胞(例如，解脂西洋蓍霉細(xì)胞、Arxulaadeninivorans細(xì)胞或另一相關(guān)的雙態(tài)性酵母細(xì)胞種類的細(xì)胞）產(chǎn)生的目標(biāo)分子的N-糖基化形式，其不同于未經(jīng)遺傳工程化的與經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞相同種類的細(xì)胞中產(chǎn)生的目標(biāo)分子的N-糖基化形式。由此，目標(biāo)分子的改變的糖基化形式可以是例如，非N-糖基化的目標(biāo)分子。此外，目標(biāo)分子的改變的糖基化形式可以是例如，一種或多種N-聯(lián)聚糖的磷酸化改變的目標(biāo)分子的形式。[0037]如用于本文，術(shù)語"其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細(xì)胞種類"是指與解脂西洋蓍霉和Arxulaadeninivorans相關(guān)的屬于雙足囊菌科（familyDipodascaceae)的酵母，例如Arxula、雙足囊菌屬（Dipodascus)(例如白色雙足囊菌（D.albidus)、大雙足囊菌(D.ingens)、或D.specifer)、半乳糖霉（Galactomyces)(例如里氏半乳糖霉（G.reesii)或大地半乳糖霉（G.geotrichum))、Sporopachyderma、射盾子囊霉屬（Stephanoascus)(例如，西非射盾子囊霉（S.ciferii))、擬威克酵母屬（Wickerhamiella)和接囊菌屬(Zygoascus)。具體而言，進(jìn)化枝Metchnikowia(例如，M.pulcherrima或M.agaves)和射盾子囊霉屬（通過分析菌種如Arxula(例如A.adeninivorans或A.terrestris)的26S-rDNA序列的D1/D2結(jié)構(gòu)域?qū)⒔庵餮筝槊贡环峙溆谄渲校┲械慕湍敢约耙恍┠钪榫鷮倬N（Candidaspecies)(例如，C.apicola，而非白念珠菌（C.albicans)、麥芽糖念珠菌(C.maltose)或熱帶念珠菌（C.tropicalis))〇[0038]"多肽"和"蛋白質(zhì)"可以互換使用并且意指任何肽連接的氨基酸鏈，無論其長度和翻譯后修飾。[0039]本公開還提供本文所述的野生型、全長、成熟"目標(biāo)蛋白"或"具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)"的（i)生物學(xué)活性變體和（ii)生物學(xué)活性片段或其生物學(xué)活性變體。全長、成熟、野生型蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的片段的生物學(xué)活性變體可以含有添加、缺失或取代。具有取代的蛋白質(zhì)將通常具有不多于50個（例如，不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50個）保守氨基酸取代。保守取代是用一種氨基酸取代另一種具有相似特征的氨基酸。保守取代包括在以下組內(nèi)的取代：纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非極性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的（堿性）氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。將上述極性、堿性或酸性組中的一個成員用相同組中的另一成員取代可認(rèn)為是保守取代。相反，非保守取代是用一種氨基酸取代另一種具有不相似的特征的氨基酸的取代。[0040]缺失變體可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個（兩個或更多個氨基酸的）氨基酸區(qū)段或不連續(xù)的單獨(dú)氨基酸。[0041]添加（添加變體）包括融合蛋白，所述融合蛋白含有：（a)全長、野生型、成熟多肽或其含有至少五個氨基酸的片段；和（b)內(nèi)部或末端（C或N)的無關(guān)的或異源的氨基酸序列。在這些融合蛋白的背景下，術(shù)語"異源氨基酸序列"是指除（a)之外的氨基酸序列。因此含有本文描述的肽和異源氨基酸序列的融合蛋白在序列上不對應(yīng)于天然存在的蛋白質(zhì)的全部或部分。例如，異源序列可以是用于重組蛋白的純化的序列（例如，F(xiàn)LAG、多組氨酸(例如，六組氨酸）、血凝素（hemagluttanin)(HA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP))。異源序列也可以是用作診斷或檢測標(biāo)志物的蛋白質(zhì)，例如，螢光素酶、綠色熒光蛋白（GFP)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)。在一些實施方案中，融合蛋白含有來自另一蛋白質(zhì)的信號序列。在某些宿主細(xì)胞（例如，酵母宿主細(xì)胞）中，目標(biāo)蛋白的表達(dá)和/或分泌可以通過使用異源信號序列增加。在一些實施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引發(fā)免疫應(yīng)答（例如，用于抗體生成；見下文）的載體（例如，KLH)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體保留信號。異源序列可以具有不同的長度，并且在一些情況下可以是比異源序列所附接的全長目標(biāo)蛋白更長的序列。[0042]"片段"如用于本文是指比全長、不成熟的蛋白質(zhì)短的多肽的區(qū)段。蛋白質(zhì)的片段可以具有末端（羧基或氨基末端）缺失和/或內(nèi)部缺失。通常，蛋白質(zhì)的片段的長度將是至少4個（例如，至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少15個、至少18個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個或至少100個或更多個）氨基酸。[0043]目標(biāo)蛋白或具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段或生物學(xué)活性變體具有野生型、全長、成熟蛋白質(zhì)的活性的至少25%(例如，至少：30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%，或100%或甚至更高）。在目標(biāo)蛋白的情況下，相關(guān)活性是目標(biāo)蛋白在經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞中經(jīng)歷改變的N-糖基化的能力。在具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的情況下，相關(guān)活性是N-糖基化活性。[0044]依賴于它們的預(yù)期用途，蛋白質(zhì)、其生物學(xué)活性片段或生物學(xué)活性變體可以是任何物種的，如，例如，真菌（包括酵母）、線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠（gerbil)、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人）。在一些實施方案中，生物學(xué)活性片段或生物學(xué)活性變體包括所述蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性片段。免疫原性片段是具有相關(guān)全長、未成熟蛋白質(zhì)在感興趣的動物中刺激免疫應(yīng)答（例如，抗體應(yīng)答或細(xì)胞免疫應(yīng)答）的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99·5%或100%或甚至更多）的片段。蛋白質(zhì)的抗原性片段是具有相關(guān)全長、未成熟的蛋白質(zhì)被對于所述蛋白質(zhì)特異性的抗體或?qū)τ谒龅鞍踪|(zhì)特異性的T細(xì)胞識別的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%或100%或甚至更多）的片段。[0045]"N-糖基化活性"如用于本文是指任何如下活性，S卩⑴能夠向目標(biāo)分子添加N-聯(lián)聚糖（即，寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性）；（ii)從目標(biāo)分子去除N-聯(lián)聚糖，（iii)修飾目標(biāo)分子上的一個或多個N-聯(lián)聚糖，（iv)修飾多萜醇連接的寡糖；或（V)能夠輔助（i-iv)之內(nèi)的活性的活性。同樣，N-糖基化活性包括，例如，N-糖苷酶活性、糖苷酶活性、糖基轉(zhuǎn)移酶活性、糖核苷酸合成、修飾或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。對目標(biāo)分子上一種或多種N-聯(lián)聚糖的修飾包括甘露糖基磷酰基轉(zhuǎn)移酶（mannosylphosphoryltransferase)活性、激酶活性或磷酸酶活性，例如，改變目標(biāo)分子上N-聯(lián)聚糖的磷酸化狀態(tài)的甘露糖基磷?；D(zhuǎn)移酶、激酶或磷酸酶活性。[0046]如用于本文，"遺傳工程化"細(xì)胞或"經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞"和類似術(shù)語是指任何人工創(chuàng)造的細(xì)胞的遺傳改變，其導(dǎo)致與未經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞例如解脂西洋蓍霉細(xì)胞、Arxulaadeninivorans細(xì)胞或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細(xì)胞，植物細(xì)胞或動物細(xì)胞（例如，哺乳動物細(xì)胞例如人的細(xì)胞））相比細(xì)胞中的至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。由此，應(yīng)該理解的是人工創(chuàng)造的遺傳改變不包括，例如，自發(fā)突變。人工遺傳改變的實例在下文描述（參見"遺傳工程化的細(xì)胞"）。[0047]如用于本文，術(shù)語"野生型"如應(yīng)用于核酸或多肽是指當(dāng)生物學(xué)生物體存在于自然界中時分別在該生物學(xué)生物體中存在的或由所述生物學(xué)生物體產(chǎn)生的核酸或多肽。[0048]術(shù)語"異源"如在本文中應(yīng)用于宿主細(xì)胞中的核酸或由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽是指并非源自與宿主細(xì)胞相同種類的細(xì)胞的核酸或多肽（例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)）。因此，如用于本文，"同源"核酸或蛋白質(zhì)是在與宿主細(xì)胞相同種類的細(xì)胞中存在的或由與宿主細(xì)胞相同種類的細(xì)胞產(chǎn)生的那些。[0049]術(shù)語"外源"如用于本文與核酸和特定宿主細(xì)胞有關(guān)時是指不存在于（并且不能獲得自）在自然界中存在的所述特定細(xì)胞的任何核酸。因此，非天然存在的核酸一旦引入宿主細(xì)胞則被認(rèn)為對于所述宿主細(xì)胞是外源的。重要的是應(yīng)注意非天然存在的核酸可以含有在自然界中存在的核酸序列的核酸亞序列或片段，條件是所述核酸作為整體不存在于自然界中。例如，在表達(dá)載體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且因此一旦引入宿主細(xì)胞則對所述宿主細(xì)胞是外源的，因為該核酸分子作為整體（基因組DNA加上載體DNA)不存在于自然界中。因此，作為一個整體在自然界中不存在的任何載體、自復(fù)制質(zhì)?；虿《荆ɡ纾孓D(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰瘆病毒）被認(rèn)為是非天然存在的核酸。由此推斷通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理的基因組DNA片段以及cDNA被認(rèn)為是非天然存在的核酸，因為它們作為在自然界中不存在的單獨(dú)的分子而存在。還由此推斷以自然界中不存在的排列含有啟動子序列和多肽編碼序列的任何核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸對于特定細(xì)胞可以是外源的。例如，從酵母X的細(xì)胞分離的完整染色體一旦引入酵母y的細(xì)胞則該染色體對于酵母y的細(xì)胞是外源核酸。[0050]從上文將顯而易見的是，"外源"核酸可以是"同源"或"異源"核酸。相反，術(shù)語"內(nèi)源"如用于本文與核酸或基因（或由所述核酸或基因編碼的蛋白質(zhì)）以及特定細(xì)胞有關(guān)時是指確實存在于（并且可以獲得自）在自然界中存在的所述特定細(xì)胞中。[0051]作為對上述概念的示例，轉(zhuǎn)化入解脂西洋蓍霉細(xì)胞中的編碼解脂西洋蓍霉ALG6蛋白的表達(dá)質(zhì)粒相對于該細(xì)胞而言是外源核酸。然而，編碼ALG6蛋白的序列和由其產(chǎn)生的ALG6蛋白與所述細(xì)胞是同源的。類似地，轉(zhuǎn)化入解脂西洋蓍霉細(xì)胞中的編碼ArxulaadeninivoransALG6蛋白的表達(dá)質(zhì)粒相對于該細(xì)胞而言是外源核酸。然而與前一例子相反，編碼所述ALG6蛋白的序列和由其產(chǎn)生的ALG6蛋白與所述細(xì)胞是異源的。[0052]如用于本文，"啟動子"是指使基因能夠被轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子由RNA聚合酶識別，然后起始轉(zhuǎn)錄。因此，啟動子含有或者直接通過RNA聚合酶的募集結(jié)合的或在RNA聚合酶的募集中涉及的DNA序列。啟動子序列也可以包括"增強(qiáng)子區(qū)"，其是能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合以增強(qiáng)基因簇中基因的轉(zhuǎn)錄水平（因此得名）的一個或多個DNA區(qū)（S卩，反式作用因子，更像一組轉(zhuǎn)錄因子）。所述增強(qiáng)子盡管通常在編碼區(qū)的5'端，但是也可以與啟動子序列分開，并且可以例如在基因內(nèi)含子區(qū)內(nèi)或在基因編碼區(qū)的3'。[0053]如用于本文，"可操作地連接"是指并入遺傳構(gòu)建體從而表達(dá)調(diào)控序列有效地調(diào)控感興趣的編碼序列的表達(dá)。[0054]本文描述的任何核酸序列的變體（例如，SEQIDNO:1或SEQIDN0:2中所示的HACl序列）可以具有與野生型核酸序列同源的序列，例如，與野生型核酸序列為至少約70%(例如，至少約75%，至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%或至少約99%)同源（相同）的序列。這樣的野生型序列可以分離自自然界或者可以通過重組或合成方法產(chǎn)生。由此野生型序列核酸可以具有天然存在的人的核酸序列、猴核酸序列、鼠類核酸序列或任何其它含有所述感興趣野生型核酸的同源物的物種的核酸序列。如用于本文，"同源"或"同源核酸序列"或類似術(shù)語是指如下序列，其特征在于在核苷酸水平的至少指定百分比的同源性，并且可與序列同一性互換使用。[0055]百分比同源性或同一性可以如下測定，例如通過Gap程序（WisconsinSequenceAnalysisPackage,用于UNIX的第八版，GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,Madison,WI)，使用缺省設(shè)定，其使用Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482-489)的算法。在一些實施方案中，探針和靶（見下文）之間的同源性在約50%至約60%之間。在一些實施方案中，探針和靶核酸之間的同源性是大約55%-65%，65%-75%，約70%-80%，約75%-85%，約80%-90%，約85%-95%或約90%-100%。[0056]術(shù)語"探針"如用于本文是指長度可變的核酸序列。在一些實施方案中，探針包含至少10個并且多如6,000個核苷酸序列。在一些實施方案中，探針包含至少12個，至少14個，至少16個，至少18個，至少20個，至少25個，至少50個或至少75個或100個連續(xù)核苷酸。較長長度的探針通常獲得自天然或重組的來源（與直接的化學(xué)合成相反），對于靶序列是高特異性的，并且與較長的寡聚物相比與靶雜交慢得多。探針可以是單鏈或雙鏈核酸分子。[0057]在一些實施方案中，本文描述的變體核酸可以具有如下序列，所述序列包含與感興趣的野生型核酸（例如，如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所示的HACl核酸序列）中的區(qū)域、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段具有部分互補(bǔ)性（例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補(bǔ)性）的單鏈或雙鏈。在一些實施方案中，感興趣的變體核酸序列可以具有如下序列，所述序列包含與野生型核酸序列中的區(qū)域、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段具有完全互補(bǔ)性（即，100%互補(bǔ)性）的單鏈或雙鏈。序列"互補(bǔ)性"是指特定含氮堿基之間由于它們的氫鍵鍵合特性（即，具有使反向平行雙鏈體能夠形成的堿基序列的兩條核酸鏈的性質(zhì)，其中腺嘌呤和尿嘧啶（或胸腺嘧啶，在DNA或經(jīng)修飾的RNA的情況下）彼此相反，而鳥嘌呤和胞嘧啶彼此相反）產(chǎn)生的化學(xué)親和力。如此，完全互補(bǔ)序列將是在核苷酸序列形成反向平行雙鏈體時具有完全的一對一堿基序列對應(yīng)性（即，腺嘌呤對尿嘧啶/胸腺嘧啶且鳥嘌呤對胞嘧啶）的兩個序列。[0058]雜交也可用作對兩個核酸序列之間同源性的測量。本文描述的核酸序列，或其片段或變體，可以用作依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)的雜交探針。感興趣的特定探針（例如，HACl核苷酸序列的探針，例如，如SEQIDN0S:1或2中所示的HACl核苷酸序列）與來自試驗來源(例如，真核細(xì)胞）的DNA或RNA的雜交表明對在試驗來源中對應(yīng)于所述探針的DNA或RNA的存在（例如，HACl核苷酸序列）。雜交條件是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的，并且可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6,1991中找到。將中等雜交條件定義為等同于在2X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中在30°C雜交，之后在IXSSC、0.1%SDS中在50°C清洗。將高嚴(yán)緊性條件定義為等同于在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在45°C雜交，之后在0.2XSSC、0.1%SDS中在65°C清洗。[0059]除非另有限定，本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一個普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中可以使用與本文描述的那些相似的或等同的方法和材料，在下文將描述示例性的方法和材料。將本文提及的全部公開文獻(xiàn)、專利申請、專利、Genbank?登錄號和其它參考文獻(xiàn)通過所述整體并入。發(fā)生沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的本申請為準(zhǔn)。材料、方法和實例僅作為示例說明，而非意欲進(jìn)行限制。[0060]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢，例如，產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的方法，將從以下詳述并從權(quán)利要求書中清楚可見。[0061]附圖簡沐[0062]圖1是描述在酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的N-聚糖前體合成的示意圖。其所編碼的蛋白質(zhì)具有介導(dǎo)指明的酶促轉(zhuǎn)化的活性的基因在帶陰影的框中（例如，ALG7;左上）。"UDP"和"UMP"分別指二磷酸尿苷和一磷酸尿苷。"⑶P"和"GMP"分別指二磷酸鳥苷和一磷酸鳥苷。"Gn"是指N-乙酰葡糖胺。"Μ"是指單體甘露糖，G是指葡萄糖，Pi是指磷酸。[0063]圖2是描述酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N-聚糖加工的示意圖。[0064]圖3是描述釀酒酵母（S.cerevisiae)高爾基體中N-聚糖加工的示意圖。其編碼的蛋白質(zhì)具有介導(dǎo)指明的酶促轉(zhuǎn)化的活性的基因在帶陰影的框中（例如，OCHl;中上）。[0065]圖4是描述多種本文所述的N-聚糖結(jié)構(gòu)的示意圖。[0066]圖5是描述用于破壞解脂西洋蓍霉中OCHl基因的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。[0067]圖6是描述用于MNN9基因破壞片段的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。[0068]圖7是一系列描述獲得自野生型解脂西洋蓍霉細(xì)胞或糖基化突變體（例如，A〇chlcI9、Amnn91和AochlAmnn9)細(xì)胞和MTLY60菌株細(xì)胞的甘露糖蛋白的N-聚糖分析的電泳圖譜（electroferogram)。在一些情況下，將所述N-聚糖進(jìn)一步用α-1，2甘露糖苷酶處理。使用DNA測序儀輔助型、熒光團(tuán)輔助型糖電泳（DSA-FACE)來進(jìn)行分析。"Μ5"，"Μ6"，"Μ7"，"Μ8"，和"Μ9"是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合（conjugate)的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖（oligomaltose)的分析。[0069]圖8是描述用于釀酒酵母麗Sl表達(dá)載體的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。[0070]圖9是一系列描述對獲得自MTLY60細(xì)胞的分泌型糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜，所述細(xì)胞表達(dá)野生型（WT)Mnslp或所指明的Mnslp的多種突變形式（即，R273G、R273L或R269S/S272G/R273L)。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"，"M9"是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。