水稻高產(chǎn)等位基因gy6的功能特異性分子標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了檢測水稻高產(chǎn)等位基因 GY6 的1個功能特異性分子標(biāo)記Si2926/ Hha I，其上游引物序列如SEQ ID No:1所示、下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，利用該對引物對水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切，可以檢測待測材料是否攜帶水稻高產(chǎn)等位基因 GY6 ，整個檢測過程操作簡單且準(zhǔn)確性高。
【專利說明】水稻高產(chǎn)等位基因GY6的功能特異性分子標(biāo)記

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻育種中的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是高產(chǎn)等位基因碰]I個功能特異性分子標(biāo)記。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一。提高水稻單產(chǎn)對解決糧食安全問題具有重要意義。水稻的單株產(chǎn)量由三個構(gòu)成因子決定:單株穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和千粒重，均屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多個數(shù)量性狀基因(Quantitative trait loci，QTL)控制。近年來，隨著水稻全基因組測序的完成，水稻產(chǎn)量性狀QTL的克隆研宄取得了快速發(fā)展，已克隆了 16個控制株型、穗形、每穗實(shí)粒數(shù)、每穗穎花數(shù)和千粒重等水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL。然而，相對于產(chǎn)量性狀的復(fù)雜性，目前對其遺傳基礎(chǔ)的了解還相當(dāng)有限，因此，迫切需要挖掘更多的產(chǎn)量基因，不僅為理解其遺傳基礎(chǔ)提供理論根據(jù)，而且也為更好更快地培育高產(chǎn)新品種提供基因資源和技術(shù)支持。
[0003]目前，分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)在水稻育種中得到越來越廣泛地應(yīng)用，但大多數(shù)的選擇仍是基于與基因連鎖的分子標(biāo)記，而非基因本身的基因標(biāo)記，特別是功能性標(biāo)記。應(yīng)用功能性標(biāo)記進(jìn)行MAS可以克服連鎖分子標(biāo)記所帶來的一些弊端:1)遺傳累贅，即目的基因(有利基因)與其附近的非目的基因(不利基因)存在連鎖，在導(dǎo)入目的基因的同時也帶入了不利基因，導(dǎo)致改良達(dá)不到預(yù)期目標(biāo)；2)標(biāo)記信息誤導(dǎo)，即標(biāo)記仍然存在，但由于重組使標(biāo)記與基因分離，導(dǎo)致目標(biāo)基因的缺失，造成假陽性的發(fā)生。
[0004]水稻產(chǎn)量基因伽是本發(fā)明人最近克隆的一個產(chǎn)量基因(專利號:ZL201210047301.0 ;發(fā)明名稱:水稻產(chǎn)量基因的克隆及其應(yīng)用)。為了加快0?基因在育種中的應(yīng)用進(jìn)程，有必要開發(fā)出準(zhǔn)確有效的鑒定CM高產(chǎn)等位基因的功能特異性分子標(biāo)記。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供鑒定高產(chǎn)等位基因的功能特異性分子標(biāo)記Si2926/ HhaI的引物，所述片段如序列表SEQ ID ΝΟ:1-2所示。
[0006]具體地，所述引物對的核苷酸序列如下:
上游引物序列為5’ -CCGGATCACTAACCTCAGCG-3’，如序列表SEQ ID No:1所示；
下游引物序列為5’ -GCATCCAAGATATGATCCGTA-3’，如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
以0?基因的珍汕97型和密陽46型等位基因的核苷酸和氨基酸序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行序列比對分析，針對第31位氨基酸差異，應(yīng)用Oligo 7.0軟件設(shè)計出I個dCAPS標(biāo)記Si2926/Hha K先應(yīng)用珍汕97和密陽46進(jìn)行PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切，驗(yàn)證其檢測效果和多態(tài)性。再應(yīng)用該分子標(biāo)記對衍生于珍汕97/密陽46、在0?基因區(qū)間存在功能差異的近等基因系群體進(jìn)行功能驗(yàn)證，并經(jīng)進(jìn)一步應(yīng)用66份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行基因型檢測。表明該功能特異性分子標(biāo)記對仍貨高廣等位基因的檢測可靠性尚，可以應(yīng)用于仍貨高廣等位基因的轉(zhuǎn)育研宄中。
