PML-RARα融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種PML-RARα融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的引物和試劑盒；解決以往白血病微小殘留病檢測中易出現(xiàn)假陽性、檢測成本高、操作復(fù)雜、檢測時間長的問題，根據(jù)PML-RARα基因序列，利用PrimerExplorer V4軟件設(shè)計多組引物，篩選到一對特異性內(nèi)引物F3、B3和一對特異性外引物FIP、BIP，并且建立了急性早幼粒白血病微小殘留病PML-RARα基因檢測的試劑盒。本試劑盒擴(kuò)增效率高、特異性好、對儀器設(shè)備要求低，只需要恒溫水浴鍋即可，臨床上容易做到，檢測時間不超過1個小時，比常規(guī)PCR節(jié)約一半以上時間。
【專利說明】PML-RAR α融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的引物和 試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因的快速檢測方法，尤其涉及一種PML-RARa融合基因的環(huán)介導(dǎo)等 溫擴(kuò)增檢測方法的引物和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL)是臨床上最兇險的一類非淋巴細(xì)胞白血病，由于誘 導(dǎo)分化劑全反式維甲酸和三氧化二砷的應(yīng)用，APL完全緩解率已達(dá)到80%以上。但白血病 復(fù)發(fā)一直是困擾臨床進(jìn)行緩解后鞏固、維持治療及影響患者總生存期的主要障礙，而復(fù)發(fā) 的根源主要是來自體內(nèi)殘留白血病細(xì)胞,即急性白血病微小殘留病（MRD)。緩解后的白血病 患者需要定期檢測微小殘留細(xì)胞以預(yù)防復(fù)發(fā)，簡便而準(zhǔn)確的快速檢測將會極大方便患者復(fù) 查，提高復(fù)查率，及時就醫(yī)，提高存活率。染色體t (15 ; 17) (q22 ;q21)易位，形成PML-RARa 融合基因是APL的特異性標(biāo)志，陽性率約占98%。檢測PML-RARa融合基因表達(dá)，可以了解 白血病細(xì)胞在治療中的消減情況，對監(jiān)測MRD具有重要意義。
[0003] 目前檢查PML-RAR a基因主要通過PCR或?qū)崟r熒光定量PCR。PCR耗時長、靈敏度 和特異性低、儀器要求高。實時熒光定量PCR方法雖然特異性和靈敏度有所提高，但是需要 產(chǎn)生熒光的引物和探針，還需要昂貴的檢測設(shè)備，而且需要2-3個小時。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是 2000 年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循 環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以不依賴任何專門的儀器 設(shè)備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，該方法推廣期主要面對微 生物檢測，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物檢測領(lǐng)域，并有很多相關(guān)專利獲得授權(quán)，但因研究人 員了解不足，而且人體基因比微生物更復(fù)雜，目前國內(nèi)外均未見使用LAMP方法檢測白血病 PML-RARa基因的報道。
[0005] 針對同一段基因序列設(shè)計的LAMP引物存在擴(kuò)增效率和特異性等多方面差異， LAMP引物可以通過軟件自動生成，但是否能從眾多引物組中篩選到快速、特異的引物是 LAMP法檢測基因的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種PML-RAR a融合基因的環(huán)介導(dǎo)等 溫擴(kuò)增檢測方法的引物和試劑盒。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種PML-RARa融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的引物，由內(nèi)引物F3:其核 苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；內(nèi)引物B3:其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；外引物FIP : 其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；外引物BIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0009] 上述引物在檢測急性白血病微小殘留病中的應(yīng)用。