[0071]圖10是描述用于MNM表達(dá)載體的克隆策略的示意圖。[0072]圖11是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細(xì)胞或糖基化突變細(xì)胞的分泌型糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"，"M9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。"P"是指含有一個磷酸殘基的甘露糖蛋白，而"PP"是指含有兩個磷酸殘基的甘露糖蛋白。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。[0073]圖12是描述用于α-半乳糖苷酶表達(dá)載體的克隆策略的示意圖。[0074]圖13是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細(xì)胞或糖基化突變細(xì)胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。"alg3"表明所述細(xì)胞是ALG3敲除型。"ALG6過表達(dá)"表明所述ALG6的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細(xì)胞中過表達(dá)。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過聚丙烯酰胺凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。[0075]圖14是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細(xì)胞或糖基化突變細(xì)胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。"alg3"表明所述細(xì)胞是ALG3敲除型。"ALG6過表達(dá)"表明所述ALG6的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細(xì)胞中過表達(dá)。一個峰與RNA酶B標(biāo)志物的]\&111561〇嫩(32運(yùn)行在相同位置，并且在α-1，2-甘露糖苷酶處理之后迀移了兩個葡萄糖單位，并在α-甘露糖苷酶（JB)消化之后迀移4個葡萄糖單位。這與預(yù)期的Man5GlcNAc2g構(gòu)相符。額外的兩個峰在約一個和兩個糖單位的距離運(yùn)行，并且不受a_l，2-甘露糖苷酶消化的影響。在a-甘露糖苷酶（JB)消化時兩個峰都迀移一個葡萄糖單位。小迀移是因為加入的酶（例如JB甘露糖苷酶）的較高的鹽濃度。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。[0076]圖15是對獲得自未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答（UPR)誘導(dǎo)的菌株解脂西洋蓍霉的分離的DNA片段（SEQIDΝΟ:1)序列與基因組HAC1DNA序列（SEQIDNO:5)的序列比對。帶框的序列對應(yīng)于非常規(guī)剪接的內(nèi)含子。[0077]圖16是一系列對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母的預(yù)測的5'（頂部）和3'（底部）剪接位點(diǎn)的序列比對。粗體加下劃線的核苷酸存在于環(huán)結(jié)構(gòu)中。[0078]圖17A和17B是對獲得自DTT-誘導(dǎo)型（I)(SEQIDNO:2)和非誘導(dǎo)型（NI)(SEQIDNO:6)巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物的HAClcDNA的序列比對的兩個部分視圖。[0079]圖18是對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母18個氨基酸的C-末端區(qū)域的序列比對。保守的氨基酸為粗體并加下劃線。[0080]圖19是描述對KAR2mRNA的相對表達(dá)水平進(jìn)行比較的柱狀圖。將克隆3、4和5(巴斯德畢赤酵母GSM5細(xì)胞）在作為碳源的甲醇上培養(yǎng)。"3+"、"4+"和"5+"是指在作為碳源的甲醇上培養(yǎng)的各個克隆，而"3-"、"4_"和"5-"是指在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)的各個克隆。Y軸代表使用實時PCR的KAR2基因的相對表達(dá)。[0081]圖20是描述兩種巴斯德畢赤酵母克?。寺?和8)中Kar2和HACl的相對表達(dá)水平的柱狀圖。"6+"和"8+"是指在作為碳源的甲醇上培養(yǎng)的各個克隆，而"6_"和"8-"是指在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)的各個克隆。Y軸代表使用實時PCR的KAR2基因的相對表達(dá)。[0082]圖21是描述用于ΠΜΝΝ6表達(dá)載體的克隆策略的示意圖。[0083]圖22是一系列描述對獲得自指明的單獨(dú)的Aochl解脂西洋蓍霉細(xì)胞，或表達(dá)ΠΜΝΝ6的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克?。?3、24、25、耶、服和現(xiàn)）的糖蛋白進(jìn)行的^聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。[0084]圖23是描述用于MFManHDEL表達(dá)載體的克隆策略的示意圖。[0085]圖24是一系列描述對獲得自指明的單獨(dú)的Aochl解脂西洋蓍霉細(xì)胞，或表達(dá)MFManHDEL的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克隆（9、11、10、3、5和6)的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。[0086]圖25是描述用于LIP2preManHDEL表達(dá)載體的克隆策略的示意圖。[0087]圖26是一系列描述對獲得自指明的單獨(dú)的Aochl解脂西洋蓍霉細(xì)胞，或表達(dá)LIP2ManHDEL的Λochl解脂西洋蓍霉的多種克?。╨、5、10和ll)的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。15"，16"，17"，18"和19"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。[0088]圖27A和27B是解脂西洋蓍霉（圖27A;SEQIDN0:3)和巴斯德畢赤酵母（圖27B;SEQIDNO:4)的HACl蛋白的氨基酸序列。[0089]圖28是考馬斯藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠的照片，其描述在多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（MTLY60、MTLY60Δalg3和MTLY60Δalg3ALG6)培養(yǎng)物中Lip2p過表達(dá)的結(jié)果。在凝膠中解析了以下樣品：泳道1("梯子"或"梯")，已知分子量的蛋白質(zhì)的組合；泳道2("WT")，獲得自過表達(dá)Lip2p的WT解脂西洋蓍霉細(xì)胞（MTLY60)的Lip2p蛋白；泳道3("WT+PGaseF"），獲得自過表達(dá)Lip2p的WT解脂西洋蓍霉細(xì)胞并用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道4("alg3-ALG6"），獲得自缺乏alg3并且過表達(dá)Lip2p和ALG6二者的西洋蓍霉細(xì)胞(MTLY60Δalg3ALG6)的Lip2p蛋白；泳道5("alg3-ALG6+PNGaseF"），獲得自缺乏alg3并且過表達(dá)Lip2p和ALG6二者的西洋蓍霉細(xì)胞（MTLY60Δalg3ALG6)并且用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道6("alg3")，獲得自缺乏alg3并且過表達(dá)Lip2p的解脂西洋蓍霉細(xì)胞（MTLY60Aalg3)的Lip2p蛋白；泳道7("alg3+PNGaseF")，獲得自缺乏alg3并且過表達(dá)Lip2p的解脂西洋蓍霉細(xì)胞（MTLY60Aalg3)并用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道8("無Lip2p過表達(dá)的WT"），獲得自MTLY60細(xì)胞的蛋白質(zhì)；和泳道9("無Lip2p過表達(dá)的WT+PNGaseF"），獲得自MTLY60細(xì)胞并用PNGaseF酶處理的蛋白質(zhì)。[0090]圖29是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（WT(MTLY60);Λalg3;AalgSALGe過表達(dá)的；和過表達(dá)ALG6連同來自解脂西洋蓍霉（Yl)或布氏錐蟲(Tb)的葡糖苷酶II的α亞基的Aalg3克隆）的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。15"，16"，17"，18"和19"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0091]圖30是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（Aalg3;Aalg3ALG6過表達(dá)的；和過表達(dá)ALG6連同含有HDEL序列的來自解脂西洋蓍霉（Yl)的葡糖苷酶II的α亞基的Λalg3克?。┑奶堑鞍走M(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。[0092]圖31是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（Aalg3;Aalg3ALG6過表達(dá)的；和過表達(dá)ALG6連同含有HDEL序列的來自布氏錐蟲（Trypanosomabrucei)(Tb)的葡糖苷酶II的α亞基的Aalg3克?。┑奶堑鞍走M(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。[0093]圖32是一系列描述對獲得自指明的用不同濃度變聚糖酶體外處理的alg3ALG6解脂西洋蓍霉細(xì)胞的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0094]圖33是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（Aalg3;Aalg3ALG6過表達(dá)的；和過表達(dá)ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調(diào)控下表達(dá)的來自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖苷酶Π的α亞基和來自Y.1的葡糖苷酶II的β亞基的Λalg3克?。┑奶堑鞍走M(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0095]圖34是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（Λalg3ALG6過表達(dá)的；和過表達(dá)ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調(diào)控下表達(dá)的含HDEL的來自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖苷酶Π的α亞基和來自Y.1的葡糖苷酶II的β亞基的Λalg3克?。┑奶堑鞍走M(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0096]圖35是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（Λalg3和過表達(dá)在TEF啟動子調(diào)控下表達(dá)的來自解脂西洋蓍霉（Y.1.)的葡糖苷酶II的α亞基和來自Y.1的葡糖苷酶II的β亞基的Aalg3克?。┑奶堑鞍走M(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0097]圖36A和36B描述的是編碼黑曲霉（Aspergillusniger)葡糖苷酶IIΦ成熟形式（缺少信號肽）的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQIDN0:7)。[0098]圖37是描述編碼黑曲霉（Aspergillusniger)葡糖苷酶IIβ成熟形式（缺少信號肽）的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQIDNO:8)〇[0099]圖38是一系列對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細(xì)胞（Aalg3和ALG6過表達(dá)的，連同在TEF或hp4d啟動子調(diào)控下表達(dá)的來自黑曲霉（An)的葡糖苷酶II的α亞基）的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0100]圖39Α和39Β是一對柱狀圖，其描述在WT(MTLY60)解脂西洋蓍霉細(xì)胞中或在含有在hp4d啟動子表達(dá)調(diào)控下的HAClcDNA的經(jīng)剪接形式的解脂西洋蓍霉細(xì)胞的兩個克隆（克隆7和克隆2)中，HACl(39A)或KAR(39B)基因的相對表達(dá)水平（Y軸）。[0101]圖40是線型圖，其描述用空載體轉(zhuǎn)化的野生型巴斯德畢赤酵母GSl15細(xì)胞與表達(dá)Haclp蛋白的巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞的生長相比的生長。[0102]圖41是考馬斯藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠的照片，其比較了來自表達(dá)鼠類IL-10(mIL-10)蛋白的巴斯德畢赤酵母GSl15細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物的mIL-10蛋白的表達(dá)水平與獲得自在誘導(dǎo)型啟動子AOXl調(diào)控下表達(dá)mIL-10和來自巴斯德畢赤酵母的經(jīng)剪接HACl蛋白的GS115細(xì)胞的培養(yǎng)物的mIL-10蛋白的表達(dá)。在凝膠中解析了以下樣品：泳道1("梯子"），已知分子量的蛋白質(zhì)的組合；泳道2("參照"），獲得自表達(dá)參照mIL-10的巴斯德畢赤酵母菌株（GS115)的蛋白質(zhì)；泳道3("參照")，獲得自表達(dá)參照mIL-10的巴斯德畢赤酵母菌株的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)；泳道4("克隆1")，獲得自誘導(dǎo)型表達(dá)HACl蛋白的表達(dá)mIL-10的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)；泳道5("克隆1")，獲得自誘導(dǎo)型表達(dá)HACl蛋白的表達(dá)mIL-10的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)；泳道6("克隆2"），獲得自誘導(dǎo)型表達(dá)HACl蛋白1的表達(dá)mIL-10的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)；泳道7("克隆2")，獲得自誘導(dǎo)型表達(dá)HACl蛋白的表達(dá)mIL-10的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)。[0103]圖42描述的是編碼里氏木霉（Trichodermareesei)α-1，2甘露糖苷酶、為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化、含有LIP2前信號序列的示例性cDNA序列的核苷酸序列（SEQIDΝ0:9)。[0104]圖43描述的是用于解脂西洋蓍霉的GAP啟動子的示例性核苷酸序列的核苷酸序列（SEQIDN0:10)。[0105]圖44A-44C描述的是用于表達(dá)載體pYLHUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:11)，其含有編碼里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。[0106]圖45A-45C描述的是用于表達(dá)載體pYLGUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:12)，其含有編碼里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。[0107]圖46A-46C描述的是用于表達(dá)載體pYLPUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:13)，其含有編碼里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。[0108]圖47A-47C描述的是用于表達(dá)載體pYLTUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:14)，其含有編碼里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。[0109]圖48是一系列對獲得自用指明的不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的解脂西洋蓍霉細(xì)胞的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜："hp4dL2ManHDEL"(pYLHUXdL2preManHDEL，圖44A-44C);"GAPL2ManHDEL"（pYLGUXdL2preManHDEL，圖45A-45C);"TEFlL2ManHDEL"（pYLTUXdL2preManHDEL，圖47A-47C)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的葡聚糖(dextran)的分析。系列中第二個電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0110]圖49是一系列對獲得自含有穩(wěn)定整合的表達(dá)載體pYLTUXdL2preManHDEL(圖47A-47C)的解脂西洋蓍霉MTLY60△ochl細(xì)胞的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析的電泳圖譜。糖蛋白樣品獲得自24、48、72和96小時的細(xì)胞培養(yǎng)物。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的葡聚糖（dextran)的分析。系列中第二個電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0111]圖50是用于人葡糖腦苷酯酶的示例性核酸序列（GLCM，SwissProt條目號：P04062;SEQIDNO:15)，其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA以化學(xué)方法合成的。[0112]圖51是免疫印跡的照片，其描述了在解脂西洋蓍霉菌株MTLY60(WT;泳道4和6)和MTLY60A〇chl(A〇chl;前三個泳道）中表達(dá)的人葡糖腦苷酯酶的迀移圖。蛋白質(zhì)的分子量（kDa)通過在所述免疫印跡最右側(cè)的分子量標(biāo)志物來說明。[0113]圖52是人促紅細(xì)胞生成素的示例性核酸序列（Epo,SwissProt條目號：P01588;SEQIDNO:16)，其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA以化學(xué)方法合成的。[0114]圖53是人α-半乳糖苷酶A的示例性核酸序列（AGAL，SwissProt條目號：P06280;SEQIDNO:17)，其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA以化學(xué)方法合成的。[0115]圖54是一系列過表達(dá)Haclp蛋白的經(jīng)剪接形式的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞或野生型巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的電子顯微照片。將細(xì)胞中堆疊的脂質(zhì)膜的離散區(qū)加框。[0116]圖55是一系列電泳圖譜，其描述對獲得自指明的WT解脂西洋蓍霉細(xì)胞（polld)和表達(dá)α-1，2-甘露糖苷酶和HDEL序列的融合蛋白的解脂西洋蓍霉細(xì)胞的糖蛋白進(jìn)行的N-聚糖分析。分析使用DSA-FACE進(jìn)行。"Μ5"，"Μ6"，"Μ7"，"Μ8"和"Μ9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對迀移率。頂部的電泳圖譜是對用作迀移率標(biāo)準(zhǔn)品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。[0117][0118]本文描述的方法和遺傳工程化的細(xì)胞可以用于產(chǎn)生如下目標(biāo)分子（例如，目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多萜醇），其與在未經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞中產(chǎn)生的所述目標(biāo)分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。已經(jīng)證明糖基化目標(biāo)分子（例如，糖基化蛋白）向患有代謝紊亂（例如，溶酶體貯積?。┗颊叩氖┯檬顾霾“Y的癥狀改善。因此，所述的方法和細(xì)胞可用于制備N-糖基化改變的目標(biāo)分子，其用于包括但不限于治療代謝紊亂如溶酶體貯積病。這樣的N-糖基化改變的分子也可用于廣泛多樣的其它領(lǐng)域，例如，食品和飲料工業(yè)；藥物工業(yè)（例如，作為疫苗）；農(nóng)業(yè)工業(yè)；和化學(xué)工業(yè)，等等。[0119]N-糖基化改奪的分子[0120]如用于本文，目標(biāo)分子是指通過來自遺傳工程化的細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞如解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans(或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性酵母）細(xì)胞；植物細(xì)胞；或動物細(xì)胞）的一種或多種N-糖基化活性而經(jīng)受改變的N-糖基化的任何分子。