[0008]本發(fā)明具有如下明顯的有益效果:
本發(fā)明通過比較C汕97型和密陽46型兩種等位基因的核苷酸和氨基酸序列，基于氨基酸差異位點(diǎn)設(shè)計開發(fā)了 I個功能特異性分子標(biāo)記。應(yīng)用該功能特異性分子標(biāo)記，以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)輔以限制性內(nèi)切酶酶切，如果得到的片段大小為135 bp，則待測水稻材料含有高產(chǎn)等位基因不僅能快捷有效地從育種群體中篩選到攜帶目標(biāo)基因型的個體，而且能準(zhǔn)確區(qū)分不同水稻資源的等位基因型。
[0009]本發(fā)明開發(fā)的分子標(biāo)記源自基因內(nèi)部功能特異性位點(diǎn)的多態(tài)性，不存在遺傳累贅和假陽性的問題，以之為基礎(chǔ)對目標(biāo)基因進(jìn)行常規(guī)雜交轉(zhuǎn)育、聚合育種或轉(zhuǎn)基因應(yīng)用，可以大大節(jié)約時間和成本，增加篩選準(zhǔn)確性，提高育種效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為珍汕97型和密陽46型等位基因氨基酸序列比對結(jié)果。
[0011]圖2為分子標(biāo)記Si2926/通a I在珍汕97和密陽46中的檢測結(jié)果。其中，M !Maker ；ZS:珍汕97 ；MY:密陽46 ；M左側(cè)為PCR產(chǎn)物，右側(cè)為酶切產(chǎn)物。
[0012]圖3為分子標(biāo)記Si2926//*a I在近等基因系群體中的檢測結(jié)果。其中，Z:珍汕97 ;M:密陽46 ；1-15:攜帶珍汕97型等位基因的株系；16-30:攜帶密陽46型等位基因的株系O
[0013]圖4為分子標(biāo)記Si2926/?a I在66份秈型雜交稻親本中的檢測結(jié)果。其中，1:11-32B ；2:D優(yōu)62B ；3:V20B ；4:博B ；5:川香29A ；6:菲改B ；7:豐源 A ;8:岡 46B ；9:金 23B ；10:龍?zhí)仄諦 ;11:內(nèi)香2A ；12:內(nèi)香85A ；13:天豐A ;14:協(xié)青早B ;15:印32B ；16:優(yōu)IB ；17:珍汕 97B ；18:中 100A ；19:中 IA ;20:中 2B ；21:中 3B ;22:中 9B ；23:中浙 A ;24:207 ；25:253 ；26:926:27:CDR22 ；28:R402 ；29:To974 ；30:ZDZ057 ；31:測 64 ；32:多系 I 號；33:恩恢 58 ；34:輻恢 718 ；35:廣恢 128 ；36:桂 99 ；37:江恢 151 ；38:瀘恢 17 ；39 ;密陽 46 ；40:綿恢501 ；41:綿恢725 ；42:明恢63 ；43:明恢70 ;44:明恢77 ;45:明恢86 ；46:蜀恢162 ；47:蜀恢 527 ；48:鹽恢 559 ；49:宜恢 1577 ；50:鎮(zhèn)恢 084 ；51:CH238 ；52:CH59 ；53:中恢218 ；54:中恢 8006 ；55:中恢 111 ；56:中恢 1176 ；57:中恢 333 ；58:中恢 161 ；59:特青；60:IR24 ；61:中恢 8012 ；62:中恢 8015 ；63:中恢 465 ；64:中恢 7492 ；65:R600 ；66:恢 66。

【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0015]實(shí)施例1 61!?基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)
1.等位基因氨基酸序列比對及特異氨基酸位點(diǎn)的鑒定
利用序列比對軟件DNASTAR MegAlign模塊(Lasergene)對珍汕97和密陽46在基因座位上氨基酸序列(專利號:ZL 201210047301.0，SEQ ID No:3和SEQ ID No:6)進(jìn)行序列比對分析。鑒定到GY6蛋白在6個氨基酸位點(diǎn)上存在差異，分別為A3IV、K105E、N144S、K146R、D147N 以及 A160T (圖1)。
[0016]2.0?基因特異性分子標(biāo)記引物的設(shè)計
針對上述6個氨基酸差異位點(diǎn)中的第31位氨基酸位點(diǎn)，根據(jù)CAPS標(biāo)記設(shè)計原理，應(yīng)用在線軟件 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和 Oligo 7.0 (Molecular B1logy Insights)設(shè)計引物。其上游引物序列為5’ -CCGGATCACTAACCTCAGCG-3’，下游引物序列為 5’ -GCATCCAAGATATGATCCGTA-3’。
[0017]3.DNA微量提取
(I)剪取水稻幼苗葉片2?3 cm，剪成0.5 cm長的碎片，放入2.0 mL離心管中。
[0018](2)加入450 μ I DNA提取液和一顆鋼珠，應(yīng)用組織研磨儀進(jìn)行研磨。
[0019](3)加入450 μ I氯仿萃取液，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。
