桑樹核糖體蛋白S3a及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】桑樹核糖體蛋白S3a及其應(yīng)用，所述基因、蛋白的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述非生物脅迫為低溫、干旱或高鹽脅迫。所述植物為桑樹(Morus multicaulis)。本發(fā)明技術(shù)方案可以標(biāo)識植物是否處于鹽脅迫、干旱或抗病感病等生長環(huán)境。
【專利說明】桑樹核糖體蛋白S3a及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及到一種桑樹核糖體蛋白S3a及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長發(fā)育過程中，常常會受到諸多不良逆境如干旱、低溫、鹽漬等因素引起 的脫水脅迫的影響，會引起其體內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化變化。蛋白質(zhì)的合成途徑受 到抑制，同時產(chǎn)生許多新蛋白來應(yīng)對危機。
[0003] 核糖體蛋白是生物進化過程中一類高度保守的蛋白家族，其中在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) 的核糖體蛋白已經(jīng)有80多種，它們在蛋白質(zhì)的核糖體功能的發(fā)揮及生物合成方面起著關(guān) 鍵的作用。核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所，它是由4種核糖體RNA(rRNA)和70多種核糖體蛋 白質(zhì)組成的蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體。核糖體的生物活性是與細(xì)胞對蛋白質(zhì)合成的需求相互協(xié) 調(diào)作用的，細(xì)胞增生活躍時伴隨有核糖體的生物活性升高。核糖體蛋白S3a位于核糖體40S 亞基和60S亞基的接觸面上，是一個高度保守的蛋白質(zhì)，參與組成核糖體40S亞基，分子量 約為29.8kD。能夠和轉(zhuǎn)錄起始因子eIF-2，e IF-3，eEF-2、tRNA、18S RNA及mRNA等結(jié)合在 一起，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA復(fù)制等功能，影響核糖體翻譯功能的啟動，并特異性的 調(diào)控一些參與細(xì)胞生命活動的重要蛋白質(zhì)的合成，廣泛參與細(xì)胞的生長發(fā)育和分化。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S3a與細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡、機體免疫及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切 相關(guān)。孫阿萍等應(yīng)用GST基因融合蛋白系統(tǒng)制備了RPS3a及其多克隆抗體，通過Western Blot法檢測RPS3a在整個細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)情況，探究細(xì)胞凋亡的可能生化途徑和機 制，首先是用GST基因融合蛋白系統(tǒng)制備核糖體蛋白質(zhì)S3a。結(jié)果表明核糖體蛋白質(zhì)S3a位 于大小核糖體亞基的接觸面上，該部位是核糖體結(jié)合翻譯啟動因子eIF2,eIF3,Met-tRNA， Phe-tRNA和mRNA的位置；因此RPS3a水平的變化將影響到核糖體翻譯功能的啟動，也很可 能特異性地抑制了某些參與細(xì)胞生命活動的重要蛋白質(zhì)的合成，影響細(xì)胞的正常代謝，從 而引起細(xì)胞凋亡。因此，核糖體蛋白S3a蛋白質(zhì)水平的變化可能是細(xì)胞凋亡途徑中的一個 重要生化環(huán)節(jié)而發(fā)揮著重要的功能作用。
[0005] 目如，從_等的哺乳動物到低等的細(xì)菌等，已經(jīng)有很多物種的核糖體蛋白S3a基 因被成功克隆和分析，且核糖體蛋白S3a的一些核糖體外的功能也得到驗證。朱保健等以 野生絹絲昆蟲作蠶（Antheraeapernyi)為材料，克隆得到作蠶核糖體蛋白基因S3a的全序 列并進行表達(dá)模式分析，研究發(fā)現(xiàn)通過RT-PCR擴增克隆得到的柞蠶核糖體蛋白S3a基因編 碼的氨基酸序列和已克隆的鱗翅目昆蟲柳蠶的核糖體蛋白S3a基因編碼的蛋白序列擁有 高度的同源性。從構(gòu)建的柞蠶及其它10個物種的核糖體蛋白S3a蛋白的氨基酸序列進行 系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)鱗翅目昆蟲、雙翅目昆蟲和脊椎動物出現(xiàn)了明顯的分支，而不同物種 核糖體蛋白S3a蛋白的氨基酸在某些區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出高度的保守性。此外不同物種間的核糖 體蛋白S3a蛋白的末端氨基酸的數(shù)量和種類差別也很大，這種差異可不可以作為分析遺傳 進化的參考，由于樣本量的限制，還需要今后進一步的深入探討論證。RT-PCR結(jié)果顯示，柞 蠶核糖體蛋白S3a基因在所檢測的5齡幼蟲組織中呈現(xiàn)出組成性表達(dá)，這可能與其具有核 糖體外的生物學(xué)功能有關(guān)。