在一些實施方案中，目標(biāo)分子能夠被運(yùn)輸經(jīng)過解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans(或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性酵母）分泌途徑中的一步或多步，導(dǎo)致它們的N-糖基化因宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)(machinery)而改變。所述目標(biāo)分子可以是內(nèi)源或外源的。[0121]目標(biāo)蛋白、它們的生物學(xué)活性片段或其生物學(xué)活性變體可以包括如上所述含有添加、缺失或取代的蛋白質(zhì)。合適的目標(biāo)蛋白包括病原體蛋白（例如，破傷風(fēng)類毒素；白喉(diphtheria)類毒素；病毒表面蛋白（例如，巨細(xì)胞病毒（CMV)糖蛋白B、H和gCIII;人免疫缺陷病毒I(HIV-I)包膜糖蛋白；勞斯肉瘤病毒（RSV)包膜糖蛋白；單純皰瘆病毒（HSV)包膜糖蛋白；EB病毒（EBV)包膜糖蛋白；水痘帶狀皰瘆病毒（VZV)包膜糖蛋白；人乳頭狀瘤病毒（HPV)包膜糖蛋白；流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原），溶酶體蛋白（例如，葡糖腦苷酯酶、腦苷酶或半乳糖腦苷酯酶），胰島素，胰高血糖素，生長因子，細(xì)胞因子，趨化因子，抗體及其片段，或所述蛋白質(zhì)中任一與抗體或抗體片段的融合物（例如，蛋白質(zhì)-Fc)。生長因子包括，例如，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、胰島素樣生長因子（IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、神經(jīng)生長因子（NGF);神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、血小板衍生生長因子（PDGF)、促紅細(xì)胞生成素（EPO)、血小板生成素（TPO)、Myostatin(⑶F-8)、生長分化因子-9(⑶F9)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF或FGF2)、表皮生長因子（EGF)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)。細(xì)胞因子包括，例如，白介素（例如，IL-I至IL-33(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13或IL-15))。趨化因子包括，例如，1-309、TCA-3、MCP-1、MIP-Iα、MIP-Iβ、RANTES、C10、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-1γ、Eotaxin、MCP-5、MCP-4、NCC-1、Ckβ10、HCC-1、白細(xì)胞誘素-I(Leukotactin-I)、LEC、NCC-4、TARC、PARC或Eotaxin-2。還包括腫瘤糖蛋白（例如，腫瘤相關(guān)抗原），例如，癌胚抗原（CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu和前列腺特異性抗原（PSA)[R.A.Henderson和O.J.Finn,AdvancesinImmunology,62,第217-56頁（1996)]。在一些實施方案中，目標(biāo)蛋白可以是與溶酶體貯積病相關(guān)的目標(biāo)蛋白，所述目標(biāo)蛋白包括，例如，α-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。[0122]目標(biāo)蛋白也可以是融合蛋白。融合蛋白包括，例如，（i)本文描述的任何蛋白或其片段與（ii)抗體或其片段的融合物。如用于本文，術(shù)語"抗體片段"是指抗原結(jié)合片段，例如，F(xiàn)ab、F(ab'）2、Fv和單鏈Fv(scFv)片段。scFv片段是單一多肽鏈，其包括所述scFv所源自的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)二者。此外，雙抗體[Poljak(1994)Structure2(12):1121-1123;Hudson等（1999)J.Immunol.Methods23(1-2):177-189,將這兩篇的內(nèi)容通過所述整體并入本文]和細(xì)胞內(nèi)抗體[Huston等（2001)Hum.Antibodies10(3-4):127-142;Wheeler等（2003)Μ01·Ther.8(3):355-366;Stocks(2004)DrugDiscov.Today9(22):960-966,將全部這些的內(nèi)容通過所述整體并入本文]也可以在本發(fā)明的方法中使用。[0123]目標(biāo)蛋白也可以與聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測的（例如，熒光、發(fā)光或放射性）模塊中的一種或多種結(jié)合。例如，可以將目標(biāo)蛋白與聚乙二醇結(jié)合，所述聚合物模塊可以用于例如增加小蛋白質(zhì)的分子量和/或增加循環(huán)滯留期。[0124]在一些實施方案中，目標(biāo)分子可以是或可以含有多萜醇。[0125]遺傳工稈化的細(xì)朐[0126]本文描述的遺傳工程化的細(xì)胞具有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，所述細(xì)胞可用于一種或多種具有改變的N-糖基化形式的目標(biāo)分子的產(chǎn)生。適合于遺傳工程化的細(xì)胞包括，例如，真菌細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉或本文所述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細(xì)胞），植物細(xì)胞或動物細(xì)胞（例如，（線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人））。所述細(xì)胞可以是原代細(xì)胞、無限增殖化細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是動物中，例如非人哺乳動物中的那些細(xì)胞。這些細(xì)胞，在進(jìn)行本文指定的遺傳工程化之前，可以獲得自多種商業(yè)來源和研宄資源機(jī)構(gòu)，如，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection)(R〇ckVille，MD)。目標(biāo)分子包括蛋白質(zhì)，例如任何本文所述的目標(biāo)蛋白（見上文）。目標(biāo)分子也包括多貓醇。[0127]對細(xì)胞進(jìn)行的遺傳工程化包括遺傳修飾如：（i)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因；（ii)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)（例如，內(nèi)源或外源蛋白）的突變形式的重組核酸（即，表達(dá)具有N-糖基化活性的突變蛋白）引入或表達(dá)RNA分子，所述RNA分子干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)；（iv)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的野生型（例如，內(nèi)源的或外源的）的重組核酸（即，表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)）；或（V)改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的一種或多種內(nèi)源基因的啟動子或增強(qiáng)子元件，由此改變它們編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。RNA分子包括，例如，小干擾RNA、短發(fā)夾RNA(shRNA)、反義RNA或微小RNA(miRNA)。應(yīng)該理解的是，第（ii)項包括，例如，用相對于如下被替代的內(nèi)源基因編碼具有更大N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因替代內(nèi)源基因（例如，通過同源重組）。遺傳工程化還包括改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因以產(chǎn)生具有添加（例如，異源序列）、缺失或取代（例如，突變?nèi)琰c(diǎn)突變；保守或非保守突變）的蛋白質(zhì)。突變可以特異性地引入（例如，定點(diǎn)誘變或同源重組；參加隨附實施例）或者可以隨機(jī)引入（例如，可以對細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)誘變，如在例如Newman和Ferr〇-Novick(1987)J.CellBiol.105(4):1587中所述，將其公開內(nèi)容通過所述整體并入本文）。[0128]本文描述的遺傳修飾可以導(dǎo)致如下的一種或多種：（i)在經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中一種或多種N-糖基化活性的增加，（ii)在經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中一種或多種N-糖基化活性的減少，（iii)在經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中一種或多種N-糖基化活性的定位或胞內(nèi)分布的變化，或（iv)在經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中一種或多種N-糖基化活性的比例的變化。應(yīng)該理解的是，N-糖基化活性的量的增加可以歸因于一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的過表達(dá)；內(nèi)源基因的拷貝數(shù)的增加（例如，基因重復(fù)）；或內(nèi)源基因的啟動子或增強(qiáng)子的改變，其刺激由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)增加。一種或多種N-糖基化活性的減少可以歸因于一種或多種蛋白質(zhì)的突變形式（例如，顯性陰性形式）的過表達(dá)，所述突變形式具有改變N-糖基化的活性；一種或多種干擾RNA分子的引入或表達(dá)，所述干擾RNA分子降低一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)；或一種或多種編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因的缺失。[0129]缺失或破壞一種或多種內(nèi)源基因的方法在隨附實施例中描述。例如，為了通過同源重組破壞基因，"基因替代"載體可以以一種使其包括可選擇的標(biāo)記基因的方式構(gòu)建。這些可選擇的標(biāo)記基因可以在5'和3'端與長度足以介導(dǎo)同源重組的基因部分可操作地連接。所述可選擇的標(biāo)記可以是多種基因之一，所述基因或者補(bǔ)足宿主細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型(auxotrophy)，或者提供抗生素抗性，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合適的可選擇標(biāo)記包括CAT基因，其賦予酵母細(xì)胞氯霉素抗性，或IacZ基因，其導(dǎo)致因表達(dá)β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的藍(lán)色菌落。然后使用本領(lǐng)域公知的方法（見下文）將基因替代載體的線性化DNA片段引入細(xì)胞。線性片段向基因組中的整合和基因的破壞可以基于所述選擇標(biāo)記來測定，并且可以通過例如Southern印跡分析來驗證。[0130]如在隨附實施例中詳述的，在可選擇的標(biāo)記在選擇中使用之后，可以將其從宿主細(xì)胞的基因組去除，通過例如Cre-IoxP系統(tǒng)（見下文）。[0131]或者，基因替代載體可以以一種使其包括待破壞基因的部分的方式構(gòu)建，所述部分缺乏任何內(nèi)源基因啟動子序列并且什么也不編碼或編碼所述基因編碼序列的失活片段。"失活片段"是這樣的基因片段，其編碼的蛋白質(zhì)具有，例如，產(chǎn)自所述基因全長編碼序列的蛋白質(zhì)的活性的低于約10%(例如，低于約9%，低于約8%，低于約7%，低于約6%，低于約5%，低于約4%，低于約3%，低于約2%，低于約1%，或0%)。將這種基因部分以如下方式插入載體，即沒有已知啟動子序列與該基因序列可操作連接，但是終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止序列與所述基因序列的所述部分可操作地連接。然后可以將這種載體在所述基因序列的所述部分中線性化并且轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中。通過單同源重組的方式，于是將這種線性化的載體整合入所述基因的內(nèi)源對應(yīng)物（counterpart)中。[0132]表達(dá)載體可以是自主性的或整合型的。[0133]可以將重組核酸（例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的野生型或突變形式的重組核酸）以表達(dá)載體的形式引入細(xì)胞，所述表達(dá)載體例如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘?；虿《绢w粒。重組核酸可以保持在染色體外，或者它可以被整合入酵母細(xì)胞染色體DNA。表達(dá)載體可以含有選擇標(biāo)記基因，其編碼細(xì)胞在選擇條件下生存所需的蛋白質(zhì)（例如，URA3，其編碼尿嘧啶生物合成所需要的酶；或TRP1，其編碼色氨酸生物合成所需要的酶），以允許檢測和/或選擇那些用期望的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（參見，例如，美國專利No.4,704,362)。表達(dá)載體也可以包括自主復(fù)制序列（ARS)。例如，美國專利No.4,837,148描述了自主復(fù)制序列，其為在巴斯德畢赤酵母中保持質(zhì)粒提供了適合的方法。將美國專利No.4,837,148的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。[0134]整合型載體在例如美國專利No.4,882,279(將其公開內(nèi)容通過所述整體并入本文）中披露。整合型載體通常包括連續(xù)排列的至少有第一可插入DNA片段、可選擇的標(biāo)記基因和第二可插入DNA片段的序列。所述第一和第二可插入DNA片段的長度各為約200個(例如，約250,約300,約350,約400,約450,約500或約1000或更長）核苷酸并且具有與待轉(zhuǎn)化物種基因組DNA中的部分同源的核苷酸序列。將用于表達(dá)的含有感興趣的基因（例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因）的核苷酸序列插入這種載體的第一和第二可插入DNA片段之間，在標(biāo)記基因之前或是之后?？梢栽诮湍皋D(zhuǎn)化之前將整合型載體線性化以促進(jìn)感興趣的核苷酸序列整合入宿主細(xì)胞基因組。[0135]表達(dá)載體可以包含（feature)在酵母（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans，或其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母種）啟動子調(diào)控下的重組核酸，所述啟動子使得它們能夠在酵母中表達(dá)。合適的酵母啟動子包括例如，ADC1、TPI1、ADH2、hp4d、POX和GallO(參見，例如，Guarente等（1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(23):7410)啟動子。另外的合適啟動子在例如Zhu和Zhang(1999)Bioinformatics15(7-8):608-611和美國專利No.6,265,185中記載，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。在將表達(dá)載體引入動物細(xì)胞（例如哺乳動物細(xì)胞）的情況下，所述表達(dá)載體可以包含在適合用于在感興趣的宿主細(xì)胞中表達(dá)的動物細(xì)胞啟動子調(diào)控下的重組核酸。哺乳動物啟動子的實例包括，例如，SV40或巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動子。[0136]啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型（條件性）的。組成型啟動子應(yīng)理解為這樣的啟動子，其表達(dá)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下是恒定的。誘導(dǎo)型啟動子是響應(yīng)于一種或多種誘導(dǎo)信號(inductioncue)的啟動子。例如，可以對誘導(dǎo)型啟動子進(jìn)行化學(xué)調(diào)節(jié)（例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到化學(xué)誘導(dǎo)劑的存在或缺失調(diào)節(jié)的啟動子，所述化學(xué)誘導(dǎo)劑例如醇、四環(huán)素、類固醇、金屬或其它小分子）或物理調(diào)節(jié)（例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到物理誘導(dǎo)物的存在或缺失調(diào)節(jié)的啟動子，所述物理誘導(dǎo)物例如光或高溫或低溫）。誘導(dǎo)型啟動子也可以直接通過一種或多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，所述轉(zhuǎn)錄因子本身直接受到化學(xué)或物理信號的調(diào)節(jié)。[0137]細(xì)胞的遺傳工程化還包括激活存在于宿主細(xì)胞中，但是通常在所述細(xì)胞中不表達(dá)或在所述細(xì)胞中不以顯著水平表達(dá)的內(nèi)源基因（例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因）。例如，可以修飾內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)序列（例如，基因啟動子或增強(qiáng)子）從而使可操作連接的編碼序列展現(xiàn)增加的表達(dá)。同源重組和靶向可以用于使用如下調(diào)節(jié)序列替代通常與該基因結(jié)合的調(diào)節(jié)序列或使其失效，所述調(diào)節(jié)序列引起待表達(dá)基因以高于在相應(yīng)的未經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞中所顯現(xiàn)的水平表達(dá)，或引起所述基因展現(xiàn)不同于在相應(yīng)的未經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞中所顯現(xiàn)的調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)模式。用于引入基因的調(diào)節(jié)序列（例如，啟動子或增強(qiáng)子）的改變的合適方法記載著，例如，美國專利申請公開No.20030147868中，將其公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。[0138]應(yīng)理解的是，其它遺傳工程化的修飾也可以是條件性的。例如，可以將基因條件性地缺失，使用例如位點(diǎn)特異性DNA重組酶如Cre-IoxP系統(tǒng)（參見，例如，Gossen等（2002)Ann.Rev.Genetics36:153-173和美國申請No.20060014264,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述完整并入本文）。[0139]可以使用多種方法將重組核酸引入本文所述的細(xì)胞，所述方法例如原生質(zhì)球技術(shù)或全細(xì)胞氯化鋰酵母轉(zhuǎn)化方法。其它對于將質(zhì)粒或線性核酸載體轉(zhuǎn)化入細(xì)胞有用的方法記載在，例如，美國專利No.4,929,555;Hinnen等（1978)Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:1929;Ito等（1983)J.Bacteriol.153:163;美國專利No.4,879,231;和Sreekrishna等（1987)Gene59:115中，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。電穿孔和PEG1000全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法也可以使用，如Cregg和Russel,MethodsinMolecularBiology:PichiaProtocols，Chapter3，HumanaPress，Totowa，N.J·，第27-39頁（1998)中所述，將其公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以包括，例如，使用磷酸鈣、電穿孔、熱激、脂質(zhì)體或轉(zhuǎn)染試劑如FUGENE?或LIPOFECTAMINE?或通過使裸核酸載體與細(xì)胞在溶液中接觸（參見，例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManualSecondEditionvol.I,2and3.ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork,USA,Nov.1989;將其公開內(nèi)容通過所述完整并入本文）將載體引入細(xì)胞。[0140]可以通過使用合適的技術(shù)來選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，所述技術(shù)包括但不限于，在轉(zhuǎn)化之后在缺乏所需生化產(chǎn)物（由于細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型）條件下培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，選擇和檢測新的表型，或在對于缺乏轉(zhuǎn)化體中所含抗性基因的酵母為毒性的抗生素存在下進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化體也可以通過將表達(dá)盒整合入基因組來選擇和/或驗證，其可以通過例如Southern印跡或PCR分析來評定。