屈曲指致病基因的檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種屈曲指致病基因的檢測試劑盒及其應用，其中檢測試劑盒包括引物，該引物根據(jù)TLN2基因所有外顯子及其外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)序列設計，引物用于PCR擴增，PCR擴增的產(chǎn)物包括TLN2基因外顯子及其外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)的核苷酸序列。檢測試劑盒可應用于屈曲指致病基因的檢測，通過檢測試劑盒檢測人的TLN2基因編碼區(qū)序列是否存在突變，確定所述TLN2基因為屈曲指致病基因，檢測方便、準確率高。
【專利說明】屈曲指致病基因的檢測試劑盒及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測【技術領域】，尤其涉及一種屈曲指致病基因的檢測試劑盒，還 涉及該檢測試劑盒的應用。

【背景技術】
[0002] 屈曲指（camptodactyly，MIM114200)是指先天性或發(fā)育中出現(xiàn)的1或2個第5指 在近指端關節(jié)的永久性彎曲攣縮的手指畸形，其他手指可能受累，但一般應涉及小指。該畸 形對手指的進一步彎曲沒有影響，掌指和指節(jié)間遠端不受影響，但不能完全伸展。其中2/3 的患者屈曲指是雙側的，但其彎曲程度不一定對稱。屈曲指與外傷、系統(tǒng)性疾病或神經(jīng)性異 常無關，但感染、外傷和燒傷等環(huán)境因素可產(chǎn)生擬表型。一般先天性畸形中1%患者伴有屈 曲指，而先天性手畸形中5%患者伴有屈曲指，普通人群中屈曲指患病率為0. 1%?0.2%。 其中大部分患者無明顯功能性損傷，一般可不進行治療。約20%屈曲指患者由于無明顯功 能性損傷而未就診，該病實際發(fā)生率可能會更高。屈曲指病理學基礎并不清楚，涉及近指端 關節(jié)周圍的各個結構。引起屈曲指的因素很多，蚓狀肌止點異常是最常見的原因。其他因 素包括指屈肌腱短縮、伸肌腱的中心性滑動、骨間肌、指伸肌腱發(fā)育缺陷、指掌側皮膚、關節(jié) 囊、側副韌帶和掌板攣縮等。一般認為肌力不平衡是發(fā)生屈曲指的常見原因。指淺屈肌短 縮或異常附著、蚓狀肌異常附著于指淺屈肌腱鞘、掌指關節(jié)囊或鄰近指伸肌腱的擴張部，喪 失其屈掌指關節(jié)、伸指間關節(jié)作用，指伸肌腱發(fā)育缺陷而不能伸指，這種肌力不平衡造成指 屈肌占優(yōu)勢，引起近指端關節(jié)屈曲畸形，其他軟組織攣縮則均為繼發(fā)性改變。
[0003] 屈曲指可表現(xiàn)為一種獨立的遺傳?。ǚ蔷C合征型）或作為其他疾病或綜合征的體 征之一，超過60種綜合征伴隨屈曲指表型。Benson等將屈曲指分為3種類型：1類畸形最 常見，僅限于小指，在嬰兒期間變化明顯，男女發(fā)病率相同；II類屈曲指青春期前（7?10 歲）并不明顯，女孩發(fā)病多于男孩，此型有發(fā)展成嚴重彎曲畸形的可能；III類畸形更嚴重， 包括四肢的多個指頭，通常和多種綜合征相關。前兩種類型可歸為非綜合征型，為獨立的常 染色體顯性遺傳的畸形，后者則伴有多種其他臨床表現(xiàn)稱綜合征型。非綜合征型屈曲指是 一種常染色體顯性遺傳病，經(jīng)常伴隨指節(jié)墊表型，而指節(jié)墊是一種近指間關節(jié)背部上的皮 下結節(jié)。其屈曲指通常表現(xiàn)為散發(fā)，但對患者親屬行臨床檢查表明這是一種具有可變的外 顯率和表現(xiàn)度的常染色體顯性遺傳病，少數(shù)病例外顯不全，屈曲指在家系成員中嚴重程度 變化范圍較大。屈曲指畸形的病因是多因素的，目前病因學尚不完全明確，遺傳機制較為復 雜，治療主要針對致畸因素及其嚴重性，目前以保守治療為主，手術療效有一定差異。
[0004] 屈曲指作為眾多疾病的多向性臨床表現(xiàn)的一種，可能出現(xiàn)在常染色體顯性、隱性 遺傳或性染色體連鎖遺傳的疾病中。其遺傳機制復雜，具有臨床及遺傳異質(zhì)性。超過60種 綜合征伴隨屈曲指表型,在OMIM數(shù)據(jù)庫中至少有48種伴屈曲指體征的遺傳性疾病具有已 定位的染色體位點，如掌攣縮病、遠端關節(jié)攣縮、屈曲指-關節(jié)炎-髖內(nèi)翻-心包炎綜合征、 眼齒指發(fā)育不良、Guadalajara屈指綜合征。雖在綜合征型屈曲指中取得了一些分子遺傳 學研究進展，如染色體15q24_26. 3重復、22qll缺失、llq24. 1缺失及2pl5-16. 1微缺失等 染色體異?；騀GFR3基因p.R62IH等基因突變與屈曲指表型相關，但現(xiàn)僅由Malik等報道 一個疾病位點（CAMPDl) 3qll. 2-13. 12與非綜合征型屈曲指相關，尚未鑒定出相關的致病 基因及突變。
