一種體外酶反應(yīng)生成1,2,4-丁三醇的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種體外酶反應(yīng)生成1,2,4-丁三醇的方法及應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所提供的方法是分別構(gòu)建過表達(dá)D-木糖酸脫水酶基因、2-酮酸脫羧酶基因和醇脫氫酶基因的基因工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)所得基因工程菌后，再利用超聲波破碎菌體，收集粗酶液，混合調(diào)整D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶濃度后，加入反應(yīng)底物后合成1,2,4-丁三醇。本發(fā)明所提供的方法實(shí)現(xiàn)了在體外通過控制酶反應(yīng)以D-木糖酸為原料合成1,2,4-丁三醇，具有便于擴(kuò)大生產(chǎn)的特點(diǎn)，擴(kuò)大后產(chǎn)量可達(dá)到5.98g/L。
【專利說明】一種體外酶反應(yīng)生成1,2,4- 丁三醇的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種體外酶反應(yīng)生成1，2，4- 丁三醇的方法及應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]1，2，4-丁三醇(BT)是一種無色、無臭、透明的水溶性粘稠糖漿狀多元醇，其主要用作有機(jī)合成的化學(xué)中間體，廣泛應(yīng)用于軍工、醫(yī)藥、煙草、化妝品、造紙、農(nóng)業(yè)和高分子材料領(lǐng)域。其硝基化合物1，2，4-丁三醇三硝酸酯是具有民用和軍用潛力的高能塑化劑，它可以代替硝化甘油作為高能、高新配方推進(jìn)劑。BT在醫(yī)藥上，可作緩釋劑，控制藥物的釋放速度，是用于合成抗病毒化合物、血小板活性因子等多種藥物制備的關(guān)鍵中間體。在高分子材料領(lǐng)域，可用作高分子材料的交聯(lián)劑；另外BT還可用作高級墨水的防干劑、高級服裝的表面處理劑、陶瓷加工助劑、特殊用途包裝與儲運(yùn)等。
[0003]目前，1，2，4-丁三醇利用酯化的D，L_蘋果酸(如蘋果酸二甲酯)在NaBH4的作用下，于C2_6醇和四氫呋喃的混合物中進(jìn)行高壓催化氫化反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。然而，這種途徑中約25%的原料用于副產(chǎn)物的產(chǎn)生，這不僅限制了丁三醇的產(chǎn)量而且增加了分離提純的難度。此外，化學(xué)合成法存在反應(yīng)條件苛刻、污染物排放嚴(yán)重等諸多缺點(diǎn)，部分研宄者將目光轉(zhuǎn)向更為經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的生物合成技術(shù)。
[0004]Niu等人首次實(shí)現(xiàn)了雙微生物工藝法合成丁三醇(Niu ff, Molefe MN，F(xiàn)rostJ:Microbial synthesis of the energetic material precursor 1，2，4-butanetr1l.Journal of the American Chemical Society 2003, 125:12998-12999) 0 在這個過程具體為:D-木糖在假單胞菌的作用下轉(zhuǎn)化成D-木糖酸，產(chǎn)率70% (mol/mol)，再由大腸埃希氏菌DH5a/pWN6.186A催化D-木糖酸轉(zhuǎn)化成D_l，2，4_ 丁三醇，產(chǎn)率25% (moI/mol) ；L-阿拉伯糖在P.fragi的氧化下轉(zhuǎn)化成L-阿拉伯_1，4-內(nèi)醋和L-阿拉伯糖酸的混合物，總產(chǎn)率54% (mol/mol)，內(nèi)酯水解后，L-阿拉伯糖酸采用E.coli BL21(DE3)/pffN6.222k轉(zhuǎn)化生成L-1，2，4- 丁三醇，產(chǎn)率35 % (mol/mol)。Liu等構(gòu)建了一株工程大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了利用單一宿主菌從D-木糖到1，2，4- 丁三醇的生產(chǎn)(ValdehuesaKNG, Liu H, Ramos KRM, Park SJ, Nisola GM, Lee ff-K, Chung ff-J:Direct b1convers1nof d-xylose to I,2,4-butanetr1l in an engineered Escherichia col1.ProcessB1chemistry2014, 49:25-32)。通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h后，丁三醇產(chǎn)量達(dá)到0.88g/l，摩爾產(chǎn)率是12.82%。雖然微生物法合成丁三醇已有報(bào)道，但由于微生物代謝的復(fù)雜性，體內(nèi)合成不易調(diào)控，丁三醇的產(chǎn)量、產(chǎn)率等指標(biāo)等過低，難以進(jìn)行工程化放大。而體外酶反應(yīng)法具有可調(diào)控、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在重要化學(xué)品合成領(lǐng)域中具有廣泛的實(shí)用潛力。