[0141]在將載體引入感興趣的靶細(xì)胞之前，可以將載體在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌（E.coli)中培養(yǎng)（例如，擴(kuò)增）。載體DNA可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法從細(xì)菌細(xì)胞分離，所述方法致使載體DNA從細(xì)菌環(huán)境中純化。經(jīng)純化的載體DNA可以用酚、氯仿和醚粗提（extractextensively)，以確保沒有大腸桿菌蛋白存在于質(zhì)粒DNA制備物中，因為這些蛋白質(zhì)對于哺乳動物細(xì)胞是毒性的。[0142]如本文所述，遺傳工程化可以用于表達(dá)（例如，過表達(dá)）多種基因、向多種基因中引入修飾或缺失多種基因，例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因。這些基因包括，例如，ALG7、ALG13、ALG14、ALG1、ALG2、ALG11、RFT1、ALG3、ALG9、ALG12、ALG6、ALG8、ANLl、ALG10、ALG5、0ST3、0ST4、0ST6、STT3、OSTl、0ST5、WBPl、SWPl、0ST2、DPMI、SEC59、OCHl、MNN9、VANl、MNN8、MNN10、MNNll、HOCl、MNN2、MNN5、MNN6、KTRl、YURl、MNN4、KRE2、KTR2、KTR3、MNN1、MNS1、MNN4、PN01、MNN9、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、或內(nèi)切甘露糖苷酶（endomannosidase)。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以來自任何含有這樣的基因的物種（例如，低等真核生物（例如，真菌（包括酵母）或錐蟲），植物，或動物（例如，昆蟲、鳥、爬行動物或哺乳動物（例如，嚙齒動物如小鼠或大鼠、犬、貓、馬、山羊、牛、豬、非人靈長類動物或人））。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以從中獲得的示例性真菌菌種包括，但不限于，異常畢赤酵母（Pichiaanomala)、牛腸畢赤酵母（Pichiabovis)、加拿大畢赤酵母（Pichiacanadensis)、Pichiacarsonii、粉狀畢赤酵母（Pichiafarinose)、發(fā)酵畢赤酵母（Pichiafermentans)、泌液畢赤酵母(Pichiafluxuum)、膜醭畢赤酵母（Pichiamembranaefaciens)、膜醭畢赤酵母（Pichiamembranaefaciens)、粗壯念珠菌(Candidavalida)、白念珠菌(Candidaalbicans)、Candidaascalaphidarum、Candidaamphixiae、南極念珠菌（CandidaAntarctica)、大西洋念珠菌（Candidaatlantica)、Candidaatmosphaerica、Candidablattae、Candidacarpophila、Candidacerambycidarum、Candidachauliodes、Candidacorydalis、Candidadosseyi、都柏林念珠菌（Candidadubliniensis)'Candidaergatensis>Candidafructus、光滑念珠菌（Candidaglabrata)、發(fā)酵念珠菌（Candidafermentati)、季也蒙念珠菌（Candidaguilliermondii)、希木隆念珠菌（Candidahaemulonii)、Candidainsectamens、昆蟲念珠菌（Candidainsectorum)、間型念珠菌（Candidaintermedia)、Candidajeffresii、乳酒念珠菌（Candidakefyr)、克魯斯念珠菌（Candidakrusei)、葡萄牙念珠菌（Candidalusitaniae)、Candidalyxosophila、Candidamaltosa、酉業(yè)膜念珠菌（Candidamembranifaciens)、Candidamilleri、Candidaoleophila、奧里戈念珠菌（Candidaoregonensis)、近平滑念珠菌（Candidaparapsilosis)、桔念珠菌（Candidaquercitrusa)、休哈塔念珠菌（Candidashehatea)、Candidatemnochilae、纖細(xì)念珠菌(Candidatenuis)、熱帶念珠菌（Candidatropicalis)、Candidatsuchiyae、Candidasinolaborantium、醬油念珠菌（Candidasojae)、會隹國（Candidaviswanathii)、產(chǎn)朊念珠菌（Candidautilis)、膜醭畢赤酵母、（Pichiasilvestris)、膜醭畢赤酵母、Pichiachodati、膜醭畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、Pichiaminuscule、巴斯德畢赤酵母、假多形畢赤酵母（Pichiapseudopolymorpha)、櫟畢赤酵母（Pichiaquercuum)、Pichiarobertsii、齋藤畢赤酵母（Pichiasaitoi)、Pichiasilvestrisi、斯地畢赤酵母（Pichiastrasburgensis)、陸生畢赤酵母（Pichiaterricola)、Pichiavanriji、PseudozymaAntarctica、紅冬抱酵母（Rhodosporidiumtoruloides)、紅酵母（Rhodotorulaglutinis)、貝酵母（Saccharomycesbayanus)、貝酵母、Saccharomycesmomdshuricus、葡萄汁酵母（Saccharomycesuvarum)、貝酵母、釀酒酵母、二抱酵母（Saccharomycesbisporus)、薛瓦酵母（Saccharomyceschevalieri)、德爾布酵母（Saccharomycesdelbrueckii)、少抱酵母（Saccharomycesexiguous)、發(fā)酵性酵母（Saccharomycesfermentati)、脆壁酵母（Saccharomycesfragilis)、馬克思酵母（Saccharomycesmarxianus)、蜂蜜酵母（Saccharomycesmellis)、羅斯酵母（Saccharomycesrosei)、魯酵母（Saccharomycesrouxii)、葡萄汁酵母、威爾酵母（Saccharomyceswillianus)、路德酵母路德酵母、Saccharomycopsiscapsularis、扣囊復(fù)膜抱酵母（Saccharomycopsisfibuligera)、扣囊復(fù)膜抱酵母、大麥曲內(nèi)抱霉（Endomyceshordei)、Endomycopsisfobuligera、Saturnisporasaitoi、八抱裂殖酵母（Schizosaccharomycesoctosporus)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、西方許旺酵母（Schwanniomycesoccidentalis)、戴爾有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii)、戴爾有孢圓酵母、大連酵母（Saccharomycesdairensis)、戴爾有抱圓酵母、發(fā)酵有抱圓酵母（Torulasporafermentati)、發(fā)酵性酵母、戴爾有孢圓酵母、羅斯有孢圓酵母（Torulasporarosei)、羅斯酵母（Saccharomycesrosei)、戴爾有孢圓酵母、羅斯酵母、戴爾有孢圓酵母、德爾布酵母、戴爾有抱圓酵母、德爾布酵母、Zygosaccharomycesmongolicus、（Dorulasporaglobosa)、球形德巴利酵母（Debaryomycesglobosus)、圓球擬酵母（Torulopsisglobosa)、絲抱酵母（Trichosporoncutaneum)、三角酵母（Trigonopsisvariabilis)、加利福尼亞擬威爾酵母（Williopsiscalifornica)、擬威爾酵母（Williopsissaturnus)、二抱接合酵母(Zygosaccharomycesbisporus)、二抱接合酵母、(Debaryomycesdisporua)、二抱酵母、二抱接合酵母、二抱酵母、蜂蜜接合酵母（Zygosaccharomycesmellis)、Zygosaccharomycespriorianus、(Zygosaccharomycesrouxiim)、魯接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii)、(Zygosaccharomycesbarkeri)、魯酵母、魯接合酵母、大接合酵母（Zygosaccharomycesmajor)、魯酵母、異常畢赤酵母、牛腸畢赤酵母、加拿大畢赤酵母、Pichiacarsonii、粉狀畢赤酵母、發(fā)酵畢赤酵母、泌液畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、假多形畢赤酵母、櫟畢赤酵母、Pichiarobertsii、PseudozymaAntarctica、紅冬抱酵母、紅冬抱酵母、紅酵母、貝酵母、貝酵母、二孢酵母、釀酒酵母、薛瓦酵母、德爾布酵母、發(fā)酵性酵母、脆壁酵母、路德酵母、粟酒裂殖酵母、西方許旺酵母、戴爾有孢圓酵母、Torulasporaglobosa、三角酵母、力口利福尼亞擬威爾酵母、擬威爾酵母、二孢接合酵母、蜂蜜接合酵母、魯接合酵母或任何其它本領(lǐng)域已知的或本文描述的真菌（例如，酵母）。示例性低等真核生物還包括曲霉屬(Aspergillus)的多個種，包括但不限于，淺藍(lán)灰曲霉（Aspergilluscaesiellus)、亮白曲霉（Aspergilluscandidus)、肉色曲霉（Aspergilluscarneus)、棒曲霉（Aspergillusclavatus)、彎頭曲霉（Aspergillusdeflectus)、黃曲霉（Aspergillusflavus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、灰綠曲霉（Aspergillusglaucus)、構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉、赫曲霉（Aspergillusochraceus)、米曲霉（Aspergillusoryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、青霉?fàn)钋?Aspergilluspenicilloides)、局限曲霉（Aspergillusrestrictus)、醬油曲霉（Aspergillussojae)、聚多曲霉(Aspergillussydowi)、溜曲霉（Aspergillustamari)、土曲霉（Aspergillusterreus)、焦曲霉（Aspergillusustus)或雜色曲霉（Aspergillusversicolor)。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以從中獲得的示例性原蟲屬包括，但不限于，芽短膜蟲屬（Blastocrithidia)、短膜蟲屬（Crithidia)、腸錐蟲屬（Endotrypanum)、滴蟲屬（Herpetomonas)、利什曼原蟲屬（Leishmania)、細(xì)滴蟲屬（Leptomonas)、植生滴蟲屬（Phytomonas)、錐蟲屬（Trypanosoma)(例如，布氏錐蟲（T.bruceii)、岡比亞錐蟲(T.gambiense)、羅德西亞維蟲（T.rhodesiense)和克氏維蟲（T.cruzi))和Wallaceina。[0143]應(yīng)該理解的是，如本文所述，遺傳工程化可以用于表達(dá)（例如過表達(dá)）、引入修飾至、或缺失多種基因（例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因）和/或本文所述任何基因中一種或多種（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20種或更多種）的任意組合。[0144]在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞缺乏ALG3(Genbank?登錄號：XM_503488;GenolevuresRef:YALI0E03190g)基因或其基因產(chǎn)物（例如，mRNA或蛋白質(zhì)）。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞表達(dá)（例如過表達(dá)）ALG6(Genbank?登錄號：XM_502922,GenolevuresRef:YALI0D17028g)蛋白。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞表達(dá)MNM基因（Genbank?登錄號：XM_503217,GenolevuresRef:YALI0D24101g)。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞缺乏OCHl和/或MNN9基因或其基因產(chǎn)物（例如，mRNA或蛋白質(zhì)）。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞不缺乏OCHl基因或其基因產(chǎn)物（例如，mRNA或蛋白質(zhì)）。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞表達(dá)葡糖苷酶II的α或β亞基（或α和β亞基二者），所述葡糖苷酶II例如解脂西洋蓍霉或布氏錐蟲的葡糖苷酶II。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞表達(dá)變聚糖酶（mutantase)，例如哈茨木霉的變聚糖酶。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞可以具有這些修飾的任意組合。[0145]例如，在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞可以缺乏ALG3(例如，由Genbank?·登錄號：XM_503488,GenolevuresRef:YALI0E03190g示例的ALG3基因）基因或其基因產(chǎn)物（例如，mRNA或蛋白質(zhì)）；可以過表達(dá)ALG6(例如，如由Genbank?·登錄號：XM_502922,GenolevuresRef:YALI0D17028g示例的ALG6)蛋白；可以過表達(dá)葡糖苷酶Π(例如解脂西洋蓍霉、布氏錐蟲或任何其它本文所述的物種的葡糖苷酶II)的α和/或β亞基；可以過表達(dá)α-1,2-甘露糖苷酶；并且過表達(dá)如下中的一種或多種（和任意組合）：糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖-核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖-核苷酸修飾酶。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞不缺乏OCHl基因或其基因產(chǎn)物（例如，mRNA或蛋白質(zhì)）。[0146]在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞可以含有甘露糖苷酶活性（例如，α-甘露糖苷酶活性）。所述甘露糖苷酶活性可以靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。所述甘露糖苷酶可以具有至少7.5以下的最適pH(例如，至少7.4以下，至少7.3以下，至少7.2以下，至少7.1以下，至少7.0以下，至少6.9以下，至少6.8以下，至少6.7以下，至少6.6以下，至少6.5以下，至少6.4以下，至少6.3以下，至少6.2以下，至少6.1以下，至少6.0以下，至少5.9以下，至少5.8以下，至少5.7以下，至少5.6以下，至少5.5以下，至少5.4以下，至少5.3以下，至少5.2以下，至少5.1以下，至少5.0以下，至少4.9以下，至少4.8以下或至少4.7以下）。[0147]所述甘露糖苷酶可以是麗Sl。[0148]例如，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞可以過表達(dá)甘露糖苷酶（例如，α-1，2-甘露糖苷酶或任何其它本文所述的甘露糖苷酶），但是不缺乏OCHl基因或其基因產(chǎn)物（例如，mRNA或蛋白質(zhì)）。所述甘露糖苷酶可以是所述蛋白質(zhì)的野生型形式，或者可以是突變形式，例如含有甘露糖苷酶和HDELER-保留氨基酸序列的融合蛋白（參見實施例）。（應(yīng)該理解可以將任何具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白）。[0149]在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞可以含有能夠促進(jìn)目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式進(jìn)行甘露糖基磷酸化的活性。例如，可以將編碼促進(jìn)N-聚糖進(jìn)行磷酸化的活性的核酸（例如MNN4,MNN6,PN01)引入遺傳工程化的細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠增加目標(biāo)分子的N-糖基化的磷酸化。[0150]在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞可以含有能夠去除甘露糖殘基的活性（例如，甘露糖苷酶，如來自JackBean的甘露糖苷酶），所述甘露糖殘基遮蔽N-糖基化改變的分子的磷酸化。[0151]在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基。例如，所述經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞可以過表達(dá)具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，例如，但不限于，變聚糖酶或葡糖苷酶II(例如解脂西洋蓍霉、布氏錐蟲或本文所述的任何其它真菌菌種的葡糖苷酶II)的α和/或β亞基。[0152]在具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)源自與表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞不同類型（例如，不同種）的細(xì)胞的實施方案中，可以為了在特定的感興趣的細(xì)胞中表達(dá)而對編碼所述蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化。例如，可以對來自布氏錐蟲的編碼具有N-糖基化的蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在酵母細(xì)胞（例如解脂西洋蓍霉）中表達(dá)。這種密碼子優(yōu)化可以用于增加蛋白質(zhì)在感興趣的細(xì)胞中的表達(dá)。用于對編碼蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域已知的，并且記載在例如Gao等（Biotechnol.Prog.(2004)20(2):443-448)，Kotula等（Nat.Biotechn.(1991)9,1386-1389)和Bennetzen等（J.Biol.Chem.(1982)257(6):2036-3031)中。[0153]也可以對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化以主要產(chǎn)生作為哺乳動物（例如，人）糖基化途徑的中間體的N-聚糖。例如，可以將編碼具有N-糖基化活性的人的蛋白的一種或多種核酸引入細(xì)胞。在一些實施方案中，可以將人的蛋白引入細(xì)胞，并且可以抑制（例如，缺失或突變）一種或多種具有N-糖基化活性的內(nèi)源酵母蛋白。用于"人源化"真菌糖基化途徑的技術(shù)記載在，例如，Choi等（2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(9):5022-5027;Verveken等（2004)Appl.Environ.Microb.70(5):2639-2646;和Gerngross(2004)NatureBiotech.22(11):1410-1414中，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。[0154]在遺傳工程化涉及例如改變蛋白質(zhì)的表達(dá)或外源蛋白（包括內(nèi)源蛋白的突變形式）的表達(dá)的情況下，可以使用多種技術(shù)來測定經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞是否表達(dá)該蛋白質(zhì)。例如，編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA或蛋白質(zhì)本身的存在可以如下檢測，分別使用例如Northern印跡或RT-PCR分析或Western印跡分析。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位可以通過使用多種技術(shù)來分析，所述技術(shù)包括亞細(xì)胞分級和免疫熒光。[0155]另外的遺傳修飾和將它們引入本文描述的任何細(xì)胞的方法可以根據(jù)例如，美國專利Nos.7,029,872;5,272,070;和6,803,225;和美國專利申請公開Nos.20050265988、20050064539、20050170452和20040018588的公開內(nèi)容修改適用，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。[0156]盡管在雙態(tài)性酵母菌種中為了實現(xiàn)體內(nèi)產(chǎn)生Man5GlcNAcdPMan361〇嫩(：2而進(jìn)行的工程化步驟可能與在其它酵母菌種中進(jìn)行的工程化步驟不同，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚在雙態(tài)性酵母中體內(nèi)產(chǎn)生經(jīng)修飾的糖蛋白（具有Man5GlcNAcdPMan3GlcNAc2核心N-聚糖結(jié)構(gòu)）的工程化技術(shù)可以根據(jù)常規(guī)實驗法從包括但不限于美國專利No.7,326,681和美國公開Nos.20040018590、20060040353和20060286637(將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文）中公開方法修改獲得。由此可以將經(jīng)修改的方法用于實現(xiàn)糖蛋白的產(chǎn)生，所述糖蛋白經(jīng)修飾而具有人類型雜合和復(fù)合的N-聚糖。這些復(fù)合N-聚糖可以在上文指定的核心聚糖上具有2-5個以GIcNAc殘基起始的分支，其可以進(jìn)一步延伸，例如，用半乳糖、果糖、唾液酸殘基延伸。[0157]在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的突變蛋白或野生型蛋白可以從經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞中使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離。