[0005] 由于屈曲指遺傳機制復雜，具有臨床及遺傳異質(zhì)性，目前缺乏快速、準確的檢測技 術應用于屈曲指疾病致病基因的檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于屈曲指致病基因 的檢測試劑盒，還提供了該試劑盒的應用。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種屈曲指致病基因的檢測試劑盒，該檢 測試劑盒包括引物，前述引物為根據(jù)TLN2基因所有外顯子及其外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)序列 設計的引物，前述引物用于PCR擴增，前述PCR擴增的產(chǎn)物包括TLN2基因外顯子及其外顯 子-內(nèi)含子交界區(qū)的核苷酸序列。
[0008] 進一步的，前述引物的核苷酸序列為以下引物對中的至少一對：SEQIDNO. 1和 SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7 和 SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9 和SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11 和SEQIDNO. 12、SEQIDNO. 13 和SEQIDNO. 14、SEQIDNO. 15 和SEQIDNO. 16、SEQIDNO. 17 和SEQIDNO. 18、SEQID NO. 19 和SEQIDNO. 20、SEQIDNO. 21 和SEQIDNO. 22、SEQIDNO. 23 和SEQIDNO. 24、 SEQIDNO. 25 和SEQIDNO. 26、SEQIDNO. 27 和SEQIDNO. 28、SEQIDNO. 29 和SEQID NO. 30、SEQIDNO. 31 和SEQIDNO. 32、SEQIDNO. 33 和SEQIDNO. 34、SEQIDNO. 35 和 SEQIDNO. 36、SEQIDNO. 37 和SEQIDNO. 38、SEQIDNO. 39 和SEQIDNO. 40、SEQID NO. 41 和SEQIDNO. 42、SEQIDNO. 43 和SEQIDNO. 44、SEQIDNO. 45 和SEQIDNO. 46、 SEQIDNO. 47 和SEQIDNO. 48、SEQIDNO. 49 和SEQIDNO. 50、SEQIDNO. 51 和SEQID NO. 52、SEQIDNO. 53 和SEQIDNO. 54、SEQIDNO. 55 和SEQIDNO. 56、SEQIDNO. 57 和 SEQIDNO. 58、SEQIDNO. 59 和SEQIDNO. 60、SEQIDNO. 61 和SEQIDNO. 62、SEQID NO. 63 和SEQIDNO. 64、SEQIDNO. 65 和SEQIDNO. 66、SEQIDNO. 67 和SEQIDNO. 68、 SEQIDNO. 69 和SEQIDNO. 70、SEQIDNO. 71 和SEQIDNO. 72、SEQIDNO. 73 和SEQID NO. 74、SEQIDNO. 75 和SEQIDNO. 76、SEQIDNO. 77 和SEQIDNO. 78、SEQIDNO. 79 和 SEQIDNO. 80、SEQIDNO. 81 和SEQIDNO. 82、SEQIDNO. 83 和SEQIDNO. 84、SEQID NO. 85 和SEQIDNO. 86、SEQIDNO. 87 和SEQIDNO. 88、SEQIDNO. 89 和SEQIDNO. 90、 SEQIDNO. 91 和SEQIDNO. 92、SEQIDNO. 93 和SEQIDNO. 94、SEQIDNO. 95 和SEQID NO. 96、SEQIDNO. 97 和SEQIDNO. 98、SEQIDNO. 99 和SEQIDNO. 100、SEQIDNO. 101 和 SEQIDNO. 102、SEQIDNO. 103 和SEQIDNO. 104、SEQIDNO. 105 和SEQIDNO. 106、SEQ IDNO. 107和SEQIDNO. 108、SEQIDNO. 109和SEQIDNO. 110、SEQIDNO. 111和SEQID NO. 112。
[0009] 在本發(fā)明的檢測試劑盒中，優(yōu)選的檢測試劑盒還包括用于PCR的DNA擴增酶和緩 沖液。
[0010] 在本發(fā)明的檢測試劑盒中，前述用于PCR的DNA擴增酶優(yōu)選為TaqDNA聚合酶。但 在本發(fā)明中任何用于PCR擴增的酶均可與設計的引物進行PCR擴增，并能達到相同或相似 的技術效果。
[0011] 進一步的，前述TaqDNA聚合酶的酶活為5U/μ1時，具有較好的技術效果。
[0012] 在本發(fā)明的檢測試劑盒中，前述緩沖液優(yōu)選為PCRBuffer、MgCljPdNTPMix。進 一步的，前述MgCl2的濃度為25mM、前述dNTPMix的濃度為IOmM時，具有較好的技術效果。 但在本發(fā)明中任何用于PCR擴增的緩沖液均可應用于前述引物的PCR擴增，并能達到相同 或相似的技術效果。
[0013] 進一步的，前述引物、DNA擴增酶和緩沖液的體積比為2 : 0. 15 : 4. 82時，具有 較好的技術效果。
[0014] 作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種前述檢測試劑盒在屈曲指致病基因 檢測中的應用，前述應用方法為：通過試劑盒檢測人的TLN2基因序列是否存在突變，確定 前述TLN2基因是否為屈曲指致病基因。
