一種改良提取特色蔬菜嫩葉總rna方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種改良提取特色蔬菜嫩葉總RNA方法。該方法是把高壓滅菌冷卻后的研缽、研磨棒及目的特色蔬菜嫩葉一同放入-80℃冰箱4h以上，后取出快速研磨約10s,再用移液槍吸取適量Trizol至研缽內(nèi)，繼續(xù)研磨混合膠狀物至完全溶解，再用移液槍吸至1.5ml離心管中，后洗滌、沉淀及DEPCH2O溶解，即獲得目的特色蔬菜葉片總RNA。本方法解決了傳統(tǒng)的Trizol法提取植物組織葉片總RNA時，用藥匙把液氮磨碎的植物組織葉片轉(zhuǎn)入Trizol過程中，容易引起RNA降解（空氣中放置時間過長），或裝有Trizol混合物的離心管爆破（液氮未完全揮發(fā)掉），同時該方法無需準備液氮且不損失磨碎的特色蔬菜嫩葉粉末。
【專利說明】一種改良提取特色蔬菜嫩葉總RNA方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種改良提取特色蔬菜嫩葉總RNA方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展。基于RNA功能分析已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，因此高質(zhì)量總RNA提取對于功能基因分子生物學(xué)研究顯得十分重要。目前植物材料中總RNA提取有異硫氰酸胍法、苯酚法、SDS法、氯化鋰沉淀法、CTAB法及商品化的Trizol試劑盒法等多種方法。而目前總RNA運用Trizol提取法較為普遍,然而傳統(tǒng)Trizol法(包括其他方法)提取植物葉片總RNA時，前期均需用液氮研磨目的植物組織材料，然后再用藥匙把磨碎的植物組織轉(zhuǎn)移到Trizol提取液中。而植物材料總RNA不夠穩(wěn)定，在試驗過程中，研磨破碎細胞在轉(zhuǎn)入目的提取液過程中操作時間過長，其內(nèi)源及外源RNase都會造成目的RNA的酶解，而如果液氮研磨目的植物組織材料在液氮未完全揮發(fā)即裝入Trizol提取液，在混勻過程中由于受熱不均容易造成爆管，從而造成人體傷害。
[0003]本發(fā)明通過改進Trizol法提取步驟，改進后的方法可以高效快速從紫背天葵、黃秋葵等嫩葉中提取高質(zhì)量的總RNA，解決RNA不穩(wěn)定、易降解，提取的RNA質(zhì)量不好等問題。該方法提取的目的RNA完全滿足反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、Northern雜交及cDNA文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)的研究需要，為部分特色蔬菜分子生物學(xué)研究提供方法借鑒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決傳統(tǒng)的Trizol法提取紫背天葵及黃秋葵等特色蔬菜嫩葉總RNA過程中發(fā)生降解、爆管以及需要準備液氮和浪費較多嫩葉材料。本發(fā)明提供了一種改良提取特色蔬菜嫩葉總RNA方法，該方法簡便、適用性強，為獲得理想的目的基因組總RNA打下堅實基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明提供一種改良的Trizol法提取特色蔬菜嫩葉總RNA，具體包括:
(1)采取0.1-0.6g特色蔬菜嫩葉，超純水洗凈甩干后，放入高壓滅菌冷卻后的研缽內(nèi)，連同研磨棒一起放入-8011C冰箱4-6h ；
(2)帶上紗手套從冰箱內(nèi)取出裝有特色蔬菜嫩葉的研缽，用研磨棒快速研磨嫩葉10-12s,再用移液槍吸取適量Trizol至研缽內(nèi)(嫩葉質(zhì)量單位g與Trizol體積單位ml比為:0.1:1)，繼續(xù)研磨膠狀物至完全溶解；