例如，在所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞中表達(dá)突變蛋白或野生型蛋白之后，可以從該細(xì)胞本身或從培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基分離所述蛋白質(zhì)。分離蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的并且包括，例如，液相層析（例如，HPLC)、親和層析（例如，金屬螯合或免疫親和層析）、離子交換層析、疏水相互作用層析、沉淀或差示溶解（differentialsolubilization)〇[0158]在一些實施方案中，可以將具有N-糖基化活性的分離的蛋白質(zhì)冷凍、凍干或固定，并且儲存在合適條件下，所述條件允許該蛋白質(zhì)保持活性。[0159]本公開還提供本文描述的任何經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物。如用于本文，經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞的"基本上純的培養(yǎng)物"是這樣的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中活細(xì)胞總數(shù)的低于約40%(即，低于約：35%;30%;25%;20%;15%;10%;5%;2%;1%;0.5%;0.25%;0.1%;0.01%;0.001%;0.0001%;或甚至更低）是除所述經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞之外的活細(xì)胞，例如，細(xì)菌、真菌（包括酵母）、支原體或原生動物細(xì)胞。術(shù)語"約"在本文上下文中指相關(guān)的百分比可以比指定百分比高或低所述指定百分比的15%。因此，例如，約20%可以是17%-23%。這樣的經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞的培養(yǎng)物包括細(xì)胞和培養(yǎng)、儲存或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是液體、半固體（例如，膠狀培養(yǎng)基）或是冷凍的。培養(yǎng)物包括培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中或培養(yǎng)在半固體培養(yǎng)基中/上的細(xì)胞、或儲存或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基（包括冷凍儲存或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基）中儲存或轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞。培養(yǎng)物可以在培養(yǎng)容器或儲存容器或基底(例如，培養(yǎng)皿、燒瓶或管或儲存小瓶或管）中。[0160]本文描述的經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞可以如下儲存，例如，作為冷凍細(xì)胞懸液，例如，在含有冷凍保護(hù)劑如甘油或蔗糖的緩沖劑中，作為凍干的細(xì)胞?；蛘?，它們可以例如作為干燥的細(xì)胞制備物儲存，通過例如流化床干燥或噴霧干燥，或任何其它合適的干燥方法。[0161]產(chǎn)牛N-糖基化改奪的分子的方法[0162]本文描述產(chǎn)生目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法通常涉及使目標(biāo)分子與來自經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文所述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細(xì)胞）、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞（例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物或哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人））的一種或多種N-糖基化活性接觸。所述方法可以是基于細(xì)胞的或不基于細(xì)胞的。[0163]基于細(xì)胞的方法可以包括向經(jīng)遺傳工程化而具有至少一種經(jīng)修飾N-糖基化活性的細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文所述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細(xì)胞）中引入編碼在該細(xì)胞中經(jīng)歷N-糖基化的目標(biāo)分子的核酸，其中所述細(xì)胞以改變的N-糖基化形式產(chǎn)生所述目標(biāo)分子。所述目標(biāo)分子可以是，例如，蛋白質(zhì)如任何本文所述的目標(biāo)蛋白。在目標(biāo)蛋白是脂質(zhì)的實施方案中，核酸可以是編碼一種或多種促進(jìn)脂質(zhì)合成的酶的核酸。[0164]通過對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化來產(chǎn)生的修飾的類型在本文描述（參見隨附實施例和上文的"遺傳工程化的細(xì)胞"）。[0165]用于引入核酸的方法是本領(lǐng)域已知的并且記載在隨附實施例和上文中。[0166]在遺傳工程化的細(xì)胞中引入或表達(dá)目標(biāo)分子（例如，目標(biāo)蛋白）可以導(dǎo)致運(yùn)輸目標(biāo)分子通過細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或高爾基體，由此產(chǎn)生目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式。[0167]在對目標(biāo)分子進(jìn)行加工之后（例如，在經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中），目標(biāo)分子（例如，目標(biāo)蛋白）的改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖結(jié)構(gòu)。例如，目標(biāo)分子的改變形式可以含有一種或多種特定的N-具體結(jié)構(gòu)如Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I或VII;圖4)，Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)，Man9GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式II;圖4)，Man3GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式XIV;圖4)，Glc1Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VIII;圖4)，或Glc2Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IX;圖4)("Man"是甘露糖；"Glc"是葡萄糖；而"GlcNAc"是N-乙酰葡糖胺）。[0168]產(chǎn)生自經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞的N-糖基化改變的目標(biāo)分子可以是均質(zhì)的（S卩，全部N-糖基化改變的分子含有相同的特定N-聚糖結(jié)構(gòu)）或者可以是基本上均質(zhì)的。"基本上均質(zhì)"是指改變的目標(biāo)分子是由經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞產(chǎn)生的改變N-糖基化的目標(biāo)分子的至少約25%(例如，至少約27%，至少約30%，至少約35%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%，至少約90%或至少約95%或至少約99%)。[0169]在經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞包括一種或多種影響N-聚糖磷酸化的N-糖基化活性的情況下，目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式可以具有至少約25%(例如，至少約27%，至少約30%，至少約35%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%或至少約80%)的它的甘露糖基殘基是磷酸化的。[0170]在遺傳工程化的細(xì)胞的任何遺傳修飾在誘導(dǎo)信號（例如，化學(xué)或物理信號）存在下為誘導(dǎo)型或條件性的情況下，可以任選地將所述遺傳工程化的細(xì)胞在引入核酸之前、過程中或之后在誘導(dǎo)劑存在下培養(yǎng)。例如，在引入編碼目標(biāo)蛋白的核酸之后，可以將所述細(xì)胞曝露于化學(xué)誘導(dǎo)劑，所述化學(xué)誘導(dǎo)劑能夠促進(jìn)一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)。在多種誘導(dǎo)信號誘導(dǎo)一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)條件性表達(dá)的情況下，可以使細(xì)胞與多種誘導(dǎo)信號接觸。[0171]在通過一種或多種N-糖基化活性加工之后，將改變的目標(biāo)分子分離。所述改變的目標(biāo)分子可以保持在酵母細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞裂解時釋放，或者所述改變的目標(biāo)分子可以經(jīng)由編碼序列（外源核酸所固有的或工程化至表達(dá)載體中的）提供的機(jī)制分泌至培養(yǎng)基中，所述編碼序列指導(dǎo)所述分子從細(xì)胞分泌。細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)基中改變的目標(biāo)分子的存在可以通過多種用于檢測分子存在的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來驗證。例如，在改變的目標(biāo)分子是蛋白質(zhì)的情況下，這樣的規(guī)程可以包括，但不限于，使用對于所述改變的目標(biāo)蛋白（或目標(biāo)蛋白本身）特異性的抗體進(jìn)行的免疫印跡或放射免疫沉淀，對于所述改變的目標(biāo)蛋白（或目標(biāo)蛋白本身）特異性的配體進(jìn)行的結(jié)合，或測試改變的目標(biāo)蛋白（或目標(biāo)蛋白本身）的特異性酶活性。[0172]在一些實施方案中，可以將分離的改變的目標(biāo)分子冷凍、凍干或固定，并且儲存在合適條件下，例如，所述條件允許改變的目標(biāo)分子保持生物學(xué)活性。[0173]可以對目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)加工（例如，在經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞中），或者可以在從經(jīng)遺傳工程化的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基分離之后進(jìn)行體外加工。進(jìn)一步加工可以包括對改變的目標(biāo)分子的一種或多種N-聚糖殘基的修飾或?qū)Ω淖兊哪繕?biāo)分子的N-聚糖殘基之外的修飾。改變的目標(biāo)分子的額外的加工可以包括添加（共價或非共價結(jié)合）異源模塊如聚合物或載體。進(jìn)一步的加工也可以包括對改變的目標(biāo)分子進(jìn)行的酶或化學(xué)處理。酶處理可以包括使改變的目標(biāo)分子與一種或多種糖苷酶（例如，甘露糖苷酶或甘露聚糖酶）、磷酸二酯酶、磷脂酶、糖基轉(zhuǎn)移酶或蛋白酶接觸足以誘導(dǎo)對所述改變的目標(biāo)分子的修飾的時間。酶處理也可以包括使所述改變的目標(biāo)分子與能夠從1&11561(：嫩(32去除一種或多種葡萄糖殘基的酶接觸，所述酶例如，但不限于，甘露糖苷酶或葡糖苷酶II的α和/或β亞基?；瘜W(xué)處理可以例如包括使改變的目標(biāo)分子與酸（例如氫氟酸）接觸足以誘導(dǎo)對所述改變的目標(biāo)分子的修飾的時間。特定條件下的氫氟酸處理特異性地去除與聚糖以磷酸二酯鍵連接的甘露糖殘基，同時在聚糖上保留磷酸。改變的目標(biāo)分子可以通過從一個或多個N-聚糖添加或去除磷酸基團(tuán)來進(jìn)一步加工。例如，可以使改變的目標(biāo)分子與甘露糖基激酶或甘露糖基磷酸酶接觸。[0174]在一些實施方案中，任何文描述的改變的目標(biāo)分子可以在分離之后與異源模塊附接，例如，使用酶或化學(xué)方法。"異源模塊"是指與改變的目標(biāo)分子結(jié)合（例如，共價或非共價）的任何成分，所述成分不同于原始存在于所述改變的目標(biāo)分子之上的成分。異源模塊包括，例如，聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測（例如，熒光、發(fā)光或放射性）的模塊在一些實施方案中，可以向改變的目標(biāo)分子添加額外的N-聚糖。[0175]應(yīng)該理解的是，可以，但不需要在遺傳工程化的細(xì)胞中加工目標(biāo)分子。例如，本公開還包括無細(xì)胞的產(chǎn)生具有改變的N-糖基化形式的目標(biāo)分子的方法，所述方法包括使目標(biāo)分子在N-糖基化條件下與制備自細(xì)胞（例如，真菌細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文描述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細(xì)胞）、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞（例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人））的細(xì)胞裂解物接觸的步驟，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而具有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中使目標(biāo)分子與所述細(xì)胞裂解物接觸產(chǎn)生目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式。[0176]"N-糖基化條件"是指將混合物（例如，目標(biāo)分子和細(xì)胞裂解物的混合物）在允許改變的N-糖基化的條件下溫育（如上所述）。[0177]用于獲得細(xì)胞裂解物（在所述裂解物中保留一種或多種N-糖基化活性的活性或完整性）的合適方法可以包括使用合適的緩沖液和/或抑制劑，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，其保護(hù)或最小化細(xì)胞裂解物中N-糖基化活性的改變。這些抑制劑包括，例如，螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA)、乙二醇雙（P-氨基乙醚）N，N，N1，Nl-四乙酸（EGTA)，蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟化物（PMSF)、抑肽酶、亮抑肽酶、抗痛素等，和磷酸酶抑制劑如磷酸鹽、氟化鈉、釩酸鹽等。抑制劑可以這樣選擇，即它們不干擾或僅最小程度負(fù)面影響N-糖基化活性或感興趣的活性。用于獲得含有酶活性的裂解物的合適的緩沖劑和條件記載在，例如，Ausubel等CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),Johnffiley&Sons,NewYork(1999);Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress(1988)；HarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1999)；TietzTextbookofClinicalChemistry,3rded.BurtisandAshwood,eds.ff.B.Saunders,Philadelphia,(1999)中。[0178]可以將細(xì)胞裂解物進(jìn)一步加工以使當(dāng)?shù)叵蜃钚』蓴_物質(zhì)的存在。如有需要，可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將細(xì)胞裂解物分級，所述方法包括亞細(xì)胞分級和層析技術(shù)，如離子交換、疏水和反向、大小排阻、親和、疏水電荷誘導(dǎo)層析等（參見，例如，Scopes,ProteinPurification!PrinciplesandPractice,thirdedition,Springer-Verlag,NewYork(1993)；Burton和Harding,J.Chromatogr.A814:71-81(1998))〇[0179]在一些實施方案中，可以制備細(xì)胞裂解物，其中全部細(xì)胞器保持完整和/或有功能。例如，裂解物可以含有完整的糖面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、完整的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或完整的尚爾基體中的一種或多種。用于制備含有完整的細(xì)胞器的裂解物和測試細(xì)胞器的功能性的合適方法記載在，例如，Moreau等（1991)J.Biol.Chem.266(7):4329-4333;Moreau等（1991)J.Biol.Chem.266(7):4322-4328;Rexach等（1991)J.CellBiol.114(2):219-229;和Paulik等(1999)Arch.Biochem.Biophys.367(2):265-273中；將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。[0180]本公開還提供產(chǎn)生具有改變的N-糖基化形式的目標(biāo)分子的方法，其包括使目標(biāo)分子在N-糖基化條件下與一種或多種具有N-糖基化活性的分離的蛋白質(zhì)接觸的步驟，其中使所述目標(biāo)分子與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸產(chǎn)生目標(biāo)分子的改變的N-糖基化形式，并且其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)制備自經(jīng)遺傳工程化而具有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的細(xì)胞（例如真菌細(xì)胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文描述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細(xì)胞）、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞（例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人））。[0181]可以使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)純化?？梢允鼓繕?biāo)分子與一種或多種蛋白質(zhì)在合適的緩沖液中接觸足以誘導(dǎo)對目標(biāo)分子的修飾的時間，如例如，Lee和Park(2002)30(6):716-720以及Fujita和Takegawa(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.282(3):678-682中所述，將所述公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。[0182]在一些實施方案中，可以使目標(biāo)分子僅與一種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸。在一些實施方案中，可以使目標(biāo)分子與超過一種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸。可以使目標(biāo)分子與超過一種蛋白質(zhì)同時或相繼接觸。在將目標(biāo)分子與超過一種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)相繼接觸的情況下，可以，但不需要，將目標(biāo)分子在一個或多個步驟之后純化。即，可以使目標(biāo)分子與蛋白活性A接觸，然后在將所述分子與蛋白活性B接觸之前進(jìn)行純化j等等。[0183]在無細(xì)胞方法的一些實施方案中，在使目標(biāo)分子與一種或多種N-糖基化活性接觸之前將目標(biāo)分子與固相支撐物連接可能是有利的。這樣的連接能夠使N-糖基化修飾之后的純化更簡單。合適的固相支撐物包括，但不限于，多孔測定平板、顆粒（例如，磁性或編碼顆粒）、柱或膜。[0184]用于檢測目標(biāo)分子的N-糖基化（例如，改變的N-糖基化）的方法包括DNA測序儀輔助型（DSA)、熒光團(tuán)輔助型糖電泳（FACE)(如隨附實施例中所述）或表面增強(qiáng)型激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOFMS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中，例如，將糖蛋白變性，其后固定在例如膜上。然后可以將糖蛋白用合適的還原劑如二硫蘇糖醇（DTT)或β-巰基乙醇還原。蛋白質(zhì)的巰氫基可以使用酸如碘乙酸來羧化。然后，可以使用酶如N-糖苷酶F將N-聚糖從蛋白質(zhì)釋放。任選地，N-聚糖可以通過還原性氨基化重建和衍生化。然后可以將衍生化的N-聚糖濃縮。適合用于N-聚糖分析的儀器包括，例如，ABIPRISM?377DNA測序儀（AppliedBiosystems)。數(shù)據(jù)分析可以使用例如GENESCAN?3.1軟件（AppliedBiosystems)進(jìn)行。任選地，可以將分離的甘露糖蛋白進(jìn)一步用一種或多種酶處理以確認(rèn)它們的N-聚糖狀態(tài)。示例性的酶包括，例如，α-甘露糖苷酶或α-1，2甘露糖苷酶，如隨附實施例中所述。另外的N-聚糖分析方法包括，例如，質(zhì)譜（例如，MALDI-T0F-MS)，正相、反相高壓液相層析（HPLC)和離子交換層析（例如，當(dāng)未標(biāo)記聚糖時使用脈沖電流計檢測，而如果對聚糖進(jìn)行了合適的標(biāo)記則使用UV吸光度或焚光）。還參見Callewaert等（2001)Glycobiology11(4):275-281和Freire等（2006)Bioconjug.Chem.17(2):559-564,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。