[0015] 進一步的，前述應用方法為：
[0016]Sl、將待測DNA樣品加入檢測試劑盒中進行PCR反應得到PCR反應產(chǎn)物；
[0017]S2、將前述PCR反應產(chǎn)物經(jīng)純化后進行Sanger測序得到序列，將前述序列與TLN2 基因標準序列比對，確定是否存在TLN2基因突變，確定屈曲指致病基因是否為突變基因。
[0018] 本發(fā)明的創(chuàng)新點在于：
[0019] 本發(fā)明通過對屈曲指家系進行外顯子測序及Sanger測序分析，鑒定了一個新的 非綜合征型屈曲指致病基因--TLN2,該基因定位于15q22. 2(命名為CAMPD2)區(qū)間內(nèi)，針 對其編碼區(qū)序列設計診斷引物，發(fā)明檢測試劑盒應用于PCR體外擴增DNA，結合Sanger測 序，檢測屈曲指致病基因TLN2基因的突變，應用于臨床基因診斷。
[0020] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0021] (1)本發(fā)明利用外顯子測序技術發(fā)現(xiàn)屈曲指致病的相關基因，通過設計屈曲指致 病基因TLN2所有外顯子及其外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)序列的引物，提供了一種用于屈曲指致 病基因的檢測試劑盒，該試劑盒檢測方便、便捷，準確率達到100%。
[0022] (2)本發(fā)明采用屈曲指致病基因的檢測試劑盒應用于屈曲指致病基因的檢測，有 利于明確屈曲指患者的分子診斷及分型，用于開展基因診斷和遺傳咨詢，應用于屈曲指家 系患者子代產(chǎn)前診斷，指導優(yōu)生優(yōu)育。此外，新的屈曲指致病基因的克隆，結合遺傳或表觀 遺傳修飾因素調(diào)節(jié)基因表達及構建相應的動物模型將為揭示屈曲指的發(fā)病機理提供重要 線索，進一步闡明人類肢體發(fā)育異常的病理機制，有助個體化診斷及治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例 中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。
[0024] 圖1為非綜合征型屈曲指家系圖，其中M表示定位在15號染色體上TLN2基因 c.C1016T(p.S339L)突變，N表示正常（normal)。
[0025] 圖2為屈曲指家系成員15號染色體上TLN2基因測序結果圖；其中A表示正常者 (IV:2)測序圖；B表示患者（IV:1)測序圖示c.C1016T(p.S339L)突變。
[0026] 圖3為TLN2基因同源性比較分析（BLAST結果）示339位絲氨酸（S)在多個物種 中高度保守。

【具體實施方式】
[0027] 以下結合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而 限制本發(fā)明的保護范圍。
[0028] 以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0029] 本發(fā)明采集到一個四代常染色體顯性遺傳的非綜合征型屈曲指家系（圖1)的外 周靜脈血樣本l〇ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，常規(guī)苯酚-氯仿法提取基因組DNA，將提取得到的基 因組DNA經(jīng)分光光度計測DNA濃度和OD值后稀釋至IOOng/μ1，用于后續(xù)外顯子組測序。
[0030] 本次共采集了家系內(nèi)23名成員（9名患者和14名正常者）的血液樣本及相關詳 細臨床資料，家系內(nèi)絕大部分患者為雙側屈曲指，部分患者為單側，伴或不伴有心血管異常 (竇性心律不齊、竇性心動過緩），詳細臨床表現(xiàn)列于表1中。
[0031] 表I:TLN2p.S339L突變患者或攜帶者屈曲指表型及心臟相關特征

【權利要求】
1. 一種屈曲指致病基因的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括引物，所述引 物為根據(jù)TLN2基因所有外顯子及其外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)序列設計的引物，所述引物用于 PCR擴增，所述PCR擴增的產(chǎn)物包括TLN2基因外顯子及其外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)的核苷酸 序列。
2. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為以下引 物對中的至少一對：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、 SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41 和 SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43 和 SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45 和 SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47 和 SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49 和 SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51 和 SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53 和 SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55 和 SEQ ID NO. 56、SEQ ID NO. 57 和 SEQ ID NO. 58、SEQ ID NO. 59 和 SEQ ID NO. 60、 SEQ ID NO. 61 和 SEQ ID NO. 62、SEQ ID NO. 63 和 SEQ ID NO. 64、SEQ ID NO. 65 和 SEQ ID 勵.66、5￡〇10恥.67和5￡〇10恥.68、5￡〇10勵.69和5￡〇10勵.70、5￡〇10從).71和5￡〇 ID NO. 72、SEQ ID NO. 73 和 SEQ ID NO. 74、SEQ ID NO. 75 和 SEQ ID NO. 76、SEQ ID NO. 77 和 SEQ ID NO. 78、SEQ ID NO. 79 和 SEQ ID NO. 80、SEQ ID NO. 81 和 SEQ ID NO. 82、SEQ ID NO. 83 和 SEQ ID NO. 84、SEQ ID NO. 85 和 SEQ ID NO. 86、SEQ ID NO. 87 和 SEQ ID NO. 88、 SEQ ID NO. 89 和 SEQ ID NO. 90、SEQ ID NO. 91 和 SEQ ID NO. 92、SEQ ID NO. 93 和 SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 95 和 SEQ ID NO. 96、SEQ ID NO. 97 和 SEQ ID NO. 98、SEQ ID NO. 99 和 SEQ ID NO. 100、SEQ ID NO. 101和 SEQ ID NO. 102、SEQ ID NO. 103 和 SEQ ID NO. 104、SEQ ID NO. 105和 SEQ ID NO. 106、SEQ ID NO. 107和 SEQ ID NO. 108、SEQ ID NO. 109和 SEQ ID NO. 110、SEQ ID NO. Ill 和 SEQ ID NO. 112。
3. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括用于PCR的 DNA擴增酶和緩沖液。
4. 根據(jù)權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于PCR的DNA擴增酶為Taq DNA聚合酶。
5. 根據(jù)權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶的酶活為5U/ U 1〇
6. 根據(jù)權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述緩沖液為PCR Buffer、MgCl2和 dNTP Mix。
7. 根據(jù)權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述MgCl2的濃度為25mM、所述 dNTP Mix的濃度為10mM。
8. 根據(jù)權利要求3至7任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述引物、DNA擴增酶 和緩沖液的體積比為2 : 0.15 : 4.82。
9. 一種權利要求1至8任一項所述檢測試劑盒在屈曲指致病基因檢測中的應用，其特 征在于，所述應用方法為：通過所述檢測試劑盒檢測人的TLN2基因序列是否存在突變，確 定所述TLN2基因是否為屈曲指致病基因。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，所述應用方法為： 51、 將待測DNA樣品加入檢測試劑盒中進行PCR反應得到PCR反應產(chǎn)物； 52、 將所述PCR反應產(chǎn)物經(jīng)純化后進行Sanger測序得到序列，將所述序列與TLN2基因 標準序列比對，確定是否存在TLN2基因突變，確定屈曲指致病基因是否為突變基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357575SQ201410682484
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權日:2014年11月24日
【發(fā)明者】鄧昊, 諶于藍, 袁臘梅, 鄧晟, 徐洪波, 管李萍, 宋治, 張建國 申請人:中南大學湘雅三醫(yī)院, 深圳華大基因科技有限公司