[0010] 一種PML-RARa融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的試劑盒，內(nèi)含LAMP反應(yīng) 液、陽性對照、陰性對照，所述LAMP反應(yīng)液的成分為：0. 04 μ mol/ μ L pH 8. 8的Tris-HCl， 0. 02 μ mol/ μ L KC 1,0. 016ymol / μ L MgSO4, 0. 02 μ mol/ μ L (HN4) 2S〇4? 〇· 〇〇2 μ 1/ μ L Tween2tl, 6 μ mol/μ L 甜菜堿，0· 0028 μ mol/μ LX 4 種 dNTPs，IOU/μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶，8U/μ L Bst DNA 聚合酶，0· 00005 μ mol/ μ L I丐黃綠素，0· 2pmol/ μ L F3,0· 2pmol/ μ L Β3,1. 6pmol/ μ L FIP, I. 6pmol/y L BIP ；
[0011] 所述陽性對照為：反應(yīng)時在反應(yīng)液中加入PML-RARa RNA表達(dá)陽性的ΝΒ4細(xì)胞的基 因組RNA ;
[0012] 陰性對照為：反應(yīng)時在反應(yīng)液中加入超純水。
[0013] PML-RAR a融合基因 mRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0014] 上述試劑盒中LAMP反應(yīng)液為1ml、陽性對照50 μ L、陰性對照1ml。
[0015] 上述試劑盒還包括：反應(yīng)管50個，10 μ L移液器頭100個。
[0016] 上述試劑盒的使用方法：取20 μ L反應(yīng)液置于反應(yīng)管中，將5 μ L待檢RNA加入反 應(yīng)液內(nèi)，用移液器吹打混勻，蓋好反應(yīng)管的蓋子，將反應(yīng)管置于水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條 件為：60-65°C水浴恒溫反應(yīng)25-30min ;用戶在初次使用時需要設(shè)置陰性對照和陽性對照。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] 為了解決以往白血病微小殘留病檢測中易出現(xiàn)假陽性、檢測成本高、操作復(fù)雜、檢 測時間長的問題，本發(fā)明篩選到用LAMP法檢測PML-RARa基因的引物，建立了急性早幼粒 白血病微小殘留病PML-RARa基因檢測的基因及試劑盒。反應(yīng)液中預(yù)先加有逆轉(zhuǎn)錄酶，逆 轉(zhuǎn)錄和基因擴(kuò)增一步完成，而不需要預(yù)先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行DNA擴(kuò)增，簡化了操 作步驟。
[0019] 本試劑盒擴(kuò)增效率高、特異性好、對儀器設(shè)備要求低，只需要恒溫水浴鍋即可，臨 床上容易做到，檢測時間不超過1個小時，比常規(guī)PCR節(jié)約一半以上時間，而且PCR結(jié)束之 后需要通過電泳判斷結(jié)果，電泳所用DNA染料EB有劇毒。相比之下，采用本試劑盒，實現(xiàn)了 基因擴(kuò)增和結(jié)果判定一步完成，操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確直觀、特異性與敏感性高、對人體安全、 不污染環(huán)境，適合于各級醫(yī)院快速診斷M2型急性白血病微小殘留病，排除了基層醫(yī)院難以 開展此類檢查的障礙，患者可以就近檢查，而不用再長途奔波到條件好的大醫(yī)院，方便了患 者，節(jié)省了費(fèi)用，為救治生命節(jié)約了寶貴時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為裸眼目視觀察反應(yīng)結(jié)果，其中，1號管為檢測管，2號管為陽性對照，3號管為 陰性對照；
[0021] 圖2為靈敏度檢測，其中，1-6號管中加入的為倍比稀釋的RNA，濃度依次為2000、 200、20、2、0. 2、0. 02ng/y 1，1-4 號為陽性，5-6 號為陰性；
[0022] 圖3為目視檢測試劑盒特異性結(jié)果，1-5號管為白血病患者樣本，6號管為NB4細(xì) 胞，7-11號管為正常人樣本；1-6號為陽性，7-11為陰性。

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0024] 實施例1
[0025] 1.材料與方法
[0026] I. 1樣本：用培養(yǎng)的NB4細(xì)胞的基因組總RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品用于本方法的建立，臨床 樣本采用抗凝外周血或骨髓〇. 2-1. 0ml。
[0027] 1. 2基因組總RNA提取：利用商品化的RNA提取試劑盒（購自北京天恩澤生物技 術(shù)有限公司，型號為3701-50)抽提總RNA，室溫操作。
[0028] 抽提總RNA具體操作步驟：
[0029] (1)將0· 2-1. 5mL抗凝全血13000g離心3分鐘，棄上清；
[0030] ⑵將ImL溶液A加入到血液細(xì)胞沉淀中，用移液槍吹打沉淀使細(xì)胞裂解；
[0031] (3)將〇· 3mL的溶液B和0· 2mL氯仿加入離心管，劇烈震蕩30秒，13000g離心5 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中；