[0185]可由N-糖基化改奪的分子處理的病癥[0186]本文描述的分離的、N-糖基化改變的分子（例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì)或多萜醇）可以用于治療多種疾病，所述疾病可以通過施用一種或多種N-糖基化改變的分子來治療（例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì)）。能夠通過施用N-糖基化改變的分子（例如，改變的N-糖蛋白或改變的N-糖基化的多萜醇）治療或預(yù)防的一些特定醫(yī)學(xué)狀況的實例在下節(jié)中評述。[0187](i)代謝紊亂[0188]代謝紊亂是影響個體人（或動物）細(xì)胞內(nèi)能力產(chǎn)生的病癥。大多數(shù)代謝紊亂是遺傳性的，盡管一些可以因飲食、毒素、感染等而"獲得"。遺傳性代謝紊亂也稱作代謝的先天性缺陷。概括而言，遺傳性代謝紊亂是由遺傳缺陷引起的，所述缺陷導(dǎo)致缺失或不正確地構(gòu)建細(xì)胞代謝過程中的一些步驟所必須的酶。最大幾類的代謝紊亂是糖代謝的紊亂、氨基酸代謝的紊亂、有機(jī)酸代謝的紊亂（有機(jī)酸尿癥（organicacidurias))，脂肪酸氧化和線粒體代謝的紊亂，P卜啉代謝的紊亂，嘌呤或嘧啶代謝的紊亂，類固醇代謝的紊亂，線粒體功能的紊亂，過氧化物酶體功能的紊亂和溶酶體貯積?。↙SD)。[0189]能夠通過使用一種或多種本文描述的N-糖基化改變的分子（或其藥物組合物）來治療的代謝紊亂的實例包括，例如，遺傳性血色?。╤ereditaryhemochromatosis)、眼皮膚白化?。╫culocutaneousalbinism)、蛋白C(proteinCdeficiency)、I型遺傳性血管性水腫（typeIhereditaryangioedema)、先天性薦糖酶-異麥芽糖酶缺乏(congenitalsucrase-isomaltasedeficiency)、克-納二氏II型（Crigler-NajjartypeII)、Laron綜合征（Laronsyndrome)、遺傳性髓過氧化物酶（hereditaryMyeloperoxidase)、原發(fā)性甲狀腺機(jī)能減退（primaryhypothyroidism)、先天性長QT綜合征（congenitallongQTsyndrome)、酪氨酸結(jié)合球蛋白缺乏（tyroxinebindingglobulindeficiency)、家族性高膽固醇血癥（familialhypercholesterolemia)、家族性乳糜微粒血癥（familialchylomicronemia)、a0-脂蛋白血癥（a0-lipoproteinema)、低原生質(zhì)脂蛋白A水平（lowplasmalipoproteinAlevels)、伴有肝損傷的遺傳性氣腫（hereditaryemphysemawithliverinjury)、先天性甲狀腺機(jī)能減退（congenitalhypothyroidism)、成骨不全（osteogenesisimperfecta)、遺傳性血纖維蛋白原過少(hereditaryhypofibrinogenemia)、α_1抗膜凝乳蛋白酶缺乏（a-Iantichymotrypsindeficiency)、腎原性尿崩癥（nephrogenicdiabetesinsipidus)、垂體神經(jīng)部尿崩癥(neurohypophysealdiabetesinsipidus)、腺苷脫氨酶缺乏（adenosinedeaminasedeficiency)、佩-邁二氏病（PelizaeusMerzbacherdisease)、IIA型馮維勒布蘭德病(vonWillebranddiseasetypeIIA)、結(jié)合性因子V和VIII缺乏（combinedfactorsVandVIIIdeficiency)、遲發(fā)性脊椎骨飯發(fā)育不全（spondylo-epiphysealdysplasiatarda)、無脈絡(luò)膜（choroideremia)、I細(xì)胞?。↖celldisease)、白頓氏病（Battendisease)、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（ataxiatelangiectasias)、常染色體顯性多囊性腎?。ˋDPKD-autosomaldominantpolycystickidneydisease)、微絨毛包含病(microvillusinclusiondisease)、結(jié)核性硬化（tuberoussclerosis)、Lowe眼腦腎綜合征（oculocerebro-renalsyndromeofLowe)、肌萎縮性側(cè)索硬化（amyotrophiclateralsclerosis)、骨髓增生異常綜合征（myelodysplasticsyndrome)、裸淋巴細(xì)胞綜合征（Barelymphocytesyndrome)、丹吉爾病（Tangierdisease)、家族性肝內(nèi)膽汁郁積（familialintrahepaticcholestasis)、X連鎖的腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥（X-linkedadreno-leukodystrophy)、Scott綜合征（Scottsyndrome)、1型和2型海-普二氏綜合征（Hermansky-Pudlaksyndrometypesland2)、左爾威格氏綜合征（Zellwegersyndrome)、肢根點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常（rhizomelicchondrodysplasiapuncta)、常染色體隱性原發(fā)性高草酸尿（autosomalrecessiveprimaryhyperoxaluria)、MohrTranebjaer綜合征（MohrTranebjaergsyndrome)、脊髓延髓肌萎縮（spinalandbullarmuscularatrophy)、原發(fā)性睫運(yùn)動障礙（primaryciliarydiskenesia)(卡塔格內(nèi)氏綜合征（Kartagener'ssyndrome))、巨人癥和肢端肥大癥（giantismandacromegaly)、乳溢（galactorrhea)、艾迪遜氏?。ˋddison'sdisease)、腎上腺性男性化（adrenalvirilism)、庫興氏綜合征（Cushing'ssyndrome)、酮酸中毒（ketoacidosis)、原發(fā)性或繼發(fā)性酸固酮增多癥（primaryorsecondaryaldosteronism)、米-迪綜合征（MillerDiekersyndrome)、無腦回（Iissencephaly)、運(yùn)動神經(jīng)元?。╩otorneurondisease)、阿史爾氏綜合征（Usher'ssyndrome)、威-阿二氏綜合征（Wiskott-Aldrichsyndrome)、奧佩齊氏綜合征（Optizsyndrome)、亨廷頓氏病（Huntington'sdisease)、遺傳性胰腺炎(hereditarypancreatitis)、抗磷脂綜合征（anti-phospholipidsyndrome)、重疊結(jié)締組織病（overlapconnectivetissuedisease)、斯耶格倫氏綜合征（Sj0gren'Ssyndrome)、僵體綜合征（stiff-mansyndrome)、Brugada綜合征（Brugadasyndrome)、芬蘭型先天性腎病綜合征（congenitalnephriticsyndromeoftheFinnishtype)、杜-約二氏綜合征（Dubin-Johnsonsyndrome)、X連鎖低磷酸鹽血癥（X-linkedhypophosphosphatemia)、佩德里得綜合征（Pendredsyndrome)、嬰兒期持續(xù)性高血胰島素低血糖（persistenthyperinsulinemichypoglycemiaofinfancy)、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥（hereditaryspherocytosis)、無血楽酮藍(lán)蛋白血癥（aceruloplasminemia)、嬰兒神經(jīng)元錯樣脂褐質(zhì)沉積癥（infantileneuronalceroidlipofuscinosis)、假性軟骨發(fā)育不全和多發(fā)性骨骨后發(fā)育不良（不全）（pseudoachondroplasiaandmultipleepiphyseal)、Stargardt樣黃斑發(fā)育不良（Stargardt-likemaculardystrophy)、X連鎖夏-馬-圖三氏?。╔-linkedCharcot-Marie-Toothdisease)、常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性（autosomaldominantretinitispigmentosa)、Wolcott-Rallison綜合征（Wolcott-Rallisonsyndrome)、庫興氏?。–ushingisdisease)、月支帶肌營養(yǎng)不良（limb-girdlemusculardystrophy)、IV型粘多糖IC積?。╩ucoploy-saccharidosistypeIV)、芬蘭遺傳性家族性淀粉樣變性(hereditaryfamilialamyloidosisofFinish)、安德森氏?。ˋndersondisease)、肉瘤（sarcoma)、慢性髓單核細(xì)胞性白血?。╟hronicmyelomonocyticleukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖發(fā)育異常（faciogenitaldysplasia)、Torsion?。═orsiondisease)、亨廷頓和脊髓小腦萎縮（Huntingtonandspinocerebellarataxias)、hereditaryhyperhomosyteinemia、多神經(jīng)病（polyneuropathy)、下運(yùn)動神經(jīng)元?。╨owermotorneurondisease)、色素性視網(wǎng)膜炎（pigmentedretinitis)、血清陰性多關(guān)節(jié)炎(seronegativepolyarthritis)、間質(zhì)月市纖維化（interstitialpulmonaryfibrosis)、雷諾氏現(xiàn)象（Raynaud'sphenomenon)、韋格納氏肉芽腫?。╓egner'sgranulomatosis)、蛋白尿（preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-IcUCDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、006-1113、〇06-11(3、〇06-11(1、埃-當(dāng)二氏綜合征出]116^-0&111〇88711(11'〇1116)、多發(fā)性外生骨琉（multipleexostoses)、格里斯塞利氏綜合征（Griscellisyndrome)(I型或2型）或X連鎖性非特異性腦力發(fā)育遲緩（X-Iinkednon-specificmentalretardation)。此外，代謝紊亂還可包括溶酶體IC積病例如，但不限于，法布里氏病、法勃氏?。‵arberdisease)、高歇爾氏病、GM1神經(jīng)節(jié)糖苷沉積癥（GM^gangliosidosis)、泰-沙二氏病、桑德霍夫氏病(Sandhoffdisease)、GM2激活病（GM2activatordisease)、克臘伯氏?。↘rabbedisease)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（metachromaticleukodystrophy)、尼-皮二氏?。∟iemann-Pickdisease)(A、B和C型）、赫勒氏?。℉urlerdisease)、沙伊氏病（Scheiedisease)、Hunter?。℉unterdisease)、桑菲列普氏?。⊿anfilippodisease)、莫爾基奧氏?。∕orquiodisease)、馬-垃?。∕aroteaux-Lamydisease)、透明質(zhì)酸酶缺乏（hyaluronidasedeficiency)、天門冬酰氨酸葡萄糖胺尿癥（aspartylglucosaminuria)、巖藻糖苷IC積病(fucosidosis)、甘露糖昔過多癥（mannosidosis)、謝爾德氏病（Schindlerdisease)、1型唾液酸缺乏病（sialidosistype1)、旁姆普氏病、致密性成骨不全（Pycnodysostosis)、錯樣脂褐質(zhì)沉積癥（ceroidlipofuscinosis)、膽固醇醋沉積病（cholesterolesterstoragedisease)、烏爾曼氏?。╓olmandisease)、多發(fā)性硫酸醋酶缺乏（Multiplesulfatasedeficiency)、乳液唾液異常增多（galactosialidosis)、粘脂積病(mucolipidosis)(II、III和IV型）、胱氨酸?。╟ystinosis)、唾液酸IC積?。╯ialicacidstoragedisorder)、伴有馬-斯二氏綜合征的乳糜微粒留滯病（chylomicronretentiondiseasewithMarinesco-Sjogrensyndrome)、海-普二氏綜合征（Hermansky-Pudlaksyndrome)、切-希二氏綜合征（Chediak-Higashisyndrome)、Danon病（Danondisease)或Geleophysic發(fā)育不良（Geleophysicdysplasia)〇[0190]代謝紊亂的癥狀多種多樣，并且可以包括如下的一種或多種，例如，貧血、疲勞、容易挫傷（bruisingeasily)、血小板低、肝增大、脾增大、骨豁脆弱（skeletalweakening)、肺損傷、感染（例如，胸部感染或肺炎）、腎損傷、進(jìn)行性腦損傷、發(fā)作、胎奠過厚、咳嗽、哮鳴、唾液或粘液過量產(chǎn)生、氣短（shortnessofbreath)、腹痛、腸或消化道閉塞（occludedbowelorgut)、生育力問題、鼻內(nèi)息肉、件狀指/趾甲和皮膚（clubbingofthefinger/toenailsandskin)、手或腳疼痛（paininthehandsorfeet)、血管角質(zhì)瘤（angiokeratoma)、排汗減少、角膜和晶狀體混池（cornealandlenticularopacities)、白內(nèi)障（cataracts)、二尖辦脫垂和/或回流（mitralvalveprolapseand/orregurgitation)、心臟肥大（cardiomegaly)、溫度不耐受、行走困難、吞咽困難、進(jìn)行性視力喪失、進(jìn)行性聽力喪失、張力減退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暫停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前凸或脊柱側(cè)凸。應(yīng)理解的是，由于缺陷或缺乏蛋白質(zhì)和所導(dǎo)致疾病表型（例如，代謝紊亂的癥狀顯現(xiàn)）的不同性質(zhì)，給定病癥將通常僅出現(xiàn)對于特定病癥為特征性的癥狀。例如，患有法博氏病的患者可以出現(xiàn)上述癥狀中的特定亞組，例如，但不限于，溫度不耐受、角膜眩暈（cornealwhirling)、疼痛、皮瘆、惡心或腹瀉?；加懈咝獱柺暇C合征（Gauchersyndrome)的患者可以出現(xiàn)脾大、肝硬變、驚厥、張力過高、呼吸暫停、骨質(zhì)疏松或皮膚變色。[0191]除了施用本文描述的一種或多種N-糖基化改變的分子，代謝紊亂也可以通過適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)和維生素（例如，輔因子療法）、物理療法和疼痛藥物療法來治療。[0192]依賴于給定代謝紊亂的特定性質(zhì)，患者可以在任何年齡出現(xiàn)這些癥狀。在許多情況下，癥狀可以在兒童期或成人期早期出現(xiàn)。例如，法博氏病的癥狀可以在年輕時（earlyage)出現(xiàn)，在10或11周歲的年齡。[0193]如用于本文，"有風(fēng)險發(fā)展出代謝紊亂"（例如本文所述的代謝紊亂）的受試者是具有發(fā)展出紊亂的傾向（predisposition)的受試者，即，由于酶中的突變而產(chǎn)生的發(fā)展出代謝紊亂的遺傳傾向，所述酶例如a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。顯然，"有風(fēng)險發(fā)展出代謝紊亂"的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。[0194]"疑似患有病癥"的受試者是具有病癥（例如，代謝紊亂或任何其它本文所述的病癥）的一種或多種癥狀（例如，任何本文所述的那些癥狀）的受試者。[0195](ii)癌癥[0196]癌癥是一類這樣的疾病或病癥，其特征在于細(xì)胞不受控制的分裂和這些細(xì)胞擴(kuò)散的能力，所述擴(kuò)散或者通過侵入直接生長進(jìn)入相鄰組織或者通過轉(zhuǎn)移植入遠(yuǎn)距離位點(diǎn)（其中癌細(xì)胞經(jīng)過血流或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)）。癌癥可以侵襲各個年齡的人，但是風(fēng)險有隨年齡增加的趨勢。癌癥的類型可以包括，例如，肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌（hematologicalcancer)、神經(jīng)組織癌（neuraltissuecancer)、黑素瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、宮頸癌、陰道癌或膀胱癌。[0197]如用于本文，"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥"的受試者是具有發(fā)展出癌癥的傾向的受試者，即，發(fā)展出癌癥的遺傳傾向，例如，腫瘤抑制基因中的突變（例如，BRCA1、p53、RB或APC中的突變）或已經(jīng)曝露于能夠?qū)е掳┌Y的條件。因此，當(dāng)受試者已經(jīng)曝露于誘變或致癌水平的特定化合物（例如，香煙煙霧中的致癌化合物例如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽（Benz{a}anthracene)、苯并花（Benzo{a}pyrene)、針-210(氡）、氨基甲酸醋（Urethane)或氯乙?。r，所述受試者也可以是"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥"的受試者。此外，當(dāng)受試者已經(jīng)曝露于例如大劑量的紫外線或X線輻射或曝露于（例如感染）引起腫瘤/與腫瘤相關(guān)的病毒如乳頭狀瘤病毒、EB病毒（Epstein-Barrvirus)、乙型肝炎病毒或人T-細(xì)胞白血病-淋巴瘤病毒時，所述受試者可以是"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥"的受試者。從上文可以清楚的是"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥"的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。[0198]"疑似患有癌癥"的受試者是具有癌癥的一種或多種癥狀的受試者。癌癥的癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括，但不限于，乳腺腫塊、乳頭變化、乳腺囊中、乳腺疼痛、體重減輕、虛弱、過度疲勞、進(jìn)食困難、食欲喪失、久咳、惡化的呼吸急促（worseningbreathlessness)、咳血、血尿、血便、惡心、嘔吐、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腹脹、氣脹、腹膜腔積液（fluidinperitonealcavity)、陰道出血、便秘、腹脹、結(jié)腸穿孔、急性腹膜炎（感染、發(fā)熱、疼痛）、疼痛、吐血、大量出汗（heavysweating)、發(fā)熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、眩暈、寒戰(zhàn)、肌肉痙攣、結(jié)腸轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、膀胱轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腎轉(zhuǎn)移和胰腺轉(zhuǎn)移、吞咽困難等。[0199]除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子，也可以通過化療劑、電離福射、免疫治療劑或超高溫治療劑來治療癌癥?；焺┌?，例如，順鉑（cisplatin)、卡鉬（carboplatin)、丙卡巴餅（procarbazine)、氮芥（mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide)、喜樹堿（camptothecin)、阿霉素（adriamycin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、美法侖（melphalan)、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、白消安、亞硝基脲、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素（daunorubicin)、多柔比星（doxorubicin)、博來霉素（bleomycin)、普卡霉素、絲裂霉素（mitomycin)、依托泊苷（etoposide)、verampil、鬼白毒素（podophyllotoxin)、他莫昔芬（tamoxifen)、紫杉醇（taxol)、（transplatinum)、5-氟尿喃啶（5-flurouracil)、長春新堿（vincristin)、長春堿（vinblastin)和甲氨蝶呤(methotrexate)〇[0200](iii)炎性病癥[0201]如用于本文，"炎性病癥"是指其中一種或多種物質(zhì)（例如，非天然存在于受試者中的物質(zhì)），藉由白細(xì)胞（例如，B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞或樹突細(xì)胞）的作用，不適當(dāng)?shù)匾l(fā)病理學(xué)應(yīng)答（例如，病理學(xué)免疫應(yīng)答）的過程。因此，所述炎性應(yīng)答中涉及的這些細(xì)胞稱作"炎性細(xì)胞"。不適當(dāng)?shù)匾l(fā)的炎性應(yīng)答可以是其中沒有外源物質(zhì)（例如，抗原、病毒、細(xì)菌、真菌）存在于受試者中或受試者上的應(yīng)答。不適當(dāng)?shù)匾l(fā)的應(yīng)答可以是其中自身成分（例如，自體抗原）被炎性細(xì)胞靶向的應(yīng)答（例如，自身免疫病如多發(fā)性硬化）。不適當(dāng)?shù)匾l(fā)的應(yīng)答也可以是在程度或持續(xù)時間方面不適當(dāng)?shù)膽?yīng)答，例如，過敏反應(yīng)。因此，不適當(dāng)?shù)匾l(fā)的應(yīng)答的原因可以是存在微生物感染（例如，病毒、細(xì)菌或真菌的）。