(3)用移液槍從研缽內(nèi)吸取溶有目的RNA的Trizol混合物至1.5ml離心管內(nèi)，每管裝Iml左右，室溫靜置2min ；
(4)每管加入0.2ml氯仿，振蕩混勻后靜置2min，4°C 12000g離心lOmin，取上清；
(5)加入0.5ml冰冷的異丙醇，輕輕混勻，靜置lOmin, 4°C 12000g離心lOmin，棄上清；
(6)加入ImlDEPC H2O處理的75%乙醇，洗滌沉淀，4°C，8000g離心5min，棄上清，超凈臺晾干后加入適量的DEPC H2O溶解。
[0006]步驟(2)中特色蔬菜嫩葉質(zhì)量(單位g)與Trizol體積(單位ml)比為:0.1:1.該方法是把高壓滅菌冷卻后的研缽、研磨棒及目的特色蔬菜嫩葉一同放入_80°C冰箱
4h以上,后取出快速研磨約1s,再用移液槍吸取適量Trizol至研缽內(nèi)，繼續(xù)研磨特色蔬菜嫩葉膠狀物至完全溶解，再用移液槍吸至1.5ml離心管中，后經(jīng)過洗滌、沉淀及DEPC H2O溶解，即獲得目的特色蔬菜嫩葉總RNA。本方法解決了傳統(tǒng)的Trizol法提取植物組織葉片總RNA時，用藥匙把液氮磨碎的植物組織葉片轉(zhuǎn)入Trizol過程中，容易引起RNA降解(空氣中放置時間過長)，或裝有Trizol混合物的離心管爆破(液氮未完全揮發(fā)掉)，同時該方法無需準備液氮且不損失磨碎的特色蔬菜嫩葉粉末。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1各樣品提取RNA電泳圖，其中M為Maker，l為紫背天葵嫩葉、2為黃秋葵嫩葉、3為白子菜嫩葉及4為苦瓜嫩葉，28S，18S及5S代表28S RNAU8S RNA、5S RNA條帶。
[0008]【具體實施方式】實施例1
(1)采取0.1g特色蔬菜嫩葉，超純水洗凈甩干后，放入高壓滅菌冷卻后的研缽內(nèi)，連同研磨棒一起放入-80°C冰箱4h ；
(2)帶上紗手套從冰箱內(nèi)取出裝有特色蔬菜嫩葉的研缽，用研磨棒快速研磨嫩葉10s，再用移液槍吸取ImlTrizol至研缽內(nèi)，繼續(xù)研磨膠狀物至完全溶解；
(3)用移液槍從研缽內(nèi)各吸取0.5ml溶有目的RNA的Trizol混合物至2個1.5ml離心管內(nèi)，室溫靜置2min ；
(4)每管加入0.2ml氯仿，振蕩混勻后靜置2min，4°C 12000g離心lOmin，取上清；
(5)加入0.5ml冰冷的異丙醇，輕輕混勻，靜置lOmin, 4°C 12000g離心lOmin，棄上清；
(6)加入ImlDEPC H2O處理的75%乙醇，洗滌沉淀，4°C，8000g離心5min，棄上清，超凈臺晾干后每管加入50ulDEPC H2O溶解。此方法提取的少量RNA可進一步用于反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR等反應(yīng)。
[0009]實施例2
(1)采取0.3g特色蔬菜嫩葉，超純水洗凈甩干后，放入高壓滅菌冷卻后的研缽內(nèi)，連同研磨棒一起放入-80°C冰箱5h ；
(2)帶上紗手套從冰箱內(nèi)取出裝有特色蔬菜嫩葉的研缽，用研磨棒快速研磨嫩葉12s，再用移液槍吸取3mlTrizol至研缽內(nèi)，繼續(xù)研磨膠狀物至完全溶解；
(3)用移液槍從研缽內(nèi)各吸取Iml溶有目的RNA的Trizol混合物至3個1.5ml離心管內(nèi)，室溫靜置2min ；
(4)每管加入0.2ml氯仿，振蕩混勻后靜置2min，4°C 12000g離心lOmin，取上清；
(5)加入0.5ml冰冷的異丙醇，輕輕混勻，靜置lOmin, 4°C 12000g離心lOmin，棄上清；
(6)加入ImlDEPC H2O處理的75%乙醇，洗滌沉淀，4°C，8000g離心5min，棄上清，超凈臺晾干后每管加入lOOulDEPC H2O溶解。此方法提取的中量RNA可進一步用于Northern雜交等反應(yīng)。