[0006] 近年來進一步的研究表明，核糖體蛋白除了在蛋白合成過程中起到重要作用，還 發(fā)現(xiàn)多種核糖體蛋白具有其獨特的核糖體外功能。但目前關(guān)于RPS3a核糖體外功能的研究 主要集中在其對腫瘤細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響等方面，迄今尚不清楚植物RPS3a基因 是否參與脅迫反應(yīng)。
[0007] 桑樹作為應(yīng)用于蠶桑產(chǎn)業(yè)一種重要的經(jīng)濟作物，是家蠶（Bombyxmori)的唯一飼 料來源。我們用已克隆得到的魯桑品種（Morusmulticaulis)育71-lMmRPS3a基因全長序 列。通過生物信息學(xué)分析其序列特征。同時，利用熒光定量PCR的方法檢測了MmRPS3a在 干旱、低溫、鹽脅迫以及抗病感病條件下的轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。通過對該基因的研究，使 我們從分子水平了解到桑樹核糖體蛋白S3a基因在不同脅迫條件下的表達(dá)情況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種桑樹核糖體蛋白S3a及其應(yīng)用，可以標(biāo)識植物 是否處于鹽脅迫、干旱或抗病感病等生長環(huán)境。
[0009] 技術(shù)方案：桑樹核糖體蛋白S3a，序列如SEQIDN0. 2所示。
[0010] 編碼桑樹核糖體蛋白S3a的基因，序列如SEQIDNO. 1所示。
[0011] 所述桑樹核糖體蛋白S3a作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0012] 所述編碼桑樹核糖體蛋白S3a的基因作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0013] 所述非生物脅迫為低溫、干旱或高鹽脅迫。
[0014] 所述植物為桑樹（Morusmulticaulis)。
[0015] 有益效果：核糖體蛋白是生物進化過程中一類高度保守的蛋白家族，其中在真核 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白已經(jīng)有80多種，它們在蛋白質(zhì)的核糖體功能的發(fā)揮及生物合成 方面起著關(guān)鍵的作用。核糖體蛋白S3a位于核糖體40S亞基和60S亞基的接觸面上，是一個 高度保守的蛋白質(zhì)，參與組成核糖體40S亞基。能夠和轉(zhuǎn)錄起始因子eIF-2，eIF-3，eEF-2、 tRNA、18SRNA及mRNA等結(jié)合在一起，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA復(fù)制等功能，影響核糖體 翻譯功能的啟動，并特異性的調(diào)控一些參與細(xì)胞生命活動的重要蛋白質(zhì)的合成，廣泛參與 細(xì)胞的生長發(fā)育和分化。本發(fā)明提供一種桑樹核糖體蛋白S3a作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo) 志物中的應(yīng)用，可以標(biāo)識植物是否處于鹽脅迫、干旱或抗病感病等生長環(huán)境。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為桑樹核糖體蛋白S3a基因的0RF擴增結(jié)果圖；M. 2000bpDNA分子標(biāo)記 1.RT-PCR產(chǎn)物；
[0017] 圖2為桑樹核糖體蛋白S3a基因的3' -RACE擴增結(jié)果圖；5'RACE擴增結(jié)果： M. 2000bpDNA分子標(biāo)記；1PCR擴增產(chǎn)物；
[0018] 圖3為桑樹RPS3a蛋白推導(dǎo)的氨基酸序列保守區(qū)預(yù)測圖；
[0019] 圖4為定量RT-PCR檢測MmRPS3a基因在鹽脅迫下桑苗嫩葉中的相對表達(dá)量圖； 1.對照，2.鹽處理12小時，3.鹽處理1天，4.鹽處理2天，5.鹽處理3天，6.鹽處理4天， 7.鹽處理5天；
[0020] 圖5為定量RT-PCR檢測MmRPS3a基因在抗病和感病桑苗嫩葉中的相對表達(dá)量圖； 1.遼育8號，2.遼育166號，3.沂水黃魯頭，4.大黑桑，5.武二，6.綠椹子，7.小紅點，8.吐 白1號，9.多果桑，10.中陽1號；
[0021] 圖6為定量RT-PCR檢測MmRPS3a基因在4°C低溫脅迫下桑苗嫩葉中的相對表達(dá)量 圖；1.對照，2. 4°C處理1天，3. 4°C處理2天，4. 4°C處理3天，5. 4°C處理4天，6. 4°C處理5 天，7. 4°C處理6天；
[0022] 圖7為定量RT-PCR檢測MmRPS3a基因在干旱脅迫下桑苗嫩葉中的相對表達(dá)量圖。 1.對照，2.干旱處理2天，3.干旱處理4天，4.干旱處理6天，5.干旱處理8天，6.干旱處 理10天。

【具體實施方式】
[0023] 實施例1桑樹核糖體蛋白S3a基因克隆
[0024] 供試桑樹品種為保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃的育 71-1。利用已獲得的包含桑樹核糖體蛋白S3a基因cDNA片段的ESTs序列，設(shè)計引物，并加 以驗證，引物序列如下：
[0025] RPS3a-F:5'-TCTCCAACCCAAACCCTAACCCTAG-3' ；
[0026] RPS3a-R:5'-CAACATCCTCTGAGTAGTCACCGTG-3'
[0027] 根據(jù)已克隆并驗證的基因中間片段結(jié)果，設(shè)計5'RACE擴增所需目的基因的下游 特異性引物，引物序列如下：