炎性病癥的類型（例如，自身免疫病）可以包括，但不限于，骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis(RA))、脊椎關(guān)節(jié)病（spondyloarthropathies)、POEMS綜合征(POEMSsyndrome)、克朗氏?。–rohn'sdisease)、多中心性卡斯?fàn)柺喜。╩ulticentricCastleman'sdisease)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematosus(SLE))、多發(fā)性硬化（MS)、肌營養(yǎng)不良（musculardystrophy(MD))、胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus(IDDM))、皮肌炎（dermatomyositis)、多肌炎（polymyositis)、炎性神經(jīng)?。╥nflammatoryneuropathies)例如歸伯二氏綜合征(GuillainBarresyndrome)、脈管炎（vasculitis)例如韋格納肉芽腫?。╓egener'sgranulomatosus)、結(jié)節(jié)性多動脈炎（polyarteritisnodosa)、風(fēng)濕性多肌痛（polymyalgiarheumatica)、顳動脈炎（temporalarteritis)、舍格倫綜合征（Sjogren'ssyndrome)、貝賽特氏?。˙echet'sdisease)、丘-施二氏綜合征（Churg-Strausssyndrome)或高安氏動脈炎（Takayasu'sarteritis)。炎性病癥還包括特定類型的變態(tài)反應(yīng)例如鼻炎（rhinitis)、鼻竇炎（sinusitis)、蕁麻瘆（urticaria)、尋麻瘆（hives)、血管性水腫(angioedema)、特應(yīng)性皮炎（atopicdermatitis)、食物變態(tài)反應(yīng)（foodallergies)(例如，(堅果變態(tài)反應(yīng)（nutallergy))、藥物變態(tài)反應(yīng)（drugallergies)(例如，青霉素）、昆蟲變態(tài)反應(yīng)（insectallergies)(例如，針對蜂螯的變態(tài)反應(yīng)）或肥大細(xì)胞?。╩astocytosis)。炎性病癥也可包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis)和哮喘（asthma)。[0202]"有風(fēng)險患上炎性病癥"的受試者是指具有一種或多種炎性病癥的家族史（例如，一種或多種炎性病癥的遺傳傾向）的患者或曝露于一種或多種炎癥誘導(dǎo)條件的受試者。例如，受試者可能已經(jīng)曝露于病毒或細(xì)菌超抗原，例如，但不限于，葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxins)(SEs)、釀胺鏈球菌外毒素（streptococcuspyogenesexotoxin)(SPE)、金黃色葡萄球菌中毒性休克-綜合征毒素（staphylococcusaureustoxicshock-syndrometoxin)(TSST-1)、鏈球菌促有絲分裂外毒素（streptococcalmitogenicexotoxin)(SME)和鏈球菌超抗原（streptococcalsuperantigen)(SSA)。從上文可以清楚的是"有風(fēng)險發(fā)展出炎性病癥"的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。[0203]"疑似患有炎性病癥"的受試者是出現(xiàn)炎性病癥的一種或多種癥狀的受試者。炎性病癥的癥狀是本領(lǐng)域熟知的并且包括，但不限于，發(fā)紅、腫脹（例如，關(guān)節(jié)腫脹）、觸碰發(fā)熱的關(guān)節(jié)（jointsthatarewarmtothetouch)、關(guān)節(jié)痛、僵硬、關(guān)節(jié)功能喪失、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞、精力喪失（lossofenergy)、頭痛、食欲喪失、肌肉僵硬、失眠、瘙癢、鼻塞、噴嚏、咳嗽、一種或多種神經(jīng)學(xué)癥狀如眩暈、發(fā)作或疼痛。[0204]除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子之外，炎性病癥也可以通過非類固醇抗炎藥（NSAID)、緩解病情的抗風(fēng)濕藥（DMARD)、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑或皮質(zhì)類固醇來治療。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括，例如，抗TNF劑（例如，可溶性TNF受體或?qū)NF特異性的抗體如adulimumab、英夫利昔單抗（infliximab)或依那西普（etanercept)[0205]使用N-糖基化改變的分子（或其藥物組合物）、適用于治療（例如，預(yù)防或改善其一種或多種癥狀）任何本文所述的病癥的方法在下節(jié)中陳述。[0206]藥物組合物和治療方法[0207]N-糖基化改變的分子（例如，目標(biāo)分子如目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式）可以并入藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效量的所述分子和一種或多種佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑?？山邮艿南♂寗?、載體和賦形劑通常不負(fù)面影響受體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)（例如電解質(zhì)平衡）?？山邮艿妮d體包括生物相容性、惰性或生物可吸收的鹽、緩沖劑、寡糖或多糖、聚合物、粘度改善劑（viscosity-improvingagent)、防腐劑等。一種示例性載體是生理鹽水（0.15MNaCl，pH7.0-7.4)。另一種示例性載體是50mM磷酸鈉、IOOmM氯化鈉。關(guān)于配制和施用藥物組合物的技術(shù)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在例如Remington'sPharmaceuticalSciences(MaackPublishingCo.,Easton,Pa.)中找到。也可以將輔助性活性化合物(supplementaryactivecompound)并入組合物中。[0208]含有N-糖基化改變的分子的藥物組合物的施用可以是系統(tǒng)的或局部的?？梢詫⑺幬锝M合物這樣配制，即令它們適用于胃腸外和/或非胃腸外施用。具體使用方式(administrationmodality)包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、口服、直腸、口腔、局部、鼻、眼、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、支氣管、淋巴、陰道和子宮內(nèi)施用。[0209]施用可以通過定期注射所述藥物組合物的推注（bolus)，或者可以是不間斷或連續(xù)地通過從外部儲器（reservoir)(例如，IV包）或內(nèi)部儲器（例如，生物可腐蝕性植入物（bioerodableimplant)、生物人工器官（bioartificialorgan)或植入的產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的細(xì)胞集落）進(jìn)行靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。參見，例如，美國專利Nos.4,407,957、5,798,113和5,800,828,將它們通過所述整體并入本文。藥物組合物的施用可以使用合適的遞送手段（deliverymeans)來實現(xiàn)，所述遞送手段例如：泵（參見，例如，AnnalsofPharmacotherapy，27:912(1993);Cancer,41:1270(1993);CancerResearch,44:1698(1984)，通過所述整體并入本文）；微囊化（參見，例如，美國專利Nos.4,352,883;4,353,888;和5,084,350,通過所述整體并入本文）；連續(xù)釋放聚合物植入物（continuousreleasepolymerimplant)(參見，例如，Sabel,美國專利No.4,883,666,通過所述整體并入本文）；大囊化（macroencapsulation)(參見，例如，美國專利Nos.5,284,761、5,158,881、4,976,859和4,968,733,和公開的PCT專利申請W092/19195、WO95/05452,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文）；皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)注射或注射至其它合適部位；或在膠囊、液體、片劑、丸劑（pill)或延長釋放制劑（prolongedreleaseformulation)中口服施用。[0210]胃腸外遞送系統(tǒng)的實例包括乙烯-乙酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵（osmoticpump)、可植入輸注系統(tǒng)（implantableinfusionsystem)、泵遞送（pumpdelivery)、囊化細(xì)胞遞送（encapsulatedcelldelivery)、脂質(zhì)體遞送（liposomaldelivery)、針遞送注射（needle-deliveredinjection)、無針注射（needle-lessinjection)、噴霧器(nebulizer)、霧化器（aerosolizer)、電穿孔和經(jīng)皮貼片（transdermalpatch)。[0211]適合于胃腸外施用的制劑通常含有N-糖基化改變的分子的無菌含水制備物，其優(yōu)選與受體的血液等滲（例如，生理鹽水溶液）。制劑可以以單位劑量或多劑量形式存在。[0212]適合于口服施用的制劑可以作為離散單位如膠囊、扁囊劑（cachet)、片劑或錠劑(lozenges)存在，其各自含有預(yù)定量的N-糖基化改變的分子；或含水液體中或非水液體中的懸液，如糖楽·、酏劑、乳劑或飲劑（draught)。[0213]可以將適合于局部施用的N糖基化改變的分子（例如，目標(biāo)分子例如目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式）向哺乳動物（例如，人患者）作為例如乳膏（cream)、噴霧、泡沫、凝膠、軟膏（ointment)、油膏（salve)或干燥摩擦劑（dryrub)施用。干燥摩擦劑可以在施用部位再水合。N-糖基化改變的分子也可以直接注入（例如，浸入并干燥）其后可以進(jìn)行局部應(yīng)用的繃帶、紗布或貼片。也可以將N-糖基化改變的分子以半液態(tài)、凝膠（gelled)態(tài)或完全液態(tài)保持在用于局部施用的繃帶、紗布或貼片中（參見，例如，美國專利No.4,307,717，將其內(nèi)容通過所述整體并入本文）。[0214]可以向需要的受試者以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的給藥方案施用治療有效量的藥物組合物。例如，可以向受試者施用組合物，例如，以每劑〇.01μg/kg-10,000μg/kg受試者體重的劑量系統(tǒng)性施用。在另一實例中，劑量是每劑Iμg/kg-100μg/kg受試者體重。在另一實例中，劑量是每劑Iμg/kg-30μg/kg受試者體重，例如，每劑3μg/kg-?ομg/kg受試者體重。[0215]為了優(yōu)化治療效力，可以首先以不同的給藥方案施用N-糖基化改變的分子。單位劑量和方案依賴于多種因素，包括，例如，哺乳動物的種類、其免疫狀態(tài)、哺乳動物的體重。通常，組織中N-糖基化改變的分子的水平可以使用適合的、作為臨床測試流程一部分的篩查測定法監(jiān)測，例如，來測定給定治療方案的效力。[0216]N-糖基化改變的分子的給藥頻率在醫(yī)療工作者（medicalpractitioner)(例如，醫(yī)生或護(hù)士）的技術(shù)和臨床判斷范圍之內(nèi)。通常，施用方案通過臨床試驗建立，所述試驗可以建立最適施用參數(shù)。然而，從業(yè)者可以根據(jù)受試者的年齡、健康、重量、性別和醫(yī)療狀態(tài)改變這些治療方案。給藥頻率可以依賴于治療是預(yù)防性還是治療性的而變化。[0217]這些N-糖基化改變的分子（例如，目標(biāo)分子例如目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式）或其藥物組合物的毒性和治療效力可以通過已知的藥學(xué)方法在例如細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y定。這些方法可以用于例如測定LD50(對群體的50%致死的劑量）和ED50(在群體的50%中治療有效的劑量）。毒性和治療效果的劑量比是治療指數(shù)并且可以表示為LD50/ED50的比例。展現(xiàn)高治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。盡管可以使用展現(xiàn)毒性副作用的藥物組合物，應(yīng)該注意設(shè)計使這些化合物靶向患病組織的部位以盡量減小對正常細(xì)胞的損害（例如，非靶細(xì)胞），并且由此降低副作用。[0218]從細(xì)胞培養(yǎng)測定法和動物研宄獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于適當(dāng)受試者（例如，人患者）中的劑量范圍。這些藥物組合物的劑量通常在如下循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，所述濃度包括ED50且?guī)缀鯚o毒或無毒。劑量可以在這個范圍內(nèi)依賴于采用的劑量形式和使用的施用途徑而變化。對于如本文所述使用的藥物組合物（例如，用于治療受試者中的代謝紊亂），最初可以從細(xì)胞培養(yǎng)測定法估計治療有效劑量?？梢栽趧游锬Ｐ椭信渲苿┝恳詫崿F(xiàn)包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定的IC50(即，實現(xiàn)對癥狀的最大抑制的一半的藥物組合物濃度）的循環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可以用于更精確地測定在人中有用的劑量。血漿中的水平可以例如通過高效液相層析測量。[0219]如本文所定義的，"治療有效量"的N-糖基化改變的分子是能夠在受治療的受試者中產(chǎn)生期望的醫(yī)學(xué)結(jié)果的分子的量（例如，改善代謝紊亂的一種或多種癥狀或減少癌細(xì)胞增殖）。N-糖基化改變的分子的治療有效量（即，有效劑量）包括毫克或微克量的所述化合物每千克受試者或樣品重量（例如，約1微克每千克至約500毫克每千克，約100微克每千克至約5毫克每千克，或約1微克每千克至約50微克每千克）。[0220]受試者可以是任何哺乳動物，例如，人（例如，人患者）或非人靈長類（例如，黑猩猩（chimpanzee)、狒狒（baboon)或猴（monkey))、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、馬、牲畜類型（例如，牛、豬、綿羊或山羊）、犬、貓或鯨。[0221]可以將本文描述的N-糖基化改變的分子或其藥物組合物與另一治療作為聯(lián)合療法向受試者施用，所述另一治療例如用于代謝紊亂（例如，溶酶體貯積?。┑闹委煛＠?，聯(lián)合療法可以包括向受試者（例如，人患者）施用一種或多種額外的為受試者提供治療益處的劑（agent)，所述受試者患有或有風(fēng)險發(fā)展出（或疑似患有）代謝紊亂（例如，溶酶體貯積?。?。由此，化合物或藥物組合物和所述一種或多種額外的劑同時施用?；蛘?，可以首先及時（intime)施用N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)或多貓醇），并其次及時施用所述一種或兩種額外的劑?？梢允紫燃皶r施用所述一種或兩種額外的劑，并其次及時施用N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)或多萜醇）?；腔淖兊姆肿涌梢蕴娲蚣訌?qiáng)先前施用或當(dāng)前施用的療法。例如，當(dāng)用本發(fā)明的N-糖基化改變的分子治療時，一種或多種額外的劑的施用可以停止或減少，例如，以較低水平施用。也可以保持先前療法的施用。在一些情況下，可以將先前療法保持到N-糖基化改變的分子的水平（例如，劑量或進(jìn)度（schedule))達(dá)到足以提供治療效果的水平。可以聯(lián)合施用兩種療法。[0222]應(yīng)該理解的是在先前治療有特定毒性的情況（例如，具有顯著副作用譜的用于代謝紊亂的治療）下，N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)或多萜醇）的施用可以用于將先前治療的量抵消和/或減少到足以給出相同或改進(jìn)的治療益處、但是沒有毒性的水平。[0223]在一些情況下，當(dāng)向受試者施用本發(fā)明的N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)、多萜醇或與多萜醇連接的脂質(zhì)）或藥物組合物時，將第一種療法中斷?？梢员O(jiān)測受試者的第一種預(yù)先選擇的結(jié)果，例如，代謝紊亂的一種或多種癥狀的改善，例如任何本文所述的那些（見上文）。在一些情況下，在觀察到第一種預(yù)先選擇的結(jié)果的情況下，減少或中斷使用N-糖基化改變的分子（例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì)或N-糖基化改變的多萜醇）的治療。然后在使用N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)或多萜醇）的治療之后，可以監(jiān)測受試者第二種預(yù)先選擇的結(jié)果，例如，代謝紊亂的癥狀的惡化。當(dāng)觀察到所述第二種預(yù)先選定的結(jié)果時，可以恢復(fù)或增加向受試者施用N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)或多萜醇），或恢復(fù)所述第一種治療的施用，或?qū)κ茉囌呤┯肗-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)、多萜醇或與多萜醇連接的脂質(zhì)）和第一種治療二者或量增加的N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)或多萜醇）和所述第一種治療方案。[0224]N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)或多萜醇）也可以與用于疾?。ɡ纾x紊亂）的一種或多種癥狀的治療一起施用。例如，N-糖基化改變的分子（例如，蛋白質(zhì)、多萜醇或與多貓醇連接的脂質(zhì)）可以與例如疼痛用藥（painmedication)共同施用（例如，同時或通過上述聯(lián)合方案）。[0225]應(yīng)該理解的是在一些實施方案中，N-糖基化改變的分子是其中改變的糖基化使所述分子產(chǎn)生醫(yī)學(xué)相關(guān)產(chǎn)物的能力增加的分子。例如，N-糖基化改變的分子可以是能夠產(chǎn)生治療性產(chǎn)物（例如，小分子或治療性肽）的酶，所述酶的活性通過糖基化增加或優(yōu)化。這些產(chǎn)物和使用所述產(chǎn)物的方法在本公開的范圍之內(nèi)。[0226]本文所述的任何藥物組合物可以與施用說明書一起包括在容器、包裝或散發(fā)器(dispenser)中。[0227]本申請具體涉及如下項：[0228]1.產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括：[0229]提供解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性；和[0230]向細(xì)胞中引入編碼目標(biāo)蛋白的核酸，其中所述細(xì)胞以改變的糖基化形式產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白。[0231]2.項1的方法，還包括分離所述目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。[0232]3.項1或2的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是外源蛋白。[0233]4.項1-3中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是內(nèi)源蛋白。[0234]5.項1-4中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是哺乳動物蛋白。[0235]6.項5的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是人蛋白。[0236]7.項1-6中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結(jié)合片段，或融合蛋白。[0237]8.項7的方法，其中所述融合蛋白是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細(xì)胞因子或趨化因子與抗體或其抗原結(jié)合片段的融合物。[0238]9.項1-8中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是與溶酶體貯積?。↙SD)相關(guān)的蛋白質(zhì)。[0239]10.項1-9中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是葡糖腦苷酯酶或半乳糖腦苷酯酶。[0240]11.項1-9中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白選自下組：a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。[0241]12.項1-11中任一項的方法，其中所述改變的N-糖基化形式包括一種或多種N-聚糖結(jié)構(gòu)。[0242]13.項12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Man5GlcNAc2。[0243]14.項12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Man8GlcNAc2。[0244]15.項12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Man9GlcNAc2。[0245]16.項12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Man3GlcNAc2。[0246]17.項12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Glc1Man5GlcNAc2。[0247]18.