實(shí)際上，酶法反應(yīng)已應(yīng)用于藥物、食品添加劑等精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)合成[張震元，氨基酸的酶法合成，食品與發(fā)酵工業(yè) 1985，02 ;Gross RA, Kumar A, Kalra B:Polymer synthesis by in vitroenzyme catalysis.Chemical Reviews 2001, 101:2097-2124.] o 通過非細(xì)胞的體外反應(yīng)，可以在體外研宄最佳的反應(yīng)體系。通過精確控制各酶的含量及添加相關(guān)的輔助因子，找出整個代謝途徑中的關(guān)鍵因素，尋找關(guān)鍵步驟，確定關(guān)鍵酶，為細(xì)胞內(nèi)代謝途徑優(yōu)化提供參考依據(jù)。通過體外反應(yīng)找到限制性酶，也可以對其進(jìn)行改造從而提高終產(chǎn)物量。目前，尚未有報(bào)道以D-木糖酸為底物，利用體外酶催化合成1，2，4- 丁三醇的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種體外酶反應(yīng)生成1，2，4- 丁三醇的方法，所采取的技術(shù)方案如下:
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種體外酶反應(yīng)生成1，2，4- 丁三醇的方法，該方法是分別構(gòu)建過表達(dá)D-木糖酸脫水酶基因、2-酮酸脫羧酶基因和醇脫氫酶基因的基因工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)所得基因工程菌后，再利用超聲波破碎菌體，收集粗酶液，混合調(diào)整D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶濃度后，加入反應(yīng)底物后合成1，2，4- 丁三醇。
[0007]所述方法的步驟如下:
[0008]I)分別將D-木糖酸脫水酶基因yjhG、2-酮酸脫羧酶基因mdlC和醇脫氫酶基因adhP導(dǎo)入到宿主菌中獲得三種基因工程菌；
[0009]2)培養(yǎng)步驟2)所得的三種基因工程菌，分別過表達(dá)D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶；
[0010]3)利用超聲波破碎步驟2)所培養(yǎng)的基因工程菌，收集粗酶液；
[0011]4)混合步驟3)所得的粗酶液，調(diào)整D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的濃度，加入反應(yīng)底物后，合成1，2，4-丁三醇。
[0012]步驟I)所述基因可不做具體限定，只要任何基因合成的蛋白質(zhì)具有所述功能即可。但是，優(yōu)選，D-木糖酸脫水酶基因yjhG，GenBank登錄號為12931979 ;所述2-酮酸脫羧酶基因mdlC，GeneBank登錄號AAC15502.1 ;所述醇脫氫酶基因adhP，GeneBank登錄號為946036 ;所述宿主菌，為大腸桿菌。
[0013]步驟2)所述培養(yǎng)基因工程菌，是將已構(gòu)建的基因工程菌接種到100ml LB培養(yǎng)基中，搖床370C 180rpm培養(yǎng)至OD600為0.6-1.0，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol.廠1，20°C培養(yǎng)12-18h，4°C 4200rpm離心5min收集菌體，最后用5ml pH7.0Hepes緩沖液洗滌兩次。
[0014]步驟3)所述超聲波破碎，是在22kHz，150W的條件下處理30min，破碎后在4°C，15000rpm離心lOmin，收集上清，獲得粗酶液。
[0015]步驟4)所述調(diào)整D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的濃度，是將D-木糖酸脫水酶的濃度調(diào)整為0.39-0.5mg/ml，2-酮酸脫羧酶的濃度調(diào)整為0.05-0.5mg/ml，醇脫氫酶的濃度調(diào)整為0.39mg/mlo
[0016]步驟4)所述加入反應(yīng)底物，是使最終反應(yīng)體系為:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mM D-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mM ThDP ;所述合成 1，2，4-丁三醇，合成條件為:反應(yīng)溫度30°C，反應(yīng)時間12-24h。
[0017]所述方法的具體步驟為:
[0018]I)分別將D-木糖酸脫水酶基因yjhG、2-酮酸脫羧酶基因mdlC和醇脫氫酶基因adhP構(gòu)建入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體pET-30a中，獲得重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中獲得三種大腸桿菌基因工程菌；
[0019]所述D-木糖酸脫水酶基因yjhG，GenBank登錄號為12931979 ;所述2-酮酸脫羧酶基因mdlC，GeneBank登錄號AAC15502.1 ;所述醇脫氫酶基因adhP，GeneBank登錄號為946036 ；
[0020]2)將步驟I)所得的大腸桿菌基因工程菌接種到100ml LB培養(yǎng)基中，搖床370C 180rpm培養(yǎng)至006(|(|為0.6-1.0，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol培養(yǎng)12_18h，4°C 4200rpm離心5min收集菌體，最后用5ml pH7.0Hepes緩沖液洗滌兩次；
[0021]3)收集步驟2)所得的大腸桿菌基因工程菌菌體，利用!fepes緩沖液重新懸浮后再利用超聲波進(jìn)行破碎處理，破碎是在22kHz，150W的條件下處理30min，破碎后在4°C，15000rpm離心lOmin，收集上清，獲得粗酶液；