[0020](4) 11，000 rpm離心2分鐘至清晰分相。吸取上清液400 μ 1，轉(zhuǎn)入新的1.5 ml尚;匕、官中，棄槍頭。
[0021](5)加入800 μ I預(yù)冷的無水乙醇，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。_20°C放置30分鐘。
[0022](6) 11，000 rpm離心3分鐘至沉淀附于離心管底部，棄上清液。
[0023](7)用70%乙醇洗滌沉淀2遍，將1.5 ml離心管倒置于紙上，自然干燥。
[0024](8)加入100 μ I的1/10XTE緩沖液溶解沉淀。
[0025](9 )取 2 μ I 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
[0026]4.PCR擴(kuò)增及檢測
擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:10XPCR Buffer 2 μ I, dNTPs (2.5 mM each) 1.6 μ?，引物(5pmol) 2 μ I, Taq 酶(2.5 U/μΙ，Cwb1)0.2 μ?，DNA 模板(50 ng/ μ I) 2 μ?，加 ddH20至 20 μ 1 反應(yīng)條件:94°C 2 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，30 循環(huán)；72°C 8分鐘；10°C保存。
[0027]取2 μ I PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠，接通電極，在100V恒定電壓下電泳I小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，GelRed (B1tium)染色后凝膠成像。
[0028]5.PCR產(chǎn)物酶切及檢測
酶切反應(yīng)體系如下:10XBuffer M 2 μ 1，限制性內(nèi)切酶胤a I (Takara) I μ I, PCR產(chǎn)物7 4 1，加(1(1!120至20 4 1;反應(yīng)條件:37°0 3小時。
[0029]取10 μ I PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠，接通電極，在100V恒定電壓下電泳1.5小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，GelRed (B1tium)染色后凝膠成像。
[0030]結(jié)果顯示，應(yīng)用Si2926引物擴(kuò)增珍汕97和密陽46，其PCR產(chǎn)物大小均為155 bp,經(jīng)通a I酶切后，珍汕97獲得135 bp的片段，而密陽46保持不變(圖2)。
[0031]實(shí)施例2 0?基因特異性分子標(biāo)記在近等基因系群體中的驗(yàn)證
以衍生于珍汕97/密陽46的I套近等基因系群體為材料，該群體只在CM區(qū)間分離，含珍汕97和密陽46兩種基因型，與后者相比，前者實(shí)粒數(shù)多、千粒重大、產(chǎn)量高，對仍^基因特異性分子標(biāo)記Si2926//*a I進(jìn)行功能驗(yàn)證。應(yīng)用實(shí)施例1中描述的PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件，利用Si2926/?a I進(jìn)行擴(kuò)增和酶切。
[0032]電泳結(jié)果(圖3)顯示，Si2926/通a I在近等基因系群體中呈現(xiàn)分離，實(shí)粒數(shù)多、千粒重大、產(chǎn)量高的株系(1-15號)都檢測出與珍汕97 —樣的帶型，表明它們均攜帶珍汕97型高產(chǎn)等位基因；反之，其余株系(16-30號)則攜帶密陽46型等位基因。該結(jié)果表明，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記Si2926/?a I對CM高產(chǎn)等位基因的檢測可靠性高，可以作為0?基因的功能特異性分子標(biāo)記，應(yīng)用于CM高產(chǎn)等位基因的轉(zhuǎn)育研宄中。
[0033]實(shí)施例3 0?基因特異性分子標(biāo)記在水稻種質(zhì)資源中的檢測利用基因功能特異性分子標(biāo)記Si2926//*a I，對66份秈型雜交稻親本進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，17份親本攜帶珍汕97型等位基因，49份親本攜帶密陽46型等位基因(圖4)。
【權(quán)利要求】
1.檢測水稻高產(chǎn)等位基因的功能特異性分子標(biāo)記Si2926/?a I的引物，其特征在于:其上游引物序列為5’-CCGGATCACTAACCTCAGCG-3’，如序列表SEQ ID No:1所示；其下游引物序列為 5’ -GCATCCAAGATATGATCCGTA-3’，如序列表 SEQ ID N0.2 所示。
【文檔編號】C12N15/11GK104450897SQ201410681948
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】樊葉楊, 莊杰云, 朱玉君 申請人:中國水稻研究所