[0010]實施例3
(I)采取0.6g特色蔬菜嫩葉，超純水洗凈甩干后，放入高壓滅菌冷卻后的研缽內(nèi)，連同研磨棒一起放入-80°C冰箱6h ；
(2)帶上紗手套從冰箱內(nèi)取出裝有特色蔬菜嫩葉的研缽，用研磨棒快速研磨嫩葉15s，再用移液槍吸取6mlTrizol至研缽內(nèi)，繼續(xù)研磨膠狀物至完全溶解；
(3)用移液槍從研缽內(nèi)各吸取Iml溶有目的RNA的Trizol混合物至6個1.5ml離心管內(nèi)，，室溫靜置2min ；
(4)每管加入0.2ml氯仿，振蕩混勻后靜置2min，4°C 12000g離心lOmin，取上清；
(5)加入0.5ml冰冷的異丙醇，輕輕混勻，靜置lOmin, 4°C 12000g離心lOmin，棄上清；
(6)加入ImlDEPC H2O處理的75%乙醇，洗滌沉淀，4°C，8000g離心5min，棄上清，超凈臺晾干后每管加入lOOulDEPC H2O溶解。此方法提取的較大量RNA可進一步用于cDNA文庫構(gòu)建等反應(yīng)。
[0011]實施例4
通過上述方法，各采取0.2g紫背天葵、黃秋葵、白子菜及苦瓜嫩葉，進行其RNA提取，所獲RNA各取Iul，用1%瓊脂糖，200V電泳12 min,于溴化乙錠中染色2min，用凝膠成像儀照相檢測(見圖1 )，結(jié)果獲得較好質(zhì)量和較高的得率，所提的RNA樣品都非常完整，28S，18S及5S RNA均清晰可見，且電泳帶亮度也反映出獲得RNA具有較高濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種改良提取特色蔬菜嫩葉總RNA方法，其特征在于:該方法是把高壓滅菌冷卻后的研缽、研磨棒及目的特色蔬菜嫩葉一同放入_80°C冰箱4-6h，后取出快速研磨，再用移液槍吸取適量Trizol至研缽內(nèi)，繼續(xù)研磨特色蔬菜嫩葉膠狀物至完全溶解，再用移液槍吸至1.5ml離心管中，后經(jīng)過洗滌、沉淀及DEPC H2O溶解，即獲得目的特色蔬菜嫩葉總RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良提取特色蔬菜嫩葉總RNA方法，其特征在于:所述方法具體步驟為:(I)采取0.1-0.6g特色蔬菜嫩葉，超純水洗凈甩干后，放入高壓滅菌冷卻后的研缽內(nèi)，連同研磨棒一起放入_80°C冰箱4-6h ； (2)帶上紗手套從冰箱內(nèi)取出裝有特色蔬菜嫩葉的研缽，用研磨棒快速研磨嫩葉10-12s,再用移液槍吸取適量Trizol至研缽內(nèi)繼續(xù)研磨膠狀物至完全溶解； (3)用移液槍從研缽內(nèi)吸取溶有目的RNA的Trizol混合物至1.5ml離心管內(nèi)，每管裝Iml,室溫靜置2min ； (4)每管加入0.2ml氯仿，振蕩混勻后靜置2min，4°C12000g離心lOmin，取上清； (5)加入0.5ml冰冷的異丙醇，輕輕混勻，靜置lOmin, 4°C 12000g離心lOmin，棄上清； (6)加入ImlDEPC H2O處理的75%乙醇，洗滌沉淀，4°C，8000g離心5min，棄上清，超凈臺晾干后加入0.1 ml 1%的DEPC H2O溶解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良提取特色蔬菜嫩葉總RNA方法，其特征在于:步驟(2)中特色蔬菜嫩葉質(zhì)量(單位g)與Trizol體積(單位ml)比為:0.1:1。
【文檔編號】C12N15/10GK104371997SQ201410683649
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】張少平, 邱珊蓮, 鄭開斌, 劉榮章, 林碧珍 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所