[0022]4)混合步驟3)所得的粗酶液，將D-木糖酸脫水酶的濃度調(diào)整為0.5mg/ml，2-酮酸脫羧酶的濃度調(diào)整為0.5mg/ml,醇脫氫酶的濃度調(diào)整為0.39mg/ml,加入反應(yīng)底物至最終體系為 50mM Hepes buffer pH7.0, 1mM D-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH，0.375mM ThDP，在 30°C 下，反應(yīng) 24h。
[0023]所述方法用于生產(chǎn)1，2，4- 丁三醇。
[0024]本發(fā)明獲得的有益效果如下:
[0025]1.本發(fā)明構(gòu)建的方法實(shí)現(xiàn)了在體外利用酶反應(yīng)以D-木糖酸為原料合成1，2，4-丁三醇；
[0026]2.利用本發(fā)明方法，精確調(diào)控各酶的用量，提高了體外合成1，2，4- 丁三醇能力；
[0027]3.找到1，2，4-丁三醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，可以對其進(jìn)行改造，提高其活性，從而提尚廣物量；
[0028]4.構(gòu)建一個可控的調(diào)控體系，控制1，2，4-丁三醇的合成，同時為細(xì)胞內(nèi)的異1，2，4- 丁三醇合成代謝調(diào)控提供依據(jù)；
[0029]5.體外反應(yīng)可以縮短生產(chǎn)周期，本發(fā)明僅需12_24h即可獲得產(chǎn)物，如果用傳統(tǒng)微生物發(fā)酵最少需要48-72h。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為1，2，4- 丁三醇合成途徑中3種酶的SDS-PAGE檢測圖；
[0031 ] (M，marker ;I，為 yjhD 粗酶液；2，為 mdlC 粗酶液；3，為 adhP 粗酶液)。
[0032]圖2為1，2，4-丁三醇液相圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0034]以下實(shí)施例所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，均可從商業(yè)渠道獲得。
[0035]以下實(shí)施例中所用的D-木糖酸脫水酶是來自大腸桿菌的基因，2-酮酸脫羧酶是來自Pseudomonas putida的基因，醇脫氫酶是來自大腸桿菌的基因。將各基因分別連接到pET-30a(+)表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3);得到的陽性克隆培養(yǎng)至OD_為0.6-1.0，加 IPTG 終濃度為 0.5mmol.1^，20°〇培養(yǎng) 12_18h 獲得。
[0036]實(shí)施例1
[0037]I, 2，4- 丁三醇合成代謝相關(guān)酶的粗酶液制備，其具體步驟如下:
[0038](I)利用yjhG基因5’端和3’端引物引入酶切位點(diǎn)(NcoI和EcoRI)，對yjhG基因和pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切，然后將yjhG基因連接到pET_30a(+)載體上；
[0039](2)利用mdlC基因5’端和3’端引物引入酶切位點(diǎn)(NcoI和EcoRI)，對mdlC基因和pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切，然后將mdlC基因連接到pET-30a(+)載體上；
[0040](3)利用adhP基因5’端和3’端引物引入酶切位點(diǎn)(NcoI和EcoRI)，對adhP基因和pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切，然后將adhP基因連接到pET_30a(+)載體上；
[0041](4)將步驟(I)、⑵、(3)構(gòu)建的相應(yīng)的三個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，得到陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)；
[0042](5)以構(gòu)建的重組大腸桿菌接種于10ml LB培養(yǎng)基中，搖床37 °C 180rpm培養(yǎng)至OD600為0.6-1.0，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol培養(yǎng)12-18小時，4°C 4200rpm離心5min收集菌體，用5ml pH7.0Hepes緩沖液洗滌兩次，超聲波破碎:22kHz, 150W, 30分鐘。破碎液后4°C，15000rpm離心lOmin，收集上清，即為粗酶液。粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，如圖1所示。
[0043]實(shí)施例2
[0044]I, 2，4- 丁三醇合成代謝相關(guān)酶的體外反應(yīng)，其具體步驟如下:
[0045](I)分別取10ml表達(dá)上述三個酶的大腸桿菌培養(yǎng)液4200rpm, 4°C離心5min，棄上清液，用50mM pH 7.0Hepesbuffer洗滌兩次，最后使用5ml Hepesbuffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C離心lOmin，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測定蛋白含量。