[0032] (4)加入0· 5mL的溶液C和0· 2mL的氯仿到上清液中，劇烈搖晃30秒，13000g室 溫離心3分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中；
[0033] (5)在上清液中加入體積為其1/2的溶液D，劇烈搖晃30秒，13000g離心5分鐘， 移棄上清液；
[0034] (6)在離心管中加入ImL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒，離心 13000g 1分鐘，吸棄上清液；
[0035] (7)室溫放置2分鐘，加入10-30 μ L無 RNase水使RNA沉淀溶解，即為總RNA。
[0036] 1.3引物設(shè)計及篩選
[0037] 根據(jù) PML-RARa 基因序列，利用 Primer Explorer V4 軟件（https:// primerexplorer. jp)設(shè)計多組引物，每引物組包括一對特異性內(nèi)引物F3、B3和一對特異性 外引物FIP、BIP，根據(jù)反應(yīng)時間及特異性對不同引物的反應(yīng)進(jìn)程和結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測、篩選，確 定反應(yīng)快、特異性高的最佳引物。篩選到的引物序列見表1。
[0038] 表1篩選到的PML-RAR a融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的最佳引物名稱與 序列
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種PML-RARa融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的引物，其特征在于，由內(nèi)引 物F3:其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；內(nèi)引物B3:其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 外引物FIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；外引物BIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示。
2. -種PML-RARa融合基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的試劑盒，其特征在于， 內(nèi)含LAMP反應(yīng)液、陽性對照、陰性對照，所述LAMP反應(yīng)液的成分為：0. 04 ii mol/ii L pH 8.8 的 Tris-HCl，0.01iimol/iiL KCl，0.016iimol/iiL MgS04,0.01iimol/iiL(HN4)2S04， 0? 04 ii 1/20 ii L Tween2(l，1. 6 ii mol/ ii L 甜菜堿，0? 056 ii mol/ ii L x 4 種 dNTPs，200U/ ii L 逆 轉(zhuǎn)錄酶，160U/ ii L Bst DNA 聚合酶，50pmol/ ii L 鈣黃綠素，1. 6pmol/ ii L 引物 F3,1. 6pmol/ U L 引物 B3,0. 2pmol/ii L 引物 FIP，0. 2pmol/ii L 引物 BIP ; 所述陽性對照為：反應(yīng)時在反應(yīng)液中加入PML-RARa表達(dá)陽性的NB4細(xì)胞基因組總 RNA ;陰性對照為：反應(yīng)時在反應(yīng)液中加入超純水。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，LAMP反應(yīng)液為lml、陽性對照50 ii L、陰性 對照lml。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，上述試劑盒還包括：反應(yīng)管50個，10 y L 移液器頭100個。
5. 如權(quán)利要求3-4任一所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，取20 y L反應(yīng)液置于反 應(yīng)管中，將5 ii L待檢RNA加入反應(yīng)液內(nèi)，用移液器吹打混勻，蓋好反應(yīng)管的蓋子，將反應(yīng)管 置于水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：60_65°C水浴恒溫反應(yīng)25-30min。
6. 如權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征在于，初次使用本試劑盒時設(shè)置陰性對照和 陽性對照。
【文檔編號】C12N15/11GK104328211SQ201410682429
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】姜國勝, 李奉京 申請人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 北京藍(lán)譜生物技術(shù)開發(fā)有限公司