[0028] GSP1:5'-CTCCAACCCAAACCCTAACCCTAGC-3'
[0029] 根據(jù)已獲得的基因全長序列設(shè)計進行熒光定量分析的引物，引物序列如下：
[0030] qRPS3a_F:5'-CACTGCCTCCACCTCTCCAA-3'
[0031] qRPS3a_R:5'-CTTCCCTCCCTTCTTACCCTTC-3'
[0032] 根據(jù)NCBI上查找的在桑樹中穩(wěn)定表達(dá)的P-actin基因（GeneBank 登錄號：DQ785808)序列設(shè)計內(nèi)參基因的上下游引物，上游引物序列 3 -actin-F為 5'-AGCAACTGGGATGACATGGAGA-3' ，下游引物序列P-actin-R為 5,-CGACCACTGGCGTAAAGGGA-3,。
[0033] 桑樹核糖體蛋白S3a基因中間cDNA片段的克隆
[0034] 以合成的cDNA第1鏈為模板，利用上述設(shè)計的RPS3a-F和RPS3a-R為引物進行 RT-PCR擴增。PCR擴增程序為：94°C預(yù)變性 5min;94°C30s，56°C40s，72°Clmin，循環(huán) 35 次； 72°C延伸lOmin;保存4°C。取3yL的RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段的 大小，檢測目的片段大小與預(yù)測大小是否相符（圖1)。符合后取45yLRT-PCR產(chǎn)物用TAE 緩沖液制作的1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，采用TaKaRa公司AgaroseGelDNAPurification Kit試劑盒進行目的片段的膠回收和純化。目的片段用DNA連接酶與pMD?18-T載體連接。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coliT0P10菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布于在含有X-Gal、IPTG、Amp的 LB固體平板上。挑取單菌落白斑培養(yǎng)后送樣測序，測序結(jié)果blast分析并與EST原始序列 比對驗證。
[0035] 桑樹核糖體蛋白S3a基因全長的擴增
[0036] 根據(jù)已獲得的桑樹RPS3a基因的中間cDNA片段序列，經(jīng)同源比對發(fā)現(xiàn)其有完整的 5'端也沒有完整的3'端。根據(jù)所獲得的序列設(shè)計引物進行3'-RACE擴增。
[0037] 目的基因的完整3'端克隆以試劑盒通用引物3'外側(cè)引物為正向引物，PCR反應(yīng)體 系如下：51^10\8肚€61'，0.51^(1階13，11^〇0嫩模板，引物各1111，0.51^1 /^9酶，最后 用無菌雙蒸水補充體系到50iiL。PCR反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min;94°C40s，58°C40s， 72°Clmin，循環(huán) 40 次；72°C延伸lOmin;保存 4°C。
[0038] 檢測目的片段大?。▓D2)，膠回收擴增產(chǎn)物，將目的片段用DNA連接酶與 pMD?18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coliT0P10菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布于在含 有X-Gal、IPTG、Amp的LB固體平板上。挑取單菌落白斑培養(yǎng)后送樣，由生工生物工程（上 海）有限公司完成測序，測序結(jié)果進行blast分析，拼接獲得基因全長序列。
[0039] 桑樹MmRPS3a基因序列全長SEQIDNO. 1 :

【權(quán)利要求】
1. 桑樹核糖體蛋白S3a，其特征在于序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 編碼桑樹核糖體蛋白S3a的基因，其特征在于序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 權(quán)利要求1所述桑樹核糖體蛋白S3a作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求2所述編碼桑樹核糖體蛋白S3a的基因作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中 的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述桑樹核糖體蛋白S3a作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中的應(yīng) 用，其特征在于所述非生物脅迫為低溫、干旱或高鹽脅迫。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述桑樹核糖體蛋白S3a作為植物非生物脅迫表達(dá)標(biāo)志物中的應(yīng) 用，其特征在于所述植物為桑樹（Morus multicaulis)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104387462SQ201410683342
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】趙衛(wèi)國, 周宏 , 王恒, 李鳳, 錢姣, 方榮俊 申請人:江蘇科技大學(xué)