[0046](2)步驟(I)制得的D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶加入反應(yīng)體系，保持D-木糖酸脫水酶濃度為0.39mg/ml，2-酮酸脫羧酶濃度為0.05mg/ml，醇脫氫酶濃度為0.39mg/ml，并加入其它反應(yīng)物質(zhì)，最終體系為:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mM D-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH,0.375mM ThDP。
[0047](3)將步驟(2)混合液用水補(bǔ)足體系為400 μ 1，30°C反應(yīng)24h。高效液相色譜檢測1，2，4- 丁三醇，如圖2所示，其產(chǎn)量為42.84mg/l。
[0048]實(shí)施例3
[0049]中間水平1，2，4- 丁三醇體外合成，其具體步驟如下:
[0050](I)分別取10ml表達(dá)上述三個酶的大腸桿菌培養(yǎng)液4200rpm，4°C離心5min，棄上清液，用50mM pH 7.0Hepes buffer洗滌兩次，最后使用5ml Hepes buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C離心lOmin，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測定蛋白含量。
[0051](2)步驟(I)制得的D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶加入反應(yīng)體系，保持D-木糖酸脫水酶濃度為0.39mg/ml，2-酮酸脫羧酶濃度為0.5mg/ml，醇脫氫酶濃度為0.39mg/ml，并加入其它反應(yīng)物質(zhì)，最終反應(yīng)體系為:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mM D-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH,0.375mM ThDP。
[0052](3)將步驟(2)混合液用水補(bǔ)足體系為400 μ 1，30°C反應(yīng)24h。高效液相色譜檢測1，2，4-丁三醇，其產(chǎn)量為153.lmg/lo
[0053]實(shí)施例4
[0054]高水平1，2，4- 丁三醇體外合成，其具體步驟如下:
[0055](I)分別取10ml表達(dá)上述三個酶的大腸桿菌培養(yǎng)液4200rpm，4°C離心5min，棄上清液，用50mM pH 7.0Hepes buffer洗滌兩次，最后使用5ml Hepes buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C離心lOmin，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測定蛋白含量。
[0056](2)步驟(I)制得的D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶加入反應(yīng)體系，保持D-木糖酸脫水酶濃度為0.5mg/ml，2-酮酸脫羧酶濃度為0.5mg/ml，醇脫氫酶濃度為0.39mg/ml，并加入相應(yīng)的反應(yīng)物質(zhì)。最終反應(yīng)體系為:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mMD-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mM ThDP。
[0057](3)將步驟(2)混合液用水補(bǔ)足體系為400 μ 1，30°C反應(yīng)24h。高效液相色譜檢測1，2，4- 丁三醇，其產(chǎn)量為 239.25mg/l。
[0058]實(shí)施例5
[0059]放大水平1，2，4- 丁三醇體外合成，其具體步驟如下:
[0060](I)分別取10ml表達(dá)上述三個酶的大腸桿菌培養(yǎng)液4200rpm，4°C離心5min，棄上清液，用50mM pH 7.0Hepes buffer洗滌兩次，最后使用5ml Hepes buffer重懸；然后用超聲破碎儀破碎(22kHz, 150w)，破碎30min，破碎液15000rpm 4°C離心lOmin，將上清與沉淀分離，保留上清液，加入10%甘油，按試劑盒方法測定蛋白含量。
[0061](2)步驟(I)制得的D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶加入反應(yīng)體系，保持D-木糖酸脫水酶濃度為0.5mg/ml，2-酮酸脫羧酶濃度為0.5mg/ml，醇脫氫酶濃度為0.39mg/ml，并加入相應(yīng)的反應(yīng)物質(zhì)。最終反應(yīng)體系為:50mM Hepes buffer ρΗ7.0，1mMD-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mM ThDP。
[0062](3)按實(shí)施例4的1，2，4-丁三醇合成反應(yīng)各底物的濃度比例，以水為補(bǔ)充劑，將步驟(2)混合液配制成的反應(yīng)體系按上述比例擴(kuò)大到100ml，再于30°C下反應(yīng)24h。高效液相色譜檢測1，2，4- 丁三醇，其產(chǎn)量為5.98g/Lo
[0063]雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種體外酶反應(yīng)生成1，2，4-丁三醇的方法，其特征在于，是分別構(gòu)建過表達(dá)D-木糖酸脫水酶基因、2-酮酸脫羧酶基因和醇脫氫酶基因的基因工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)所得基因工程菌后，再利用超聲波破碎菌體，獲得粗酶液，混合并調(diào)整混合液中D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶濃度后，加入反應(yīng)底物合成1，2，4- 丁三醇。