項12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Glc2Man5GlcNAc2。[0248]19.項12-18中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式是均質(zhì)的。[0249]20.項12-18中任一項的方法，其中所述目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式基本上是均質(zhì)的。[0250]21.項20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標(biāo)分子之部分是至少約20%〇[0251]22.項20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標(biāo)分子之部分是至少約30%〇[0252]23.項20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標(biāo)分子之部分是至少約40%〇[0253]24.項19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man5GlcNAc2。[0254]25.項19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man8GlcNAc2。[0255]26.項19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man9GlcNAc2。[0256]27.項19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man3GlcNAc2。[0257]28.項19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是GlClMan5GlcNAc2。[0258]29.項19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Glc2Man5GlcNAc2。[0259]30.項1-29中任一項的方法，其中所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而缺乏至少一種N-糖基化活性。[0260]31.項30的方法，其中N-糖基化活性是ALG3活性。[0261]32.項30的方法，其中N-糖基化活性是OCHl活性。[0262]33.項30的方法，其中N-糖基化活性是MNSl活性。[0263]34.項30的方法，其中N-糖基化活性是MNN9活性。[0264]35.項1-34中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因。[0265]36.項1-35中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式。[0266]37.項1-36中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含引入或表達(dá)RNA分子，所述RNA分子干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)。[0267]38.項1-37中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)。[0268]39.項38的方法，其中所述表達(dá)的蛋白質(zhì)是由細(xì)胞中的外源核酸編碼的蛋白質(zhì)。[0269]40.項38的方法，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。[0270]41.項38-40中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是ALG6。[0271]42.項38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是α-甘露糖苷酶。[0272]43.項38的方法，其中所述α-甘露糖苷酶靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。[0273]44.項42或43的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是融合蛋白，所述融合蛋白包含α-甘露糖苷酶多肽和HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留肽。[0274]45.項42的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有5.1以下的最適pH。[0275]46.項38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是能夠從Man5GlcNAc^除葡萄糖殘基的蛋白質(zhì)。[0276]47.項38或46的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。[0277]48.項46或47的方法，其中所述蛋白質(zhì)是葡糖苷酶II。[0278]49.項46-48中任一項的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含葡糖苷酶II的α和/或β亞基。[0279]50.項46的方法，其中所述蛋白質(zhì)是變聚糖酶。[0280]51.項1的方法，其中所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。[0281]52.項51的方法，其中所述至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。[0282]53.項1的方法，其中所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。[0283]54.項51的方法，其中所述至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。[0284]55.項38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是外源蛋白。[0285]56.項38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是哺乳動物蛋白。[0286]57.項56的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是人蛋白。[0287]58.項38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是低等真核生物蛋白。[0288]59.項45的方法，其中所述低等真核生物是真菌、錐蟲或原生動物。[0289]60.項58的方法，其中所述低等真核生物選自下組布氏錐蟲、哈茨木霉和曲霉屬。[0290]61.項1-60中任一項的方法，其中修飾包含表達(dá)能夠影響目標(biāo)蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體。[0291]62.項61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是MNM。[0292]63.項61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是PNOl。[0293]64.項61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是ΜΝΝ6。[0294]65.項61-64中任一項的方法，其中糖蛋白中至少約30%的甘露糖殘基是磷酸化的。[0295]66.項1-65中任一項的方法，其中所述細(xì)胞未經(jīng)遺傳工程化而成為OCHl活性缺陷的。[0296]67.項1-66中任一項的方法，還包括對糖蛋白的額外加工。[0297]68.項67的方法，其中所述額外加工發(fā)生在體外。[0298]69.項67的方法，其中所述額外加工發(fā)生在體內(nèi)。[0299]70.項67-69中任一項的方法，其中所述額外加工包括向修飾的糖蛋白添加異源豐旲塊。[0300]71.項55的方法，其中所述異源模塊是聚合物或載體。[0301]72.項67-71中任一項的方法，其中所述額外加工包括對所述目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式進(jìn)行酶處理或化學(xué)處理。[0302]73.項67的方法，其中所述額外加工包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶處理所述目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。[0303]74.項72的方法，其中所述額外加工包括用氫氟酸處理所述目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。[0304]75.項67-74中任一項的方法，其中所述額外加工包括將所述目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式磷酸化。[0305]76.具有改變的N-糖基化的分離的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是通過項1-75中任一項的方法產(chǎn)生的。[0306]77.分離的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。[0307]78.項77的分離的細(xì)胞，其中N-糖基化活性是ALG3活性。[0308]79.項77或78的分離的細(xì)胞，其中N-糖基化活性是OCHl活性。[0309]80.項77-79中任一項的分離的細(xì)胞，其中N-糖基化活性是麗Sl活性。[0310]81.項77-79中任一項的分離的細(xì)胞，其中N-糖基化活性是MNN9活性。[0311]82.項77-79中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述修飾包含缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因。[0312]83.項77-79中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述修飾包含表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式。[0313]84.項77-83中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述修飾包含引入或表達(dá)RNA分子，所述RNA分子干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)。[0314]85.項77-83中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述修飾包含表達(dá)具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)。[0315]86.項85的分離的細(xì)胞，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。[0316]87.項85或86的分離的細(xì)胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是ALG6。[0317]88.項85的分離的細(xì)胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是α-甘露糖苷酶。[0318]89.項88的分離的細(xì)胞，其中所述α-甘露糖苷酶靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。[0319]90.項88或89的分離的細(xì)胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是融合蛋白，所述融合蛋白包含α-甘露糖苷酶多肽和HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留肽。[0320]91.項85的分離的細(xì)胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質(zhì)。[0321]92.項85或91的分離的細(xì)胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。[0322]93.項91或92的分離的細(xì)胞，其中所述蛋白質(zhì)是葡糖苷酶II。[0323]94.項91-93中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述蛋白質(zhì)包含葡糖苷酶II的α和/或β亞基。[0324]95.項91的分離的細(xì)胞，其中所述蛋白質(zhì)是變聚糖酶。[0325]96.項77-95中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。[0326]97.項96的分離的細(xì)胞，其中所述至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。[0327]98.項77-97中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。[0328]99.項98的分離的細(xì)胞，其中至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。[0329]100.利要求77-99中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞未經(jīng)遺傳工程化而成為OCHl活性缺陷的。[0330]101.項85-100中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是人蛋白。[0331]102.項77-101中任一項的分離的細(xì)胞，其中所述修飾包含表達(dá)能夠促進(jìn)經(jīng)修飾的糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體。[0332]103.項102的分離的細(xì)胞，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是MNM。[0333]104.項103的分離的細(xì)胞，其中所述影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是PNOl。[0334]105.-種治療病癥的方法，所述病癥可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療，所述方法包括：[0335]向受試者施用項76的蛋白質(zhì)，[0336]其中所述受試者是患有或疑似患有可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療的受試者。[0337]106.項105的方法，其中所述病癥是代謝紊亂。[0338]107.項106的方法，其中所述代謝紊亂是溶酶體貯積?。↙SD)。[0339]108.項107的方法，其中溶酶體貯積病是高歇爾氏病、泰-沙二氏病、旁姆普氏病、尼-皮二氏病或法布里氏病。[0340]109.項105-108中任一項的方法，其中所述蛋白質(zhì)是與LSD相關(guān)的蛋白質(zhì)。[0341]110.項109的方法，其中所述蛋白質(zhì)是葡糖腦苷酯酶或α-半乳糖苷酶。[0342]111.項109的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自下組：a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。[0343]112.項105-111中任一項的方法，其還包括確定所述受試者是否患有可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療的疾病。[0344]113.項105-112中任一項的方法，其中所述受試者是人。[0345]114.產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標(biāo)蛋白與制備自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞的細(xì)胞裂解物接觸，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中使所述目標(biāo)蛋白與所述細(xì)胞裂解物接觸導(dǎo)致該目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。[0346]115.產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標(biāo)蛋白與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)獲得自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，并且其中使所述目標(biāo)分子與所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸導(dǎo)致該目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。[0347]116.解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物中的大量經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。[0348]117.項87的基本上純的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物含有一種或多種細(xì)胞亞群，每個亞群包含不同的經(jīng)修飾的糖基化活性。[0349]118.分離的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。[0350]119.分離的核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%相同的序列。[0351]120.由項118或119的分離的核苷酸序列編碼的多肽。[0352]121.分離的核酸，其包含：[0353](a)核苷酸序列，其在高嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的補(bǔ)體雜交；或[0354](b)所述核苷酸序列的補(bǔ)體。[0355]122.包含項118-121中任一項的核酸序列的載體。[0356]123.包含項118-121中任一項的核酸序列的表達(dá)載體。[0357]124.包含項123的表達(dá)載體的培養(yǎng)的細(xì)胞或所述細(xì)胞的子代，其中所述細(xì)胞表達(dá)所述多肽。[0358]125.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在允許表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)項124的細(xì)胞。[0359]126.項125的方法，其還包括在培養(yǎng)細(xì)胞之后，從細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基分離多肽。[0360]以下是本發(fā)明的實踐的實施例。不應(yīng)將它們理解為以任何方式對本發(fā)明范圍的限制。實施例[0361]實施例L質(zhì)粒、引物和菌株[0362]表1含有在本文所述實驗中所用載體（例如，表達(dá)載體）和缺失盒的構(gòu)建中使用的全部質(zhì)粒的列表。在所述實驗中使用了解脂西洋蓍霉的MTLY60菌株。[0363]表2含有在以下實施例中使用的引物（引物的名稱）和引物應(yīng)用的列表。[0364]表1[0365]【權(quán)利要求】1.產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括：提供解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性；和向細(xì)胞中引入編碼目標(biāo)蛋白的核酸，其中所述細(xì)胞以改變的糖基化形式產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白。2.具有改變的N-糖基化的分離的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是通過權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的。3.分離的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。4.一種治療病癥的方法，所述病癥可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療，所述方法包括：向受試者施用權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其中所述受試者是患有或疑似患有可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療的受試者。5.產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標(biāo)蛋白與制備自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞的細(xì)胞裂解物接觸，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中使所述目標(biāo)蛋白與所述細(xì)胞裂解物接觸導(dǎo)致該目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。6.產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標(biāo)蛋白與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)獲得自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，并且其中使所述目標(biāo)分子與所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸導(dǎo)致該目標(biāo)蛋白的改變的N-糖基化形式。7.解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細(xì)胞的基本上純的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物中的大量經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性?！疚臋n編號】C12P21/00GK104480140SQ201410681757【公開日】2015年4月1日申請日期:2008年4月3日優(yōu)先權(quán)日:2007年4月3日【發(fā)明者】尼科.L.M.卡爾沃爾特,沃特.弗維肯,卡倫.J.馬塞爾德波爾克,史蒂文.C.J.蓋森斯,芒娜.古爾法爾申請人:奧克西雷恩英國有限公司