2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下: 1)分別將D-木糖酸脫水酶基因yjhG、2-酮酸脫羧酶基因mdlC和醇脫氫酶基因adhP導(dǎo)入到宿主菌中獲得三種基因工程菌； 2)發(fā)酵培養(yǎng)步驟2)所得的三種基因工程菌，分別過表達(dá)D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶； 3)利用超聲波破碎步驟2)所培養(yǎng)的基因工程菌，收集粗酶液； 4)混合步驟3)所得的粗酶液，調(diào)整混合液中D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的濃度，加入反應(yīng)底物后，合成1，2，4-丁三醇。
3.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟I)所述D-木糖酸脫水酶基因yjhG，GenBank登錄號為12931979 ;所述2-酮酸脫羧酶基因mdlC，GeneBank登錄號AAC15502.1 ;所述醇脫氫酶基因adhP，GeneBank登錄號為946036。
4.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟I)所述宿主菌，為大腸桿菌。
5.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟2)所述培養(yǎng)基因工程菌，是將已構(gòu)建的基因工程菌接種到100ml LB培養(yǎng)基中，搖床37°C 180rpm培養(yǎng)至OD6tltl為0.6-1.0，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol.?Λ20?培養(yǎng)12_18h，4°C下4200rpm離心5min收集菌體，最后用5ml pH7.0Hepes緩沖液洗滌兩次。
6.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述超聲波破碎，是在22kHz，150W的條件下處理30min，破碎后在4°C，15000rpm離心lOmin，收集上清，獲得粗酶液。
7.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)所述調(diào)整混合液中D-木糖酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的濃度，是將D-木糖酸脫水酶的濃度調(diào)整為0.39-0.5mg/ml,2-酮酸脫羧酶的濃度調(diào)整為0.05-0.5mg/ml，醇脫氫酶的濃度調(diào)整為0.39mg/ml。
8.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)所述加入反應(yīng)底物，是使最終反應(yīng)體系濃度為:50mM Hepes buffer pH7.0，1mM D-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH,0.375mMThDP ;所述合成1，2，4- 丁三醇，合成條件為:反應(yīng)溫度30°C，反應(yīng)時間12-24h。
9.權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，具體步驟為: 1)分別將D-木糖酸脫水酶基因yjhG、2-酮酸脫羧酶基因mdlC和醇脫氫酶基因adhP構(gòu)建入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體pET-30a中，獲得重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中獲得三種大腸桿菌基因工程菌； 所述D-木糖酸脫水酶基因yjhG，GenBank登錄號為12931979 ;所述2_酮酸脫羧酶基因mdlC，GeneBank登錄號AAC15502.1 ;所述醇脫氫酶基因adhP，GeneBank登錄號為946036 ； 2)將步驟I)所得的大腸桿菌基因工程菌接種到10mlLB培養(yǎng)基中，搖床37°C180rpm培養(yǎng)至OD6tltl為0.6-1.0，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol.L-1JOO培養(yǎng)12_18h，4°C 4200rpm離心5min收集菌體，最后用5mlpH7.0Hepes緩沖液洗滌兩次； 3)收集步驟2)所得的大腸桿菌基因工程菌菌體，利用H印es緩沖液重新懸浮后再利用超聲波進(jìn)行破碎處理，破碎是在22kHz，150W的條件下處理30min，破碎后在4°C，15000rpm離心lOmin，收集上清，獲得粗酶液； 4)混合步驟3)所得的粗酶液，將D-木糖酸脫水酶的濃度調(diào)整為0.5mg/ml，2-酮酸脫羧酶的濃度調(diào)整為0.5mg/ml，醇脫氫酶的濃度調(diào)整為0.39mg/ml，加入反應(yīng)底物至最終體系為 50mM Hepes buffer pH7.0, 1mM D-木糖酸鉀，6.66mM MgCl2,0.5mM NADH, 0.375mMThDP ;最后在30 °C下，反應(yīng)24h。
10.權(quán)利要求1-9所述方法，其特征在于，用于生產(chǎn)1，2，4- 丁三醇。
【文檔編號】C12P7/18GK104450798SQ201410682463
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】咸漠, 蔣昱東, 劉煒, 曹玉錦 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所